Name: whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

Финансирование из гранта NIH 8P20GM103436 14.

Процедуры работы с разведением зебры взрослых и эмбрионов, описанные в этом протоколе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию при Университете штата Мюррей.
1. Коллекция и фиксация эмбрионов
<ol><li>Подготовка нереста танки, помест...

<ol>
	<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR/Cas9+system.">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li><li>van der Ploeg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+nucleic+acid+research+during+the+twentieth+century.">Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century.</a> European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).</li><li>Marrack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+Antibodies.">Nature of Antibodies.</a> Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lopez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+in+situ+Hybridization/Immunohistochemistry+(ISH/IH)+on+Free-floating+Vibratome+Tissue+Sections.">Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections.</a> Bio-protocol. 4 (18), (2014).</li><li>Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glucocorticoid+receptor+immunoreactivity+and+mRNA+in+the+rat+brain:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).</li><li>Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+combined+immunohistochemistry+and+in-situ+hybridization+in+fresh-frozen,+cryocut+mouse+brain+sections.">A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines.">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376 (2014).</li><li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glis3+is+associated+with+primary+cilia+and+Wwtr1/TAZ+and+implicated+in+polycystic+kidney+disease.">Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).</li><li>Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+and+colocalization+of+somatostatin,+carboxypeptidase-E+and+prohormone+convertases+1+and+2+in+rat+brain.">Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain.</a> Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+preparation+for+observation+and+analysis+of+zebrafish+embryo+specimens+stained+by+whole+mount+in+situ+hybridization.">Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+and+calcium+signalling+regulates+muscle+fibre+formation+in+the+zebrafish+embryo.">Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo.</a> Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).</li><li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+muscle+acetylcholine+receptors+requires+motoneurons+in+live+embryos,+but+not+in+cell+culture.">Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).</li><li>Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotransmitter-receptor+matching+at+the+neuromuscular+junction.">Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).</li><li>Brunelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+reinnervation+through+peripheral+nerve+graft+dictates+assembly+of+glutamatergic+synapses+at+rat+skeletal+muscle.">Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).</li><li>Hans, F., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+phosphorylation+and+cell+division.">Histone H3 phosphorylation and cell division.</a> Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).</li><li>Yee, N. S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research.">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li><li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease.">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li><li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders:+A+critical+review.">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo.">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991 (2011).</li><li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos.">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).</li></ol>

Иммуногистохимия является универсальным инструментом, который может быть использован для характеристики пространственно-временного выражения практически любого белка, интересующегося организмом. Иммуногистохимия используется на самых разнообразных тканях и модельных организмах....

Зебрафиш(Danio rerio) стала мощной моделью для изучения биологических процессов по нескольким причинам, включая короткое время генерации, быстрое развитие и удобство генетических методов. В результате, зебрафиш обычно используются в высокой пропускной связи малых молекул экранов для токсикологических исследований и открытия наркотиков. Зебрафиш также является привлекательной моделью для изучения процессов развития, учитывая, что одна женщина может регулярно производить 50-300 яиц за один раз, а оптически прозрачные эмбрионы развиваются внешне, что позволяет эффективно визуализировать процессы развития. Тем не менее, ранние исследования опирались главным образом на передние генетические экраны с использованием N-этил-N-нитросуреа (ENU) или других мутагенов из-за проблем в создании обратных генетических методов. Примерно два десятилетия назад, морфолинос были впервые использованы в зебрафиш для нокдауна целевых генов1. Morpholinos являются небольшие антисмысловые олигонуклеотиды, которые препятствуют переводу целевой мРНК после микроинъекции в эмбрион на ранней стадии развития. Основным недостатком морфинос является то, что они разбавляются по мере деления клеток и, как правило, теряют эффективность на 72 часа после оплодотворения (hpf). В то время как морфолиносы остаются мощным инструментом для нарушения гена зебры, транскрипционный активатор- эффектоподобный эффект (TALENs), нуклизы цинка-пальца (ЗФН) и кластерные регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы (CRISPRs) в последнее время используются для непосредственной цели генома зебры2,3. Эти обратные генетические стратегии, в сочетании с вперед генетики и высокой пропускной технологии экраны, создали зебры в качестве мощной модели для изучения экспрессии генов и функции.
Способность изучать функцию генов обычно требует оценки пространственно-временного распределения экспрессии генов или генных продуктов. Два наиболее часто используемых методов визуализации таких моделей выражения в начале разработки на месте гибридизации (ISH) и целом горе иммуногистохимии (IHC). На месте гибридизация была впервые разработана в 1969 году и опирается на использование помеченных антисмысловых зондов РНК для обнаружения экспрессии мРНК в организме4. В отличие от этого, помеченные антитела используются в иммуногистохимии для визуализации экспрессии белка. Идея маркировки белков для обнаружения восходит к5 1930-х годов и первый эксперимент IHC был опубликован в 1941 году, когда FITC помечены антитела были использованы для обнаружения патогенных бактерий в инфицированных тканях6. ISH и IHC значительно эволюционировали и значительно улучшились в течение последующих десятилетий и в настоящее время оба регулярно используются в молекулярно-диагностической исследовательской лаборатории7,8,9,10,11. Хотя оба метода имеют преимущества и недостатки, IHC предлагает ряд преимуществ по сравнению с ISH. Практически, IHC гораздо меньше времени, чем ISH и, как правило, дешевле в зависимости от стоимости первичного антитела. Кроме того, выражение мРНК не всегда является надежным показателем экспрессии белка, как было продемонстрировано у мышей и людей, что только около трети вариации изобилия белка можно объяснить изобилием мРНК12. По этой причине, IHC является важным дополнением для подтверждения данных ISH, когда это возможно. Наконец, IHC может предоставить данные субклеточной и совместной локализации, которые не могут быть определены ISH13,14,15. Здесь мы описываем пошаговый метод надежного обнаружения белков иммуногистохимией в целых эмбрионах зебры и личинках. Целью данной методики является определение пространственного и временного выражения белка, интересуемого во всем эмбрионе. Эта технология использует антиген-специфические первичные антитела и флуоресцентно помеченные вторичные антитела. Протокол легко адаптируется к использованию на слайд-установленных секциях тканей и для использования с хромогенными субстратами вместо флуоресценции. Используя этот протокол, мы демонстрируем, что развитие скелетных мышц зебры выражает ионотропные рецепторы глутамата, в дополнение к рецепторам ацетилхолина. NMDA-типа глутаматных рецепторов субъединиц обнаруживаются на продольной мышцы на 23 л.с.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil, heavy duty</td>
			<td>Kirkland</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDA antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>05-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABN832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Sally Hanson</td>
			<td></td>
			<td>Any nail polish or hardener may be subsituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression (concavity) slide</td>
			<td>Electron Miscroscopy Sciences</td>
			<td>71878-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1855920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, Danieau, 30%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, E2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating tube holder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>59744015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence compound microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>M165-FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 18 x 18</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22 x 60</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-050-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber with lid</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunedge pap pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins, size 00</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>5213323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4 &#183; 7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh strainer</td>
			<td>Oneida</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-tube cap lock</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>145062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Toastmaster</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S02L1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBTriton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (glass)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (plastic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>207250250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 1x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x made from 10x stock diluted in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spawning tank with lid and insert</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBlock PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost + slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue gel</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultrapure/double distilled</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W2-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae

Иммуногистохимия является широко используемым методом для изучения экспрессии белка и локализации в нормальных состояниях развития и болезни. Хотя многие протоколы иммуногистохимии были оптимизированы для тканей и тканей млекопитающих, эти протоколы часто требуют модификации и оптимизации для немлекопитающих модельных организмов. Зебрафиш все чаще используется в качестве модели системы в основных, биомедицинских и трансляционных исследованиях для исследования молекулярных, генетических и клеточных биологических механизмов процессов развития. Зебрафиш предлагает много преимуществ в качестве модели системы, но и требуют модифицированных методов для оптимального обнаружения белка. Здесь мы предоставляем наш протокол для всемонтированной флуоресценции иммуногистохимии в эмбрионах зебры и личинок. Этот протокол дополнительно описывает несколько различных стратегий монтажа, которые могут быть использованы и обзор преимуществ и недостатков каждой стратегии обеспечивает. Мы также описываем изменения в этом протоколе, чтобы позволить обнаружение хромогенных субстратов в целой ткани крепления и обнаружение флуоресценции в секционированных личитульных тканях. Этот протокол в целом применим к изучению многих стадий развития и эмбриональных структур.

Целая гора иммуногистохимии использует антитела для обнаружения пространственной картины экспрессии белка в нетронутом животном. Основной рабочий процесс иммуногистохимии (изображенный на рисунке 1)включает в себя разведение зебры, выращивание и пр...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Здесь мы представляем протокол для флуоресцентного антитела-опосредованного обнаружения белков в целых препаратах эмбрионов зебры и личинок.

Целая гора иммуногистохимия в зебрафиш эмбрионов и ларьков

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Целая монтированная иммуногистохимия является относительно быстрым и простым методом, который позволяет осуществлять пространственное и временное наблюдение белков непосредственно в тканях или организме с использованием помеченных антител. Полезность этого метода заключается в том, что он позволяет окрашивание нетронутой ткани или организма без необходимости первого раздела его и конфокальная микроскопия может быть использована для создания трехмерного представления шаблона экспрессии белка. Иммуногистохимия широко используется в биомедицинских исследованиях для понимания этиологии и молекулярных механизмов, которые лежат в основе болезни.Это также ценный диагностический инструмент для выявления опухолей в патологических образцах. Для начала подготовьте нерестовые резервуары, наполненные системной водой и с помощью сетки или прорези лайнера на месте. Поместите взрослых зебрафиш смешанных половых пар в группах в танках на ночь.Используйте 14-часовой/10-часовой световой/темный цикл с включенными огнями в 9 часов .m. На следующее утро, с включенным светом, изменить нереста цистерны воды с пресной системой воды для удаления кала. После того, как яйца откладываются, вернуть взрослых домой танки.Соберите яйца, рисуя их с помощью передачи пипетки. Перенесите 50 яиц в каждую чашку Петри, заполненную на полпути со средой эмбриона. Удалите любые непрозрачные и мутные яйца, которые мертвы или не смогли разделить.Инкубировать блюдо из яиц при 28,5 градусов по Цельсию до 23 часов после оплодотворения. Если эмбрионы старше 24 часов после оплодотворения, с пипеткой передачи эмбрионов 200 микромоляных ПТУ в среде эмбриона для предотвращения меланогенеза. Под стерео микроскопом, dechorionate unhatched эмбрионов с помощью ультра тонкой типсов отзыв.Используя полированные огнем пипетки Pasteur, чтобы свести к минимуму повреждения, перенесите их в стеклянные или пластиковые чашки Петри, покрытые 1-2%agarose растворяется в среде эмбриона. Затем перенесите эмбрионы в 1,5 миллилитровые центрифуги с помощью пластиковой или огнеполированной пипетки. Удалить эмбриона среды с помощью микропипетта.Оставьте только достаточно жидкости, чтобы просто покрыть эмбрионы. Исправить эмбрионы в 4%PFA в течение одного-двух часов с нежным качания при комнатной температуре. Затем мыть эмбрионы три раза в 1X PBS и 1%PBTriton в течение пяти минут.Используйте эмбрионы немедленно или хранить при четырех градусах по Цельсию в течение одной недели. Для длительного хранения обезвоживают и хранят эмбрионы в 100% метаноле при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Для регидратации эмбрионов, выполнять серийные инкубации пять минут каждый при комнатной температуре с уменьшением количества метанола и PBS и PBTriton для окончательного мытья.Продолжить подготовку эмбриона в соответствии с рукописью. Выберите блокирующий раствор, соответствующий вторичным видам антител, например, сыворотке 10%goat в PBTriton с или без двух миллиграммов на миллилитр BSA. Добавьте 0,5 миллилитров блокирующего раствора в трубку, содержащую эмбрион, и поместите трубку на рокер в течение одного-трех часов при комнатной температуре.Затем инкубировать эмбрион в первичных антител, разбавленных в блокирующий раствор и PBTriton ночь на четыре градуса по Цельсию во время качания. Утром мыть эмбрион пять раз в PBTriton в течение 10 минут каждый при комнатной температуре во время качания. Затем выберите вторичное антитело на основе вида-хозяина первичного антитела и желаемой длины волны на 488 нанометров.Добавьте вторичное антитело, разбавленное блокирующим раствором, в трубку, содержащую эмбрион. Обложка трубки с алюминиевой фольгой и инкубировать в течение двух часов при комнатной температуре во время качания. После этого, мыть эмбрионы три раза в PBTriton в течение 10 минут каждый при комнатной температуре в то время как покрыты алюминиевой фольгой и качания.С пипеткой, перенести эмбрионы на 50% глицерол раствор в PBS над кроватью 2%agarose в эмбрионе среды. Чтобы удалить желток, перенесите 200 микролитров 1X PBS на слайд депрессии или простой стеклянный слайд. Используйте пластиковую трубу для переноса одного или нескольких эмбрионов в капельу PBS.Используйте ультра тонкие миппы и двойные нулевые булавки насекомых, чтобы разбить желток и очень осторожно соскребать гранулы желтка с брюшной поверхности эмбриона. Удалите желток гранулы и пополнить PBS по мере необходимости. После монтажа поместите образец на сцену микроскопа.Найдите область интереса, выбрав относительно яркий пример. Отрегулируйте экспозицию камеры и на получите так, чтобы сигнал был достаточно ярким без насыщения. Сравнивая экспериментальные эмбрионы с маркировкой антител и контроль над эмбрионами антител, используйте те же настройки экспозиции.Этот протокол целой монтировать иммуногистохимии является ценным инструментом для изучения пространственной и височной экспрессии белка с использованием развития зебры. Подразделение GluN1 глутаматного рецептора типа NMDA выявило экспрессию подразделений рецепторов глутамата на протяжении всего развития мышц зебры в течение 23 часов после оплодотворения. Замороженные участки 72-часовых эмбрионов после оплодотворения были установлены на слайдах и иммунотелены для фосфо-H3, маркера размножающихся клеток.Несколько клеток выразили фосфо-H3 и выражение было наиболее заметным в желудочковых зонах. Мышь IgG контроля антител и за исключением первичных антител показали низкий уровень неспецифического выражения. Важно выбрать соответствующие блокирующие решения и вторичные антитела на основе первичных антител принимающих видов, чтобы обеспечить обнаружение и свести к минимуму неспецифическое окрашивание.Иммуногистохимия должна быть проверена, чтобы убедиться, что сигнал наблюдается на самом деле белок интереса. Последующие эксперименты обычно включают использование генетически или экологически модифицированных организмов. Иммуногистохимия предоставляет исследователям возможность наблюдать белки на месте, значительно ускоряя наше понимание многочисленных систем как в основной, так и прикладной биологии, особенно во время развития эмбриона.Метанол и формальдегид токсичны и должны быть обработаны тщательно. Отходы должны собираться и утилизироваться в соответствии с институциональными процедурами.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Мульти-целевой Хромогенный Всего монтажа<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация для сравнения экспрессии генов доменов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Методы Изучить лимфа железой и гемоцитах в<em&gt; Drosophila</em&gt; личинки

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Мембранный потенциал монокристалла монокристалла в живых эмбрионах данио

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Визуализация Multiciliated клетки в Zebrafish через комбинированные протокола вся гора флуоресцентные в Situ Гибридизация и иммунофлуоресценции

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Слойный монтаж Метод для расширенного времени Lapse Конфокальная микроскопия целых эмбрионов зебрафиш

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Целая гора В Ситу Гибридизация в зебрафиш эмбрионов и трубоусветки Ассав в iPSC-ECs для изучения роли эндоглин в сосудистом развитии

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Визуализация и анализ фарингиальных архиерейных артерий с использованием иммуногистохимии и 3D-реконструкции

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...