Name: whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

NIH hibe 8P20GM103436 14 fon.

Bu protokolde tanımlanan zebra balığı yetiştiriciliği yetişkinler ilahı ve embriyolarla çalışma prosedürleri Murray State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Embriyo Toplama ve Fiksasyon
<ol><li>Yetişkin zebra balığı karışık seks çiftleri veya grupları bir gecede sistem suyu yla dolu bir örgü veya oluklu astarile tanklara yerleştirerek yumurtlama tanklarını hazırlayın.</li>
	<li>Işıklar açıkken, dışkı ...

<ol>
	<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+targeted+gene+'knockdown'+in+zebrafish.">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR/Cas9+system.">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li><li>van der Ploeg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+nucleic+acid+research+during+the+twentieth+century.">Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century.</a> European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).</li><li>Marrack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nature+of+Antibodies.">Nature of Antibodies.</a> Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).</li><li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group.">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li><li>Lopez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+in+situ+Hybridization/Immunohistochemistry+(ISH/IH)+on+Free-floating+Vibratome+Tissue+Sections.">Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections.</a> Bio-protocol. 4 (18), (2014).</li><li>Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+glucocorticoid+receptor+immunoreactivity+and+mRNA+in+the+rat+brain:+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study.">Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).</li><li>Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+combined+immunohistochemistry+and+in-situ+hybridization+in+fresh-frozen,+cryocut+mouse+brain+sections.">A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 105-111 (2014).</li><li>Corthell, J. T., Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 91-103 (2014).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines.">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376 (2014).</li><li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glis3+is+associated+with+primary+cilia+and+Wwtr1/TAZ+and+implicated+in+polycystic+kidney+disease.">Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).</li><li>Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+expression+and+colocalization+of+somatostatin,+carboxypeptidase-E+and+prohormone+convertases+1+and+2+in+rat+brain.">Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain.</a> Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2000).</li><li>N&#252;sslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flat+mount+preparation+for+observation+and+analysis+of+zebrafish+embryo+specimens+stained+by+whole+mount+in+situ+hybridization.">Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li><li>Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylcholine+and+calcium+signalling+regulates+muscle+fibre+formation+in+the+zebrafish+embryo.">Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo.</a> Journal of Cell Science. 118 (22), 5181 (2005).</li><li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+of+muscle+acetylcholine+receptors+requires+motoneurons+in+live+embryos,+but+not+in+cell+culture.">Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859 (1992).</li><li>Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+neurotransmitter-receptor+matching+at+the+neuromuscular+junction.">Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).</li><li>Brunelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamatergic+reinnervation+through+peripheral+nerve+graft+dictates+assembly+of+glutamatergic+synapses+at+rat+skeletal+muscle.">Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).</li><li>Hans, F., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H3+phosphorylation+and+cell+division.">Histone H3 phosphorylation and cell division.</a> Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).</li><li>Yee, N. S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research.">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li><li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease.">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li><li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders:+A+critical+review.">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li><li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy.">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li><li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish.">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li><li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo.">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li><li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling.">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991 (2011).</li><li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos.">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713 (2011).</li></ol>

İmmünohistokimya bir organizmada ilgi hemen hemen herhangi bir protein in spatio-temporal ifade karakterize etmek için kullanılabilecek çok yönlü bir araçtır. İmmünohistokimya dokular ve model organizmaların geniş bir yelpazede kullanılır. Bu protokol zebra balıklarında kullanılmak üzere optimize edilmiştir. Farklı türlerde immünohistokimya farklı fiksasyon ve işleme teknikleri, türlere ve endojen peroksidazların varlığına bağlı olarak çözümler engelleme ve dokuların kalınlığı ve b...

Zebra balığı(Danio rerio)kısa nesil zaman, hızlı gelişme ve genetik teknikler için amenability dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle biyolojik süreçlerin çalışması için güçlü bir model olarak ortaya çıkmıştır. Sonuç olarak, zebra balıkları genellikle toksikolojik araştırma ve ilaç keşif için yüksek iş ölçekli küçük molekül ekranlarda kullanılır. Zebra balığı aynı zamanda tek bir dişinin rutin olarak bir seferde 50-300 yumurta üretebildiği ve optik olarak berrak embriyoların gelişim süreçlerinin verimli bir şekilde görüntülenmesi için dışarıdan geliştiği göz önüne alındığında gelişimsel süreçlerin incelenmesi için de cazip bir modeldir. Ancak, erken araştırma n-etil-N-nitrozourea (ENU) veya diğer mutajenler ters genetik teknikler kurulmasında zorluklar nedeniyle kullanarak ileri genetik ekranlar çoğunlukla dayanıyordu. Kabaca yirmi yıl önce, morpholinos ilk zebra balığı nda hedeflenen genleri yıkmak için kullanılmıştır1. Morfolinonos erken gelişim aşamasında bir embriyo içine mikroenjeksiyon aşağıdaki hedef mRNA çeviri inhibe küçük antisense oligonükleotidler vardır. Morfolinoların en büyük zaafı, hücrelerin bölünmesiyle seyreltilmeleri ve genellikle döllenme sonrası (hpf) 72 saat etkisini kaybetmeleridir. Morpholos zebrabalığı gen bozulması için güçlü bir araç olmaya devam ederken, transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALENs), çinko-parmak nükleazlar (ZFNs), ve düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) daha yakın zamanda doğrudan zebra balığıgenomu2,3hedef için kullanılmaktadır . Bu ters genetik stratejiler, ileri genetik ve yüksek iş elde ekranları ile birlikte, gen ekspresyonu ve fonksiyonu çalışma güçlü bir model olarak zebra balığı kurduk.
Gen fonksiyonunu inceleme yeteneği genellikle gen veya gen ürün ekspresyonunun spatio-temporal dağılımının değerlendirilmesi gerektirir. Erken gelişim sırasında bu tür ifade kalıplarını görselleştirmek için en sık kullanılan iki teknik yerinde hibridizasyon (ISH) ve tüm immünohistokimya (IHC) bulunmaktadır. In situ hibridizasyon ilk olarak 1969 yılında geliştirilmiştir ve birorganizmadamRNA ifadesini tespit etmek için etiketli antisense RNA problarının kullanımına dayanır 4 . Buna karşılık, etiketli antikorlar protein ekspresyonunu görselleştirmek için immünohistokimyada kullanılır. Algılama için proteinlerin etiketleme fikri 1930'ların5'ine kadar uzanır ve ilk IHC deneyi 1941'de FITC etiketli antikorların enfekte dokularda patojenik bakterileri tespit etmek için kullanıldığında yayınlanmıştır6. ISH ve IHC gelişti ve sonraki yıllarda önemli ölçüde geliştirilmiş ve şimdi her ikisi de rutin moleküler ve tanısal araştırma laboratuvarı7,8,9,10,11kullanılır . Her iki tekniğin de avantajları ve dezavantajları olsa da, IHC ISH üzerinde çeşitli avantajlar sunar. Pratik olarak, IHC ISH çok daha az zaman alıcı ve birincil antikor maliyetine bağlı olarak genellikle daha az pahalıdır. Buna ek olarak, mRNA ekspresyonu her zaman güvenilir bir protein ekspresyonu metomu değildir, çünkü farelerde ve insanlarda protein bolluğu varyasyonunun sadece üçte birinin mRNA bolluğu ile açıklanabileceği gösterilmiştir12. Bu nedenle, IHC ish verilerini onaylamak için önemli bir ektir, mümkün olduğunda. Son olarak, IHC ISH 13,14,15tarafından belirlenemeyen hücre altı ve eş yerelleştirme verileri sağlayabilir. Burada, zebra balığı embriyoları ve larvaları halinde immünohistokimya ile proteinleri güvenilir bir şekilde tespit etmek için adım adım bir yöntem tanımlıyoruz. Bu tekniğin amacı tüm embriyo ilgi bir proteinin mekansal ve zamansal ekspresyonu belirlemektir. Bu teknoloji antijene özgü primer antikorlar ve floresan etiketli ikincil antikorlar kullanır. Protokol, slayta monte edilmiş doku bölümlerinde ve floresan yerine kromojenik yüzeylerle kullanıma hazır dır. Bu protokolü kullanarak, biz zebra balığı iskelet kası gelişmekte olduğunu göstermek iyonotropik glutamat reseptörleri ifade eder, asetilkolin reseptörlerine ek olarak. NMDA tipi glutamat reseptör alt birimleri 23 hpf'de uzunlamasına kasüzerinde saptanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP160-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil, heavy duty</td>
			<td>Kirkland</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NMDA antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MAB363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H3 (Ser10), clone RR002</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>05-598</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan-AMPA receptor (GluR1-4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABN832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Nitrate [Ca(NO3)2]</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT150C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Sally Hanson</td>
			<td></td>
			<td>Any nail polish or hardener may be subsituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depression (concavity) slide</td>
			<td>Electron Miscroscopy Sciences</td>
			<td>71878-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobenzidine</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1855920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, Danieau, 30%</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES in ultrapure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium, E2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>7.5 mM NaCl, 0.25 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 75 uM KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L methylene blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floating tube holder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>59744015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence compound microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereomicroscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>M165-FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 18 x 18</td>
			<td>Corning</td>
			<td>284518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips 22 x 60</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-050-222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humid chamber with lid</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M920-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide, 30%</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunedge pap pen</td>
			<td>Vector labs</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins, size 00</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>5213323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4 &#183; 7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>63138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh strainer</td>
			<td>Oneida</td>
			<td></td>
			<td>Any brand may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-tube cap lock</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>145062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Toastmaster</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S02L1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBTriton</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount mounting medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (glass)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>3160100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (plastic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl 2-thiourea</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>207250250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 10x, pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), 1x</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1x made from 10x stock diluted in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P250-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spawning tank with lid and insert</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperBlock PBS</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>37515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost + slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue gel</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; 0.1% Tween20; made in dH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloracetic Acid (Cl3CCOOH)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafine forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, ultrapure/double distilled</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W2-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae

İmmünohistokimya hem normal gelişimsel hem de hastalık durumlarında protein ekspresyonu ve lokalizasyonunu araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Birçok immünohistokimya protokolü memeli doku ve doku bölümleri için optimize edilmiş olsa da, bu protokoller genellikle memeli olmayan model organizmalar için modifikasyon ve optimizasyon gerektirir. Zebra balıkları, gelişim süreçlerinin moleküler, genetik ve hücresel biyolojik mekanizmalarını araştırmak için temel, biyomedikal ve çevirisel araştırmalarda giderek daha fazla model sistem olarak kullanılmaktadır. Zebra balığı bir model sistemi olarak birçok avantaj sunmak ama aynı zamanda optimal protein tespiti için modifiye teknikleri gerektirir. Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarda tam montaj floresan immünohistokimyası için protokolümüzü sağlıyoruz. Bu protokol ayrıca, istihdam edilebilen birkaç farklı montaj stratejisini ve her stratejinin sağladığı avantaj ve dezavantajlara genel bir bakışı açıklar. Ayrıca, tüm montaj dokusunda kromojenik substratların saptanmasını ve kesitli larva dokusunda floresan tespitine olanak sağlayacak değişiklikler de tanımlıyoruz. Bu protokol birçok gelişimevrelerinin ve embriyonik yapıların incelenmesi için geniş ölçüde geçerlidir.

Tüm monte immünohistokimya bozulmamış hayvan protein ekspresyonunun mekansal desen tespit etmek için antikorlar kullanır. İmmünohistokimyanın temel iş akışı (Şekil 1'degösterilmiştir) zebra balıklarının üremesini, embriyoların yetiştirilmesini ve hazırlanmasını, spesifik olmayan antijenlerin engellenmesini, ilgi proteinini hedeflemek için antijene özgü bir primer antikor kullanılmasını, etiketlenmiş ikincil antikorla birincil a...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae at JoVE.com

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Tüm monte immünohistokimya etiketli antikorlar kullanarak doğrudan bir doku veya organizmada proteinlerin mekansal ve zamansal gözlem sağlayan nispeten hızlı ve basit bir tekniktir. Bu tekniğin yararı, ilk bölüme gerek kalmadan bozulmamış bir doku veya organizmanın boyanmasına izin verir ve konfokal mikroskopi protein ekspresyonu deseninin üç boyutlu bir temsilini oluşturmak için kullanılabilir. İmmünohistokimya yaygın olarak hastalığın altında yatan etiyoloji ve moleküler mekanizmaları anlamak için biyomedikal araştırmalarda kullanılır.Patolojik örneklerdeki tümörleri tanımlamak için değerli bir tanı aracıdır. Başlamak için, sistem suyu ile dolu ve yerinde bir örgü veya oluklu astar ile yumurtlama tankları hazırlamak. Yetişkin zebra balığı karışık seks çiftleri bir gecede tanklarda gruplar halinde yerleştirin.14 saat/10 saatlik açık/koyu bir döngü kullanın ve ışıklar 9 a.m'de yanmakta. Ertesi sabah, ışıklar açıkken, dışkıkaldırmak için yumurtlama tankı suyunu tatlı sistem suyuyla değiştirin. Yumurtalar yumurtladıktan sonra, yetişkinleri ev tanklarına geri döndürün.Bir transfer pipet kullanarak onları çizerek yumurta toplamak. Embriyo medyumuyla yarı yolda doldurulmuş her Petri kabına 50 yumurta aktarın. Ölü veya bölmek için başarısız herhangi bir opak ve bulutlu yumurta çıkarın.Yumurta yemeğini 28,5 santigrat derecede, döllenmeden 23 saat sonraya kadar kuluçkaya yatırın. Embriyolar döllenme sonrası 24 saatten daha yaşlıysa, bir pipet ile embriyoları melanogenezi önlemek için embriyo ların 200 mikromolar PTU'ya aktarılması. Stereo mikroskop altında, ultra ince uçlu forceps kullanarak yumurtadan çıkmamış embriyolar dechorionate.Hasarı en aza indirmek için ateşle cilalı Pasteur pipetleri kullanarak, embriyo ortamda çözünmüş %1-2 agarose ile kaplanmış cam veya plastik Petri kaplarına aktarın. Daha sonra embriyoları plastik veya ateşcil li pipet kullanarak 1,5 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın. Bir mikropipet ile embriyo orta çıkarın.Sadece embriyoları kapsayacak kadar sıvı bırakın. Oda sıcaklığında hafif sallanan ile bir ila iki saat boyunca% 4 PFA içinde embriyolar düzeltin. Daha sonra, embriyoları 1X PBS'de üç kez ve %1 PBTriton'da beş dakika yıkayın.Hemen embriyoları kullanın veya bir haftaya kadar dört santigrat derecede saklayın. Uzun süreli depolama için, dehidrat ve eksi 20 santigrat derece% 100 metanol embriyolar saklayın. Embriyolar rehydrate için, son yıkama için metanol ve PBS ve PBTriton azalan miktarlarda oda sıcaklığında beş dakika her seri kuluçka gerçekleştirin.El yazmasına göre embriyo hazırlığına devam edin. İkincil antikor konak türleri eşleşen bir engelleme çözeltisi seçin, örneğin PBTriton%10 keçi serumu ile veya BSA mililitre başına iki miligram olmadan. Embriyo içeren tüpe 0,5 mililitre bloke çözeltisi ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında 1-3 saat boyunca bir kayanın üzerine yerleştirin.Daha sonra embriyoyu tıkalı çözeltide seyreltilmiş birincil antikorda kuluçkaya yatırın ve pbtriton bir gecede dört derece santigrat derece sallanırken. Sabahları, embriyoyu PBTriton'da beş kez 10'er dakika boyunca oda sıcaklığında yıkayın. Daha sonra 488 nanometrede birincil antikor ve istenilen dalga boyundaki ana türe dayalı ikincil bir antikor seçin.Embriyo içeren tüp içine engelleme çözeltisi seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin. Boruyu alüminyum folyo ile kaplayın ve sallarken oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, alüminyum folyo ve sallanan kaplı iken 10 dakika oda sıcaklığında her biri için PBTriton üç kez embriyoları yıkayın.Bir pipet ile, embriyo orta% 2 agarose bir yatak üzerinde PBS bir% 50 gliserol çözeltisi embriyotransferi. Sarısını çıkarmak için, 200 mikrolitre 1X PBS'yi bir depresyon slaytına veya düz cam bir kaydırağa aktarın. PBS damlacık bir veya daha fazla embriyo taşımak için plastik bir transfer pipet kullanın.Sarısını parçalamak ve embriyonun ventral yüzeyinden sarısı granüllerini nazikçe kazımak için ultra ince pİşletmeler ve çift sıfır böcek pimleri kullanın. Sarısı granüllerini çıkarın ve gerektiğinde PBS ile yenilenin. Montajdan sonra, mikroskop aşamasına örnek yerleştirin.Nispeten parlak bir örnek seçerek ilgi çekici bölgeyi bulun. Kamera pozlamasını ayarlayın ve sinyalin doymadan yeterince parlak olması için kazanç elde edin. Deneysel antikor etiketli embriyolar ve kontrol antikor embriyoları arasında karşılaştırma yaparken, aynı pozlama ayarlarını kullanın.Tüm monte immünohistokimya bu protokol zebrabalığı gelişimi kullanarak mekansal ve zamansal protein ekspresyonu çalışması için değerli bir araçtır. NMDA tipi glutamat reseptörünün GluN1 alt birimi, döllenme sonrası 23 saat boyunca gelişen zebrabalığı kasları boyunca glutamat reseptör alt birimlerinin ekspresyonunu ortaya çıkardı. 72 saatlik post fertilizasyon embriyolarının dondurulmuş bölümleri slaytlara monte edildi ve çoğalan hücrelerin bir belirteci olan fosfo-H3 için immünosüle edildi.Birkaç hücre fosfo-H3 ifade ve ifade en belirgin ventriküler zonlar oldu. Fare IgG kontrol antikor ve primer antikorlar hariç non-spesifik ekspresyon düşük düzeyde ortaya. Tespiti sağlamak ve spesifik olmayan boyamayı en aza indirmek için ana antikorlara ev sahipliği yapacak türlere dayalı uygun engelleme solüsyonları ve ikincil antikorlar seçmek önemlidir.İmmünohistokimya, gözlenen sinyalin aslında ilgi çekici protein olduğundan emin olmak için doğrulanmalıdır. Takip deneyleri genellikle genetiği değiştirilmiş organizmaların kullanılmasını içerir. İmmünohistokimya araştırmacılara proteinleri yerinde gözlemleme yeteneği vererek, özellikle embriyo gelişimi sırasında hem temel hem de uygulamalı biyolojideki çok sayıda sistemi anlamamızı büyük ölçüde hızlandırmaktadır.Metanol ve formaldehit toksiktir ve dikkatli kullanılmalıdır. Atıkların kurumsal prosedürlere göre toplanması ve bertaraf edilmesi gerekmektedir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

Tüm montaj immünohistokimya ve 3D Rekonstrüksiyon u kullanarak Faringeal Arch Arterlerin Görselleştirilmesi ve Analizi

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...