Name: multi-scale analysis of bacterial growth under stress treatments
Uploaded: 2019-11-28T14:30:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments at JoVE.com

ويشكر المؤلفون f. Cornet لتوفير سلاله Hupa-mCherry , ا. ديوديو للحصول علي المساعدة التقنية مع الخلوي, و ا. ducret للحصول علي مساعده مع MicrobeJ. التمويل: c. Lesterlin يقر المؤسسات المفتوحة والCNRS وكذلك برنامج ATIP-افينير ، المؤسسة العامة للتعليم والبحث (FSER 2019) ، وتمويل ANR لبرنامج أبحاث PlasMed (ANR-CE35-0008) فضلا عن FINOVI لتمويل j. Cayron ؛ لا رابطه مكافحه السرطان لتمويل المعدات الخلوية تدفق. مساهمات المؤلف: صمم C.L. و J.C. الاجراء وكتب الورقة ؛ J.C. اجراء التجارب وتحليل البيانات.

<ol>
	<li>Donachie, W. D., Begg, K. J., Vicente, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+length,+cell+growth+and+cell+division.">Cell length, cell growth and cell division.</a> Nature. 264 (5584), 328-333 (1976).</li><li>Donachie, W. D., Blakely, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+the+initiation+of+chromosome+replication+to+cell+size+in+Escherichia+coli.">Coupling the initiation of chromosome replication to cell size in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Microbiology. 6 (2), 146-150 (2003).</li><li>Patterson, D., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Elevated+Temperatures+on+Protein+Synthesis+in+Escherichia+coli.">Effect of Elevated Temperatures on Protein Synthesis in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 112 (3), 1177 (1972).</li><li>Begg, K. J., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+and+division+in+Escherichia+coli:+experiments+with+shape+and+division+mutants.">Cell shape and division in Escherichia coli: experiments with shape and division mutants.</a> Journal of Bacteriology. 163 (2), 615-622 (1985).</li><li>Van De Putte, P., Van Dillewijn, J., Roersch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Selection+of+Mutants+of+Escherichia+Coli+with+Impaired+Cell+Division+at+Elevated+Temperature.">The Selection of Mutants of Escherichia Coli with Impaired Cell Division at Elevated Temperature.</a> Mutation Research. 106, 121-128 (1964).</li><li>Walker, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+characterization+of+temperature-sensitive+cell+division+mutants+of+Escherichia+coli.">Initial characterization of temperature-sensitive cell division mutants of Escherichia coli.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 47 (5), 1074-1079 (1972).</li><li>Lesterlin, C., Duabrry, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Bacterial+Chromosome+Architecture.">Investigating Bacterial Chromosome Architecture.</a> Chromosome Architecture. 1431, 61-72 (2016).</li><li>Stracy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+superresolution+microscopy+reveals+the+organization+of+RNA+polymerase+in+the+bacterial+nucleoid.">Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (32), E4390-E4399 (2015).</li><li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells.">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li><li>Lesterlin, C., Pages, C., Dubarry, N., Dasgupta, S., Cornet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetry+of+chromosome+Replichores+renders+the+DNA+translocase+activity+of+FtsK+essential+for+cell+division+and+cell+shape+maintenance+in+Escherichia+coli.">Asymmetry of chromosome Replichores renders the DNA translocase activity of FtsK essential for cell division and cell shape maintenance in Escherichia coli.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000288 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji+-+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis.">Fiji - an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), (2019).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).</li><li>Rolinson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+beta-lactam+antibiotics+on+bacterial+cell+growth+rate.">Effect of beta-lactam antibiotics on bacterial cell growth rate.</a> Journal of General Microbiology. 120 (2), 317-323 (1980).</li><li>Boye, E., L&#248;bner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+illuminating+microbiology.">Flow cytometry: illuminating microbiology.</a> The New Biologist. 2 (2), 119-125 (1990).</li><li>Rieseberg, M., Kasper, C., Reardon, K. F., Scheper, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+biotechnology.">Flow cytometry in biotechnology.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (3-4), 350-360 (2001).</li><li>Nolivos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+AcrAB-TolC+multidrug+efflux+pump+in+drug-resistance+acquisition+by+plasmid+transfer.">Role of AcrAB-TolC multidrug efflux pump in drug-resistance acquisition by plasmid transfer.</a> Science. 364 (6442), 778-782 (2019).</li><li>Chao, Y., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixation+methods+for+observation+of+bacterial+cell+morphology+and+surface+ultrastructures+by+atomic+force+microscopy.">Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).</li></ol>

ولم يعلن أصحاب البلاغ عن وجود مصالح متنافسة.

من الضروري ان تولي اهتماما لحاله نمو الخلايا اثناء العملية. تنمو الخلايا علي مدي عده أجيال قبل الوصول إلى مرحله الاسي الكامل. لنجاح هذه الطريقة ، من المهم ان يتم جمع جميع عينات الخلايا في وقت واحد ، وانه من الأفضل لتحليل واحد فقط المعالجة والثقافة غير المعالجة واحده في نفس الوقت. يجب الحفاظ علي عينات الخلايا للتصوير المجهري عند درجه الحرارة التجريبية طوال العملية. ومن ثم من الضروري لتسخين غرفه المجهر وغرفه ميكروفلويدريك قبل بداية التجربة. إذا كانت عينات الخلية لقياس التدفق الخلوي لا يمكن تحليلها بسهوله ، فانها يمكن ان تبقي علي الجليد لمده تصل إلى 6 ساعات. الحضانة علي الجليد سوف تحد من النمو والتحوير المورفولوجية للخلايا. بدلا من ذلك ، قد يفكر المستخدم في استخدام تثبيت الخلايا في الايثانول 75 ٪ ، والذي ينصح عاده لتدفق الخلوي10. إذا كان البروتوكول يتطلب غسل محرض الإجهاد من المتوسطة ، والطرد المركزي وخلايا ماصه بعناية فائقه لتجنب اتلاف الخلايا الشاذة المحتملة.
كل من قياس التدفق الخلوي وتحليل لقطه تعطي الوصول إلى حجم الخلية والمعلمات محتوي الحمض النووي ، مع لقطات توفير مراقبه اضافيه لمورفولوجية الخلية. تلطيخ الحمض النووي مع DAPI10 (4 ' ، 6-diamidino-2-فينيلانديول) أو غيرها من الاصباغ الحمض النووي مستقره يمكن ان يؤديها إذا لم يكن الانصهار الفلورية المتاحة لمراقبه النونويدات في الكائن الحي من الفائدة. إذا كان لا يمكن اجراء تحليل التدفق الخلوي ، فمن المهم ان الصورة وتحليل عدد كبير من الخلايا عن طريق المجهر.
يمكن أيضا اجراء التصوير المجهري باستخدام سلالات تحمل اندماج فلورية للبروتينات المشاركة في مسارات معينه للفائدة. وهذا من شانه ان يساعد علي الكشف عن تاثير الإجهاد علي مجموعه متنوعة من العمليات الخلوية مثل النسخ المتماثل ، والنسخ ، وتركيب جدار الخلية ، أو تقسيم الخلية. ويمكن تطبيق هذه الطريقة علي مجموعه من الأنواع البكتيرية ، والشرط الوحيد هو ان جهاز ميكروفلويدريك يجب ان تكون متوافقة مع مورفولوجية الخلايا. لوحات ميكروفلويديك القياسية هي مريحه لبكتيريا شكل قضيب مع عرض الخلية بين 0.7 μm و 4.5 μm. ومع ذلك ، cocci ، المكورات العقديه ، أو سلالات بكتيرية أخرى مع الاشكال الغريبة تحتاج إلى اختبار. بدلا من ذلك ، إذا كان لا يمكن اجراء التجارب ميكروفلوريك بسبب عدم توفر المعدات أو سلالات بكتيرية غير متوافقة ، يمكن اجراء التصوير بالفاصل الزمني علي الشرائح المثبتة علي المركبات لمده أقصاها 2 ساعة.
والميزة الشاملة لهذا التحليل متعدد النطاقات هي توفير رؤية عالميه لتاثير الضغط التعريفي علي عده جوانب من قدره النمو البكتيري (اي التوليف الشامل ، وسلامه الخلايا ، وتشكل الخلايا ، وسلامه الغشاء ، ومحتوي الحمض النووي) وطريقه هذه تتطور مع الوقت في السكان البكتيرية المتزايدة تحت ظروف الإجهاد. كما انه يسمح بتحليل استعاده النمو الطبيعي علي مستوي الخلية الواحدة ومستوي السكان. وينطبق هذا النهج علي مجموعه واسعه من الأنواع البكتيرية وعلي اي نوع من العلاج المجهد تقريبا ، مثل التعرض للمضادات الحيوية أو غيرها من المركبات المضادة للميكروبات ، وتحليل تاثير التفاعل مع الكائنات الأخرى في الأنواع المتعددة السكان ، أو تاثير الطفرة الجينية.

الغرض العام من هذا البروتوكول هو تحليل سلوك الخلايا البكتيرية المعرضة للعلاجات الإجهاد علي السكان وعلي مستويات خليه واحده. البكتيريا النمو والقدرة علي البقاء وتعالج تقليديا علي مستوي السكان باستخدام الرصد الكثافة البصرية (OD600nm) ، والذي هو وكيل لتوليف الخلايا البكتيرية الشامل ، أو عن طريق اختبارات الطلاء لتحديد تركيز خلايا قابله للحياة في الثقافة (مستعمره تشكيل وحده في المليلتر ، كفو/مل). في ظل ظروف النمو العادية (غير المجهدة) ، يتم ربط القياسات الOD600nm و CFU/mL بدقه لان الوقت المضاعف البكتيري يعتمد مباشره علي زيادة كتله الخلية1،2. ومع ذلك ، غالبا ما تتعطل هذه العلاقة في ظل الظروف التي تؤثر علي الخلية التوليف الشامل3، خليه تقسيم4، أو ان الزناد خليه تحلل. قدمت مثال بسيطه بإجهاد معالجه ان يمنع خليه تقسيم, اي ينتج في التشكيل من خلايا جرثوميه [فيلوكمننوس]5,6. أطاله الخلايا الخيطية عاده لان التوليف الشامل للخلايا لا يتاثر ، ولكنها غير قادره علي التقسيم إلى خلايا قابله للحياة. الثقافة بصريه كثافة بالتالي سيزيد مع وقت في معدل عادية غير ان لا التركيز من خلايا قابل للحياة يحدد بطليه اختبارات ([وت]/[مل]). في هذه الحالة ، كما هو الحال في العديد من الآخرين ، والكثافة البصرية وقياسات الطلاء هي مفيده ولكنها تفشل في توفير فهم شامل للتاثير الناجم عن الإجهاد المرصود. هذه الاختبارات الفرقة تحتاج إلى الجمع بين تقنيات تحليل خليه واحده للسماح لتوصيف متعمق لنقص النمو الناجم عن الإجهاد.
ويرد هنا وصف لاجراء يجمع بين أربعه نهج تجريبية تكميليه: (1) اختبارات الطلاء التقليدية ورصد الكثافة البصرية الاساسيه لرصد قابليه الخلية للاستمرار وتوليف الخلايا علي التوالي ؛ (2) قياس التدفق الخلوي لتقييم حجم الخلية ومعلمات محتوي الحمض النووي علي اعداد كبيره من الخلايا ؛ (3) التصوير المجهري لقطه لتحليل المورفولوجية الخلية. و (4) التصوير بالخلايا الاحاديه الفاصلة زمنيا في الغرف الصغيرة لفحص الديناميكيات الزمانيه لمصير الخلية. ويسمح هذا الإطار المتعدد النطاقات بتفسير الآثار العالمية علي نمو الخلايا وقابليتها للاستمرار في ضوء سلوك الخلايا الفردية. ويمكن تطبيق هذا الاجراء علي فك الاستجابة من الأنواع البكتيرية المتنوعة لأي إجهاد تقريبا من الفائدة ، بما في ذلك النمو في ظل ظروف معينه (اي ، متوسط النمو ، الأس الهيدروجيني ، درجه الحرارة ، تركيز الملح) ، أو التعرض للمضادات الحيوية أو غيرها مركبات مضاده للميكروبات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1613100</td>
			<td>Certified molecular biology agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A24858</td>
			<td>Cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>CAX2-S0000</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ONIX2 1.0.1</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne 96-well plate with lid</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7672-7596</td>
			<td>Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td>Blue frame (125 &#956;L, 1,7 x 2,8 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agarose medium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002232</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>B04A-03-5PK</td>
			<td>Plate for Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2105</td>
			<td>Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S34854</td>
			<td>DNA fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>30034301</td>
			<td>Automated plate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-scale analysis of bacterial growth under stress treatments

تحليل القدرة البكتيرية علي النمو والبقاء علي قيد الحياة في ظل ظروف الإجهاد أمر ضروري لمجموعه واسعه من دراسات علم الاحياء المجهرية. ومن المهم ان تميز استجابه الخلايا البكتيرية لعلاجات تحفز الإجهاد مثل التعرض للمضادات الحيوية أو غيرها من المركبات المضادة للميكروبات ، والتشعيع ، والحموضة غير الفسيولوجية ، ودرجه الحرارة ، أو تركيز الملح. قد تزعج علاجات الإجهاد المختلفة العمليات الخلوية المختلفة ، بما في ذلك انقسام الخلايا ، وتكرار الحمض النووي ، وتخليق البروتين ، وسلامه الغشاء ، أو تنظيم دوره الخلية. ترتبط هذه التاثيرات عاده بالأنماط الظاهرية المحددة علي النطاق الخلوي. ولذلك ، فان فهم مدي وسببيه النمو المستحث بالإجهاد أو أوجه القصور في القدرة علي البقاء يتطلب تحليلا دقيقا لعده بارامترات ، سواء علي صعيد الخلية الواحدة أو علي مستوي السكان. الاستراتيجية التجريبية المعروضة هنا تجمع بين رصد الكثافة البصرية التقليدية والطلاء الاختبارات مع تقنيات تحليل خليه واحده مثل تدفق الخلوي والتصوير المجهري في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية. ويتيح هذا الإطار المتعدد المقاييس وصفا لأثر ظروف الإجهاد علي مصير السكان البكتيريين.

تم استخدام الاجراء الموصوف لتحليل سلوك الخلايا الK12ه القولونية اثناء التعرض العابر للسيفاليكسين ، وهو مضاد حيوي يمنع تقسيم الخلايا علي وجه التحديد (الشكل 1ا)13. وقد استخدمت سلاله hupa-mcherry e. القولونية التي تنتج فلوريسسينتلي المسمي البروتين هو جين تاو المرتبطة بالحمض النووي الصبغي للتحقيق في ديناميات الكروموسوم في جميع انحاء هذا العلاج8,9. وقد تم تحليل الخلايا القولونية Hupa-mCherry المتزايدة باطراد من قبل (t0) و 60 دقيقه بعد الاحتضان مع سيفالكسين (t60). ثم ، تم غسل المضادات الحيوية بعيدا وتم تحليل الانتعاش من سكان الخلية بعد 1 h (t120) و 2 h (t180) (الشكل 1ب).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig1.jpg"> الشكل 1: إجراءات تحليل الاستجابة البكتيرية لعلاجات الإجهاد. (ا) تخطيطي للأسلوب. (ب) رسوم متحركة توضح شكل الخلية اثناء النمو الطبيعي في الوسط الغني واثناء التعرض العابر إلى سيفاليكسين (ceph.) ، من الاضافه في (t0) وبعد الغسيل سيفالكسين من (t60) إلى (t180). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
التطور الموازي لل OD و كفو/mL هو المؤشر الأول الذي يساعد علي فهم تاثير العلاجات الإجهاد. هذه المعلمات اثنين ترتبط ارتباطا وثيقا خلال النمو غير المضطرب ولكن غالبا ما تكون غير مقترنة وتتطور بشكل مستقل تحت الإجهاد. الثقافات الخلية المتنامية في وجود سيفالكسين عرضت الزيادات OD600nm مماثله كما الثقافات غير المجهدة (الشكل 2ا), تبين ان المخدرات لا تؤثر علي توليف الخلية الشامل. غير ان تركيز الخلايا القابلة للاستمرار لم يرتفع عندما كان سيفاليكسين موجودا بسبب التثبيط الصارم لانقسام الخلايا (الشكل 2ب). بدات الخلايا تقسيم مره أخرى عندما تم أزاله سيفالكسين ووصلت في نهاية المطاف إلى تركيز ما يعادل الثقافة غير المجهدة في (t180). وتعكس هذه النتائج تاثير الجراثيم من سيفالكسين, الذي يحفز تثبيط عكسها تماما من انقسام الخلايا. ستؤدي الضغوط المختلفة إلى إلغاء اقتران مختلف لمنحنيات OD و CFU/mL ، اعتمادا علي التاثير المستحث (علي سبيل المثال ، تعديل شكل الخلية مثل التغذية أو الانتفاخ ، وموت الخلايا مع أو بدون تحلل). وترد في الشكل 2(ج) قائمه غير حصريه بالنتائج المحتملة للنتائج التي تدل علي مختلف الآثار الناجمة عن الإجهاد.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig2.jpg"> الشكل 2: رصد نمو البكتيريا للخلايا المعالجة والسيفالكسين المعالجة علي مستوي السكان. (ا) رصد الكثافة البصرية (OD600nm/مل). (ب) تركيز الخلية القابلة للاستمرار (CFU/mL) داخل الثقافات المعالجة و سيفالكسين-60min. تشير أشرطه الخطا إلى الانحراف المعياري لثلاث نسخ تجريبية. (ج) خطط للنتائج المحتملة وما يرتبط بها من اثار الإجهاد. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
ويعد تحليل الخلايا الاحاديه ضروريا لتفسير استجابه الإجهاد التي لوحظت علي مستوي السكان بدقه. يسمح قياس التدفق الخلوي بفحص حجم الخلية ومحتوي الحمض النووي لعده آلاف من الخلايا14،15 (الشكل 3). اثار التعرض للسيفالكسين الزيادة الموازية في حجم الخلية ومحتوي الحمض النووي (t60). عندما تمت أزاله سيفالكسين, حجم الخلية السكانية ومحتوي الحمض النووي انخفضت تدريجيا لتصبح مماثله للسكان غير المجهدة في t180. وتبين هذه النتائج ان سيفالكسين لم تمنع تكرار الحمض النووي وأثارت تشكيل الخلايا الخيطية التي تحتوي علي العديد من معادلات الكروموسومات. هذه الخيوط تنقسم إلى خلايا مع حجم الخلية العادية ومحتوي الحمض النووي عندما تم غسلها المخدرات بعيدا. ستكون نتائج قياس التدفق الخلوي مختلفه جدا بالنسبة للضغوط التي تمنع تخليق الحمض النووي ، والتي تؤدي إلى تشكيل الخلايا الخيطية التي تحتوي علي كروموسوم واحد غير متماثل فقط. في هذه الحالة ، سيزيد حجم الخلية بشكل مماثل ولكن لن يقترن بزيادة في محتوي الحمض النووي.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig3.jpg"> الشكل 3: تحليل التدفق الخلوي التمثيلي للخلايا غير المعالجة والخلايا المعالجة من سيفالكسين 60 دقيقه. (ا) توزيع حجم الخلية الرسوم البيانية (FSC-H). (ب) الرسوم البيانية لمحتوي الحمض النووي (FL1-SYTO9). ن = 120,000 الخلايا التي تم تحليلها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
واستخدمت التصوير المجهري لفحص الشكل الخلوي والتنظيم داخل الخلايا من الحمض النووي الذي يظهره التوطين هو جين تاو-mCherry (الشكل 4ا). اثار سيفاليكسين تشكيل خلايا طويلة مع عرض الخلية العادية وعدم وجود حاجز القسمة. هذه الخيوط الناعمة التي تحتوي علي هياكل الحمض النووي متباعدة بانتظام تسمي النيونويدات ، مؤكدا ان سيفالكسين لا يؤثر علي النسخ المتماثل الكروموسوم والعزل. وقد أكد تحليل الصور الكمي إلى حد كبير حجم الخلية وزيادة محتوي الحمض النووي التي لوحظت سابقا مع قياس التدفق الخلوي (الشكل 4ب ، ج). ستكون النتائج مختلفه جدا بالنسبة للضغوط التي تحفز الحمض النووي-الضرر ، والتي تؤدي إلى تشكيل الخلايا الخيطية التي يستمر فيها التكرار ولكن العزل يضعف. في هذه الحالة ، سيزيد حجم الخلية ومحتوي الحمض النووي بشكل مماثل ، ولكن الخلايا ستؤوي كتله واحده غير مهيكله من الحمض النووي. صور لقطه يمكن أيضا ان تكشف عن نوع آخر من اشكال الخلايا الشاذة أو وجود الخلايا الصغيرة ، انوكلينات ، أو تفكيك (خلايا الأشباح).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig4.jpg"> الشكل 4: تحليل اللقطة المجهرية للخلايا المعالجة والتي لا تعالج والتي تتم معالجتها بنسبه 60 دقيقه. (ا) الصور المجهرية التمثيلية التي تظهر تباين المرحلة (الرمادي) واشاره هو-mcherry (الأحمر). (ب) الرسوم البيانية لتوزيع طول الخلية. شريط مقياس = 5 μm. (ج) الرسوم البيانية لعدد النيونويد لكل خليه. بين 800 و 2,000 تم تحليل الخلايا لكل عينه. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
وقد ساعد المجهر الفاصل الزمني المرتبط بالجهاز الصغير16 علي تحديد الأنماط الظاهرية التي لوحظت سابقا ويوفر رؤى اضافيه بشان تطور وسببيه نقص النمو. وأكدت الصور الفاصلة الزمنيه (الشكل 5ا والفيلم 1) ان استطاله الخلية (توليف كتله الخلية) ، والنسخ المتماثل الكروموسوم والعزل لم تثبط بالتعرض للسيفاليكسين. الاضافه إلى ذلك ، كشفت عمليه الانتعاش عند أزاله سيفالكسين. واظهر تحليل سلاله الخلايا الخيطية ان تقسيم الخلية أعاده تشغيل ~ 20 دقيقه بعد غسل بعيدا المخدرات (الشكل 5ب). وكانت الخلايا المقسمة الناتجة قابله للحياة ، لأنها تنقسم بدورها ، مما يؤدي في النهاية إلى تشكيل خلايا 33 التي تظهر الحجم الطبيعي ومحتوي الحمض النووي. هذا يسمح حساب الوقت الجيل الكلي من ~ 31 دقيقه علي 180 دقيقه من التجربة ، والذي يشبه الجيل الوقت محسوبة للسكان غير المجهدة من القياسات كفو/مل (~ 33 دقيقه).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig5.jpg"> الشكل 5: تحليل الفترة الزمنيه المجهرية للخلايا المعالجة سيفاليكسين-60min. (ا) الصور المجهرية التمثيلية التي تظهر تباين المرحلة (الرمادي) واشاره هو-mcherry (الأحمر). يشار إلى الخلية الخيطية المراقبة بواسطة الخطوط العريضة البيضاء ، وتقسم الخلايا بألوان مختلفه. شريط مقياس = 5 μm. (ب) التمثيل التخطيطي لسلاله الخلية الخيطية المقابلة للفريق (ا) وللفيلم 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/60576/60576vid1.jpg"> فيلم 1: Microfluidic فيلم من e. القولونية هو-mcherry تعامل مع سيفالكسين. تم حقن سيفاليكسين بعد 60 دقيقه ، تليها حقن المتوسطة RDM الطازجة لمده 3 ساعات. الوقت المشار اليه باللون الأصفر (1 اطار كل 10 دقائق). شريط مقياس = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/Movie1.mp4" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments at JoVE.com

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

يتيح هذا البروتوكول وصفا لنمو البكتيريا في ظروف الإجهاد في الخلية الواحدة ومستويات الخلايا السكانية.

تحليل متعدد النطاقات لنمو البكتيريا تحت علاج الإجهاد

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

الغرض العام من هذه الطريقة هو تحليل تأثير علاج الإجهاد على الخلايا البكتيرية ، سواء في الخلية الواحدة وعلى مستوى السكان. وهو يوفر رؤية عالمية لتأثير الإجهاد على عدة جوانب من نمو البكتيريا، بما في ذلك جدوى الخلية، مورفولوجيا، ومحتوى الحمض النووي. كما أنه يسمح بتميز الانتعاش السكاني.ويمكن استخدام هذه الطريقة في صناعة الأدوية لفحص نشاط جزيء مضادات الميكروبات الجديدة وتقدير تأثيرها على بقاء البكتيريا ونموها. العلاج الذي يُحفز الإجهاد له عدم كفاءة، مثل الجرعة والاعتماد على الوقت. قد يكون من الضروري إجراء اختبارات أولية لتحديد الجرعة المثلى ومدة العلاج قبل بدء هذا البروتوكول.يسمح العرض التوضيحي المرئي لهذا الأسلوب بتصور تفاصيل هامة لكل خطوة مهمة وكيفية تنفيذها بشكل صحيح. لتبدأ, تلقيح خمسة ملليلترات من EZ EZ الغنية المحددة المتوسطة مع مستعمرة واحدة من E.Coli MG1655 HU-PAmCherry وتنمو في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 140 دوران في الدقيقة الواحدة. في صباح اليوم التالي، استخراج 100 ميكرولترات من العينة وتمييعه مع 900 ميكرولترات من المتوسط لقياس الكثافة البصرية في 600 نانومتر.ثم، تمييع الثقافة في أنبوب اختبار يحتوي على وسيط جديد إلى نانومتر OD600 من 0.01. احتضان أنبوب الاختبار تلقيح في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 140 دورة في الدقيقة حتى تصل الكثافة البصرية 0.2، الموافق للمرحلة الأسية الكاملة في المتوسطة الغنية. ثم، aliquot عينات الثقافة للتصوير المجهري الفاصل الزمني، وتمييع والطلاء المقايسة، وتحليل تدفق القياسات الضوئية، والتصوير لقطة المجهر.تعريض 4.4 ملليلتر المتبقية من ثقافة الخلية في أنبوب الاختبار لعلاج الإجهاد محددة. على سبيل المثال، 4.4 ميكرولتر من سيفاليكسين في خمسة ميكروغرام لكل ملليلتر واحتضان في 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 140 دورة في الدقيقة. إعداد عشرة أضعاف التخفيفات التسلسلية، تصل إلى 10 إلى ناقص السابع، من 200 ميكرولترات عينة الثقافة في المتوسطة الطازجة.مزيج بين كل تخفيف من قبل دوامة لطيف جدا أو عن طريق عكس الأنبوب. لوحة 100 ميكرولترات من التخفيف المناسب على لوحات غير مختارة LB agarose واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. في اليوم التالي، عد عدد المستعمرات لتحديد تركيز الخلايا القابلة للحياة في كل عينة من الثقافات.رسم CFU لكل ملليلتر كدالة للوقت لثقافات الخلايا غير المعالجة والمعالجة. قياس OD600 من الثقافة على مقياس الطيف. تمييع عينة الثقافة مع المتوسطة الطازجة في أربع درجات مئوية للحصول على عينة مع OD600 في 0.06، الموافق لحوالي 15،000 خلية لكل ميكرولتر.بالنسبة لتلطيخ الحمض النووي، اخلط العينة البكتيرية المخففة مع محلول 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من صبغة الفلورسنت للحمض النووي في حصة الحجم من واحد إلى واحد واحتضان في الظلام لمدة 15 دقيقة. قبل حقن العينة، اخلط العينة عن طريق دوامة لطيفة جدا أو عن طريق عكس الأنبوب. تمرير العينة في تدفق مقياس الخلايا بمعدل تدفق حوالي 120،000 الخلايا في الدقيقة الواحدة.الحصول على الضوء إلى الأمام المتناثرة والجانبية المتناثرة وكذلك الحمض النووي صبغة الفلورسنت / إشارة الفلورسنت مع الإعدادات المناسبة. رسم الرسم البياني كثافة الخلية المتناثرة إلى الأمام لتمثيل توزيع حجم الخلية ومؤامرة الحمض النووي الفلورية صبغ / الفلورسنت إشارة كثافة الخلية الرسم البياني لتمثيل محتوى الحمض النووي في الخلية. أولاً، سخني غرفة المجهر الحرارية عند 37 درجة مئوية لتثبيت درجة الحرارة.إعداد الشرائح التي تحملها agarose كما هو موضح في المخطوطة. ضع الشريحة على مرحلة المجهر وافعل الحصول على الصورة باستخدام الضوء المنقول مع هدف تباين الوجه ومع الإثارة مصدر الضوء في 560 نانومتر ل mCherry. حدد حقول العرض التي تحتوي على خلايا معزولة لتسهيل الكشف التلقائي عن الخلايا أثناء تحليل الصور.تأكد من أن يتم تصوير ما لا يقل عن 300 خلية للسماح بإجراء تحليل إحصائي قوي لجموع الخلايا. أولا، إزالة حل الحفظ من لوحة microfluidic واستبدالها المتوسطة الطازجة محمّاة مسبقا إلى 37 درجة مئوية كما هو موضح في دليل مستخدم البرمجيات Microfluidic. إرفاق لوحة microfluidic إلى النظام المتعدد.وفي البرمجيات microfluidic، انقر على زر ختم لختم على لوحة لنظام متعددة. بعد ذلك، انقر على زر فتيلة. ضع لوحة microfluidic مع النظام المتعدد على مرحلة المجهر ويسخني في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين لتجنب تمدد الغرفة microfluidic.إغلاق لوحة microfluidic على نظام microfluidic عن طريق النقر على زر الختم إيقاف. استبدال المتوسطة من بئر ثمانية مع 150 ميكرولترات عينة الثقافة واستبدال المتوسطة من بئر واحد إلى خمسة مع المتوسطة المطلوبة، مع أو بدون كاشف محفز للإجهاد. ختم لوحة microfluidic ووضعها على مرحلة المجهر.في برنامج microfluidic، قم بتشغيل إجراء تحميل الخلايا. تأكد من أن تحميل الخلايا مرضي من خلال النظر تحت المجهر في الضوء المنقول. التركيز بعناية في وضع الضوء المنقولة واختيار عدة مجالات الرؤية التي تظهر البكتيريا المعزولة وغير مكتظة، حوالي 10 إلى 20 خلية لكل 100 ميكرولتر مربع.في البرمجيات microfluidic، انقر على زر تشغيل تسلسل مخصص، ثم برنامج حقن المتوسطة المحفزة للإجهاد خلال 10 دقائق في اثنين من PSI، تليها حقن في واحدة PSI لمدة المطلوبين من العلاج الإجهاد. قم بإجراء تصوير المجهر في وضع الفاصل الزمني بإطار واحد كل 10 دقائق، باستخدام تباين الطور في الضوء المنقول ومصدر ضوء 560 نانومتر للإشارة mCherry إذا لزم الأمر. بدء عملية الحصول على صورة مجهرية وبروتوكول الحقن microfluidic في نفس الوقت.افتح برنامج فيجي والمكون المساعد MicrobeJ. لتحليل اللقطة، قم بإسقاط جميع الصور المطابقة لشريحة مجهر واحدة في شريط التحميل MicrobeJ لسلسة الصور وحفظ ملف رصات الصور التي تم الحصول عليها. بالنسبة لبيانات الفاصل الزمني، ما عليك سوى إسقاط كومة الصور في شريط التحميل الخاص بـ MicrobeJ.تشغيل الكشف الآلي من الخطوط العريضة للخلية على أساس تجزئة صورة النقيض المرحلة وتشغيل الكشف عن النوى على أساس تجزئة إشارة الفلورسنت الحمض النووي الملون. تحقق من دقة الكشف عن الخلايا بصريا واستخدام أداة تحرير MicrobeJ لتصحيح إذا لزم الأمر. حفظ ملف النتائج التي تم الحصول عليها.انقر على أيقونة ResultJ لإكمال التحليل والحصول على نافذة ResultJ. يتم إنشاء العديد من أنواع مختلفة من الرسوم البيانية الإخراج. رسم المدرجات التكرارية تطبيع شكل الخلية أو طول ويعني nucleoid عدد في الخلية.حللت هذه الدراسة سلوك الخلايا الإشريكية الإشريكية K-12 خلال التعرض العابر للسيفالكسين، وهو مضاد حيوي يمنع على وجه التحديد انقسام الخلايا. الثقافات الخلية المتنامية في وجود cephalexin عرضت زيادات OD600 مماثلة كما الثقافات غير مجهدة. لم يزيد تركيز الخلايا القابلة للحياة عندما كان السيفالكسين موجودًا.بدأت الخلايا في الانقسام مرة أخرى عندما تمت إزالة السيفالكسين ووصلت في نهاية المطاف إلى تركيز يعادل ثقافة غير مجهدة بعد ساعتين. وأسفرت الضغوط المختلفة عن فك مختلف منحنيات OD وCFU لكل ملليلتر، حسب التأثير المستحث. أثار التعرض للcephalexin زيادة موازية من حجم الخلية ومحتوى الحمض النووي.عندما تمت إزالة السيفليكسين، انخفض حجم الخلية السكانية ومحتوى الحمض النووي تدريجيا وأصبح مشابها للسكان غير المجهدين بعد ساعتين. أثار سيفالكسين تشكيل خلايا طويلة مع عرض الخلايا الطبيعية ثم لا تقسيم سيبتا. وأكد التحليل الكمي للصورة حجم الخلية وزيادة محتوى الحمض النووي.تؤكد صور الفاصل الزمني أن استطالة الخلية وتكرار الكروموسوم والفصل لم يتم تثبيطهما بسبب التعرض للسيفالكسين. أظهر تحليل نسب الخلايا الخيطية أن انقسام الخلايا أعاد تشغيل ما يقرب من 20 دقيقة بعد غسل الدواء. من المهم للغاية التأكد من أن السكان البكتيريين في نمو أسي كامل قبل تحفيز علاجات الإجهاد.يمكن أن يكون العلاج المحفز للإجهاد المستخدم لهذه النهج خطرًا على المركبات التجريبية مثل السمية الجينية. حتى التعامل مع مجمع بعناية وارتداء قفاز، قناع، goggle، ومعطف المختبر.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

نمو المتفطرة السلية الأغشية الحيوية

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

اللعاب، الغدد اللعابية، وجمع اللمف الدموي من القراد اللبود الكتفي

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

تدفق التصاق الفحص لدراسة توظيف الكرية البيضاء لالكبدي الإنسان جيبية البطانة Endothelium تحت ظروف إجهاد القص

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

جيل ومتعدد المظهري فحص عالية المحتوى من<em&gt; الكوكسيلا البورنيتية</em&gt; المسوخ ينقول

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

في المختبر والمجراة نموذج لدراسة التصاق البكتيريا إلى سفينة ستريت تحت ظروف التدفق

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

طرق لمنع البكتيرية Pyomelanin الإنتاج وتحديد الزيادة المقابلة في الحساسية للإجهاد التأكسدي

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

فحص من التصاق تحت إجهاد القص لدراسة تي اللمفاويات-التصاق جزيء التفاعلات

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

طريقة جديدة لتحليل نوعي متعدد حجم البكتيرية الأغشية الحيوية على شعيري الفطرية المستعمرات عن طريق متحد البؤر والمجهر الإلكتروني

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

تحليل المناعي من الإجهاد الحبيبية تشكيل بعد تحدي البكتيريا من خلايا الثدييات

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...