Name: multi-scale analysis of bacterial growth under stress treatments
Uploaded: 2019-11-28T14:30:00
Duration: 12 min 8 s
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Les auteurs remercient F. Cornet d'avoir fourni la souche hupA-mCherry, A. Dedieu pour l'assistance technique en cytométrie et A. Ducret pour l'aide de MicrobeJ. Financement : C. Lesterlin reconnaît les institutions de l'Inserm et du CNRS ainsi que le programme ATIP-Avenir, la Fondation Schlumberger pour l'éducation et la recherche (FSER 2019), le financement de l'ANR pour le programme de recherche PlasMed (ANR-18-CE35-0008) ainsi que finOVI pour le financement de J. Cayron; La Ligue contre le cancer pour le financement de l'équipement cytomètre de débit. Contributions de l'auteur : C.L. et J.C. ont conçu la procédure et rédigé le document; J.C. a effectué les expériences et analysé les données.

1. Culture cellulaire, induction du stress et procédure d'échantillonnage
REMARQUE : Utilisez de la verrerie de culture stérile, des pointes de pipette et un milieu de croissance filtrés à 0,22 m pour éviter les particules de fond. Ici, les cultures cellulaires sont cultivées dans un milieu défini riche en autofluorescence (voir Tableau des matériaux)7,8.
<ol><li>Ststreak la souche bactérienne d'intérêt à partir d'un stock de glycérol congelé sur une plaque d'agarose Luria-Broth (LB) (avec antibiotique sélectif si nécessaire) et couver à 37 oC pendant la nuit (17 h). REMARQUE: L'exemple d'expérience présenté ici utilise Escherichia coli MG1655 hupA-mCherry. Cette souche produit la sous-unité étiquetée fluorescente de la protéine associée aux nucléoïdes HU, permettant ainsi une visualisation par microscopie légère du chromosome dans les cellules vivantes9.</li>
	<li>Inoculer 5 ml de milieu avec une seule colonie et croître à 37 oC en secouant à 140 rotations par minute (rpm) pendant la nuit (17 h). Les flacons (50 ml) ou les tubes à essai de grand diamètre (2 cm) doivent être utilisés pour assurer une aération satisfaisante de la culture agitée.</li>
	<li>Le lendemain matin, mesurez la densité optique à 600 nm (OD600nm) et diluelas la culture dans un tube à essai contenant un milieu frais à un OD600nm de 0,01. Le volume total de la culture doit être ajusté en fonction du nombre de points de temps à analyser au cours de l'expérience.</li>
	<li>Chargez un échantillon de 200 L de la culture dans une microplaque (0,2 ml par puits de volume de travail avec un fond transparent clair) et placez-le dans un lecteur de plaque automatisé (voir Tableau des matériaux) pour la surveillance de l'OD600nm pendant l'incubation à 37 oC.</li>
	<li>Incuber le tube à essai inoculé à 37 oC avec des secousses (140 tr/min) à600 nm OD 0,2, ce qui correspond à une phase exponentielle complète dans un milieu riche. REMARQUE : Il est essentiel de faire pousser les cellules pendant au moins 4 à 5 générations avant d'atteindre une croissance exponentielle appropriée. L'inoculum initial utilisé à l'étape 1.3 (OD600nm - 0,01) doit être adapté dans le cas de la croissance dans le milieu plus pauvre (c.-à-d. où la phase exponentielle est atteinte en dessous de OD 0.2), ou si plus de générations sont recherchées (par exemple, pour des études physiologiques spécifiques ou pour des traitements de stress prolongés).</li>
	<li>À l'OD600nm et 0,2, prenez les échantillons de culture suivants correspondant au point de temps t0 (cellules en croissance exponentielle avant induction du stress) : (1) Un échantillon de 150 L à charger immédiatement dans l'appareil microfluidique pour l'imagerie par microscopie en accéléré (voir la section 2); (2) Un échantillon de 200 L pour l'extrait de dilution et de placage (voir la section 3); (3) Un échantillon de 250 L à mettre sur la glace pour l'analyse de cytométrie du débit (section 4); (4) Un échantillon de 10 L à déposer immédiatement sur une diapositive montée sur l'agarose pour l'imagerie par microscopie (voir la section 5).</li>
	<li>Exposez la culture cellulaire qui reste dans le tube à essai au traitement de stress spécifique que vous voulez étudier et incuber à 37 oC avec des secousses (140 tr/min). REMARQUE: La culture croissante dans le lecteur de plaque automatisée pour la surveillance OD600nm devrait également être soumis au traitement du stress.</li>
	<li>Aux moments pertinents après le traitement du stress (t1, t2, t3, etc.), prenez les échantillons de cellules suivants de la culture stressée : (1) Un échantillon de 200 L pour l'analyse de dilution et de placage (voir la section 2); (2) Un échantillon de 250 L à mettre sur la glace pour l'analyse de cytométrie du débit (section 3); (4) Un échantillon de 10 L à déposer immédiatement sur une diapositive montée sur l'agarose pour l'imagerie par microscopie (voir la section 4). REMARQUE : Chaque traitement induisant le stress a une efficacité qui dépend de la dose et du temps. Ainsi, il pourrait être nécessaire d'exécuter des tests préliminaires pour déterminer la dose et la durée du traitement à utiliser pour des résultats optimaux. Cela peut être fait en effectuant la surveillance de l'OD à l'aide d'un lecteur de plaque automatisé (potentiellement associé à des essais de placage) d'une culture cellulaire traitée avec une gamme de doses et de temps d'exposition. Dans l'expérience présentée ici, la culture cellulaire a été traitée avec la céphalexine antibiotique inhibiteur de la division cellulaire (Ceph.) à une concentration finale de 5 g/mL pendant 60 min. La céphalocine a ensuite été emportée par le granule ment des cellules dans un tube de 15 mL à l'aide d'une centrifugation (475 g, 5 min), en retirant le supernatant, en reconcédant le granule cellulaire dans un volume égal de tuyauterie douce, et en transférant un tube propre. Les cellules lavées ont été incubées à 37 oC avec des secousses (140 tr/min) pour permettre la récupération. L'échantillon a été prélevé àt 60 (60 min après l'ajout de céphalexine correspondant à l'échantillon «céphalexin-60min-traité), t120 (60 min après le lavage), et t180 (120 min après le lavage).</li>
</ol>2. Placage d'assay
REMARQUE : L'analyse de placage permet de mesurer la concentration de cellules capables de générer un CFU dans les échantillons de culture. Cette procédure révèle la vitesse à laquelle une cellule se divise en deux cellules viables et permet de détecter les arrestations de division cellulaire (par exemple, l'augmentation du temps de génération bactérienne de la lyse cellulaire).
<ol><li>Préparer des dilutions en série 10 fois jusqu'à 10-7 de l'échantillon de culture de 200 L dans un milieu frais. Plaque de 100 oL de dilution appropriée sur des plaques d'agarose LB non sélectives afin d'obtenir entre 3 et 300 colonies après une incubation de nuit à 37 oC. REMARQUE : La dilution en série dans le milieu frais doit être effectuée rapidement pour limiter les divisions bactériennes. Alternativement, les chercheurs pourraient envisager d'utiliser une solution saline sans source de carbone pour prévenir les divisions cellulaires pendant le processus de dilution.</li>
	<li>Le lendemain, comptez le nombre de colonies pour déterminer la concentration de cellules viables (CFU/mL) dans chaque échantillon de culture. Tracer le CFU/mL en fonction du temps pour les cultures cellulaires non traitées et traitées.</li>
</ol>3. Cytométrie de flux
REMARQUE : La section suivante décrit la préparation d'échantillons cellulaires pour l'analyse de cytométrie du débit. Cette technique d'analyse révèle la distribution de la taille des cellules et de la teneur en ADN d'un grand nombre de cellules. Dans la mesure du possible, il est recommandé de traiter immédiatement les échantillons de cytométrie du débit. Alternativement, les échantillons peuvent être conservés sur la glace (jusqu'à 6 h) et analysés simultanément à la fin de la journée, une fois que le placage et la microscopie ont été effectués.
<ol><li>Diluer l'échantillon de 250 L de culture pour obtenir 250 L à une concentration de 15 000 cellules/L (correspondant à un OD600nm 0,06) dans un milieu frais à 4 oC. REMARQUE : L'incubation sur la glace limitera la croissance et la modification morphologique des cellules. Alternativement, l'utilisateur pourrait envisager d'effectuer la fixation des cellules dans 75% d'éthanol, comme habituellement recommandé pour la cytométrie de flux10.</li>
	<li>Pour la coloration de l'ADN, mélanger l'échantillon bactérien avec une solution de 10 g/mL de colorant fluorescent à l'ADN (ratio 1:1) et couver dans l'obscurité pendant 15 minutes avant d'analyser l'échantillon.</li>
	<li>Passer l'échantillon dans le cytomètre de débit avec un débit de 120 000 cellules/min. Acquérir de la lumière de fluorescence de colorant fluorescent à l'avant (FSC) et à la disséminée vers l'avant (FL-1) avec les réglages appropriés.</li>
	<li>Tracer les histogrammes de densité cellulaire FSC et FL-1 pour représenter la distribution de la taille des cellules et de la teneur en ADN dans la population cellulaire.</li>
</ol>4. Imagerie microscopie instantanée
REMARQUE : La partie suivante décrit la préparation des diapositives de microscopie et l'acquisition d'images pour l'analyse des instantanés de population. Cette procédure fournira des informations concernant la morphologie des cellules (longueur cellulaire, largeur, forme) et l'organisation intracellulaire de l'ADN nucléoïde.
<ol><li>Préchauffer la chambre de microscope thermostatée à 37 oC pour stabiliser la température avant de commencer les observations. Cette chambre permet la modulation de la température de l'optique du microscope et de l'étape de l'échantillon lors d'expériences en time-lapse.</li>
	<li>Préparer les toboggans montés sur l'agarose tels que décrits dans Lesterlin et Dubarry7.<ol>
<li>Retirez le film plastique du fond du cadre bleu (voir Tableau des matériaux),en laissant le film plastique creux de l'autre côté. Collez le cadre bleu sur une lame de verre au microscope.</li>
		<li>Pipette 150 l de solution moyenne d'agarose fondue de 1 % et verser dans le compartiment à ossature bleue. Couvrir rapidement d'un bordereau propre pour enlever l'excès de liquide et attendre quelques minutes que le tampon d'agarose se solidifie à température ambiante.</li>
		<li>Lorsque l'échantillon de cellule est prêt, retirez la glissière et le film plastique du cadre bleu. Verser 10 ll d'échantillon de cellules sur le tampon d'agarose et incliner doucement la glissière de verre pour étendre la gouttelette. Lorsque tout le liquide a été adsorbed, coller un couvercle propre sur le cadre bleu pour sceller l'échantillon. La diapositive de microscopie est maintenant prête pour la microscopie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placez la diapositive sur la scène du microscope et effectuez l'acquisition d'images à l'aide de la lumière transmise (avec un objectif de contraste de phase) et avec l'excitation de source de lumière aux longueurs d'onde appropriées (560 nm pour mCherry).</li>
	<li>Sélectionnez des champs de vision qui contiennent des cellules isolées afin de faciliter la détection automatisée des cellules lors de l'analyse d'images. Assurez-vous qu'au moins 300 cellules sont imaged pour permettre une analyse statistique robuste de la population cellulaire.</li>
</ol>5. Imagerie microfluidique de microscopie
REMARQUE : La partie suivante explique la préparation des plaques microfluidiques (voir tableau des matériaux),le chargement cellulaire, le programme de microfluidique et l'acquisition d'images en accéléré. Cette procédure d'imagerie révèle le comportement des cellules individuelles en temps réel.
<ol><li>Retirez la solution de conservation de la plaque microfluidique et remplacez-la par un milieu frais préchauffé à 37 oC, tel que décrit dans le guide utilisateur du logiciel microfluidique.</li>
	<li>Scellez la plaque microfluidique sur le système multiple et cliquez sur le bouton Priming.</li>
	<li>Placez la plaque microfluidique avec le système multiple sur le stade du microscope et préchauffez à 37 oC pendant 2 h avant de commencer l'acquisition de microscopie. REMARQUE : Cette étape de préchauffage est essentielle pour éviter la dilatation de la chambre microfluidique, ce qui modifierait la mise au point du microscope pendant l'expérience time-lapse et compromettrait l'acquisition d'image.</li>
	<li>Scellez la plaque microfluidique. Remplacer le milieu du puits 8 par 150 l d'échantillon de culture et remplacer le milieu du puits 1 à 5 par le milieu désiré par ou sans réactif induisant le stress.</li>
	<li>Scellez la plaque microfluidique et placez-la sur la scène du microscope.</li>
	<li>Sur le logiciel microfluidique (voir Tableau des matériaux)exécuter la procédure de chargement cellulaire. Vérifiez que le chargement des cellules est satisfaisant en regardant sous le microscope dans la lumière transmise. Exécutez la procédure de chargement cellulaire une deuxième fois si la densité cellulaire dans la chambre est insuffisante.</li>
	<li>Concentrez-vous soigneusement en mode lumière transmise et sélectionnez plusieurs champs de vision qui montrent des bactéries isolées. Il est important de sélectionner des champs qui ne sont pas surpeuplés pour pouvoir surveiller la croissance des cellules isolées au fil du temps (10 à 20 cellules par 100 m2 est recommandée). Cela facilitera également la détection cellulaire lors de l'analyse d'images.</li>
	<li>Sur le logiciel microfluidique, cliquez sur le bouton Créer un protocole. Programmez l'injection de milieu de croissance pour les équivalents temps de génération 1/2 pour permettre aux cellules de s'adapter (facultatif). Ensuite, programmez l'injection du milieu induisant le stress pendant 10 min à 2 psi, suivie d'une injection à 1 psi pour la durée désirée du traitement contre le stress. Si vous avez l'intention d'analyser la récupération des cellules après le stress, programmez l'injection de nouveau milieu de croissance pour la durée désirée. REMARQUE: Dans l'expérience présentée ici, la céphalexine a été injectée pendant 10 min à 2 psi, suivie de 50 min à 1 psi. Ensuite, le milieu de croissance frais a été injecté à 2 psi pendant 10 min, suivi de 3 h à 1 psi.</li>
	<li>Effectuez l'imagerie par microscopie en mode time-lapse avec 1 cadre toutes les 10 min en utilisant le contraste de phase dans la lumière transmise et une source de lumière d'excitation de 560 nm pour le signal mCherry si nécessaire. REMARQUE : Il est important de commencer l'acquisition d'image microscopique en même temps que le début du protocole d'injection microfluidique.</li>
</ol>6. Analyse d'image
REMARQUE : Cette section décrit brièvement les étapes clés du traitement et de l'analyse des images de microscopie instantanée s'ils sont instantanées et en time-lapse. L'ouverture et la visualisation des images de microscopie se font avec l'open source ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)11. L'analyse quantitative de l'image est effectuée à l'aide du logiciel open source ImageJ/Fiji avec le plugin12 (https://microbej.com) gratuit. Ce protocole utilise la version MicrobeJ 5.13I.
<ol><li>Ouvrez le logiciel Fiji et le plugin MicrobeJ.</li>
	<li>Pour l'analyse instantanée, déposez toutes les images correspondant à une diapositive de microscope (un échantillon) dans la barre de chargement MicrobeJ pour concatenate images et enregistrer le fichier des piles d'images obtenues. Pour les données time-lapse, il suffit de déposer la pile d'image dans la barre de chargement de MicrobeJ.</li>
	<li>Exécuter la détection automatisée des contours des cellules en fonction de la segmentation de l'image de contraste de phase et, le cas échéant, des nucléoïdes en fonction de la segmentation du signal de fluorescence de l'ADN taché. Vérifiez l'exactitude de la détection cellulaire visuellement et utilisez l'outil d'édition MicrobeJ pour la correction si nécessaire. Enregistrer le fichier de résultat obtenu. REMARQUE : Les paramètres utilisés pour la détection des cellules E. coli sont indiqués dans le Tableau des matériaux (voir la colonne Commentaires/Description de MicrobeJ). Pour d'autres espèces bactériennes (en particulier pour les bactéries non en forme de tige), l'utilisateur doit affiner les paramètres avant la détection (voir le tutoriel MicrobeJ). Pour les images en accéléré, l'exécution d'une détection semi-automatisée des cellules à l'aide de l'outil d'édition MicrobeJ pourrait être préférable pour permettre de se concentrer sur le sort des cellules individuelles (voir le tutoriel MicrobeJ).</li>
	<li>Cliquez sur l'icône ResultJ pour compléter l'analyse et obtenir la fenêtre ResultJ. De nombreux types de graphiques de sortie peuvent être générés à partir de ce point. Tracer les histogrammes normalisés de la forme de la cellule / longueur et le nombre moyen de nucléoïdes par cellule.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Donachie, W. D., Begg, K. J., Vicente, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+length,+cell+growth+and+cell+division.">Cell length, cell growth and cell division.</a> Nature. 264 (5584), 328-333 (1976).</li><li>Donachie, W. D., Blakely, G. 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Les auteurs n'ont déclaré aucun intérêt concurrent.

Il est essentiel de prêter attention à l'état de croissance des cellules au cours de la procédure. Cultivez les cellules sur plusieurs générations avant d'atteindre une phase exponentielle complète. Pour le succès de cette méthode, il est important que tous les échantillons de cellules soient prélevés simultanément, et il est préférable d'analyser une seule culture traitée et une culture non traitée en même temps. Les échantillons de cellules pour l'imagerie par microscopie doivent être maintenus à la température expérimentale tout au long de la procédure. Il est alors essentiel de préchauffer la chambre du microscope et la chambre microfluidique avant le début de l'expérience. Si les échantillons cellulaires de cytométrie d'écoulement ne peuvent pas être analysés facilement, ils peuvent être conservés sur la glace jusqu'à 6 h. L'incubation sur glace limitera la croissance et la modification morphologique des cellules. Alternativement, l'utilisateur pourrait envisager d'utiliser la fixation des cellules dans l'éthanol 75%, qui est généralement recommandé pour la cytométrie de flux10. Si le protocole exige le lavage de l'inducteur de stress du milieu, les cellules de centrifugeuse et de pipette très soigneusement pour éviter d'endommager les cellules aberrantes potentielles.
La cytométrie des flux et l'analyse instantanée donnent accès à la taille des cellules et aux paramètres de contenu de l'ADN, avec des instantanés fournissant une observation supplémentaire de la morphologie cellulaire. La coloration de l'ADN avec DAPI10 (4',6-diamidino-2-phenylindole) ou d'autres colorants d'ADN stables peuvent être effectués si aucune fusion fluorescente n'est disponible pour observer les nocléoïdes dans l'organisme d'intérêt. Si l'analyse de cytométrie de flux ne peut pas être effectuée, il est important d'imager et d'analyser un grand nombre de cellules par microscopie.
L'imagerie par microscopie peut également être réalisée à l'aide de souches transportant des fusions fluorescentes vers des protéines impliquées dans des voies d'intérêt spécifiques. Ceci aiderait à révéler l'effet du stress sur une série de processus cellulaires tels que la réplication, la transcription, la synthèse de la paroi cellulaire ou la division cellulaire. La méthode peut être appliquée à une gamme d'espèces bactériennes, la seule exigence étant que l'appareil microfluidique doit être compatible avec la morphologie des cellules. Les plaques microfluidiques standard sont pratiques pour les bactéries en forme de tige avec une largeur de cellules comprise entre 0,7 et 4,5 m. Cependant, les cocci, ovocoques, ou d'autres souches bactériennes avec des formes particulières doivent être testés. Alternativement, si des expériences microfluidiques ne peuvent pas être effectuées en raison de l'indisponibilité de l'équipement ou des souches bactériennes incompatibles, l'imagerie en time-lapse peut être réalisée sur des toboggans montés sur l'agarose pour une durée maximale de 2h.
L'avantage global de cette analyse à plusieurs échelles est de fournir une vision globale de l'effet de l'induction du stress sur plusieurs aspects de la capacité de croissance bactérienne (c.-à-d. la synthèse de masse, la viabilité cellulaire, la morphologie cellulaire, l'intégrité de la membrane, la teneur en ADN) et la façon dont ceux-ci évoluent avec le temps dans une population bactérienne qui croît dans des conditions de stress. Il permet également d'analyser la restauration de la croissance normale au niveau unicellulaire et au niveau de la population. L'approche s'applique à un large éventail d'espèces bactériennes et à pratiquement n'importe quel type de traitement du stress, comme l'exposition à des antibiotiques ou à d'autres composés antimicrobiens, l'analyse de l'influence de l'interaction avec d'autres organismes en multispécifique populations, ou l'effet de la mutation génétique.

Le but global de ce protocole est d'analyser le comportement des cellules bactériennes exposées aux traitements de stress à la population et aux niveaux unicellulaires. La croissance et la viabilité bactériennes sont traditionnellement abordées au niveau de la population à l'aide de la surveillance de la densité optique (OD600nm), qui est un indicateur de la synthèse de masse des cellules bactériennes, ou par des essais de placage pour déterminer la concentration de cellules viables dans la culture (unité de formation de colonie par millilitre, CFU/mL). Dans des conditions normales de croissance (non stressées), les mesures OD600nm et CFU/mL sont strictement corrélées parce que le temps de doublement bactérien dépend directement de l'augmentation de la masse cellulaire1,2. Cependant, cette corrélation est souvent perturbée dans des conditions qui affectent la synthèse de masse cellulaire3, division cellulaire4, ou qui déclenchent la lyse cellulaire. Un exemple simple est fourni par les traitements de stress qui inhibent la division cellulaire, qui se traduisent par la formation de cellules bactériennes filamenteuses5,6. Les cellules filamenteuses s'allongent normalement parce que la synthèse de masse cellulaire n'est pas affectée, mais elles sont incapables de se diviser en cellules viables. La densité optique de culture augmentera par conséquent au fil du temps à un rythme normal, mais pas la concentration de cellules viables déterminées par les essais de placage (CFU/mL). Dans ce cas, comme dans beaucoup d'autres, la densité optique et les mesures de placage sont informatives mais ne fournissent pas une compréhension complète de l'effet induit par le stress observé. Ces essais d'ensemble doivent être combinés avec des techniques d'analyse unicellulaire pour permettre une caractérisation en profondeur des insuffisances de croissance induites par le stress.
Ici, une procédure qui combine quatre approches expérimentales complémentaires est décrite : (1) les essais traditionnels de placage et la surveillance optique de base de densité pour surveiller la viabilité et la synthèse de masse cellulaire, respectivement ; (2) cytométrie de flux pour évaluer la taille des cellules et les paramètres de contenu de l'ADN sur un grand nombre de cellules; (3) microscopie en images instantanées pour analyser la morphologie cellulaire; et (4) la formation image de monocellule de time-lapse dans les chambres microfluidiques pour l'examen de la dynamique temporelle du destin cellulaire. Ce cadre à plusieurs échelles permet d'interpréter les effets globaux sur la croissance et la viabilité des cellules à la lumière du comportement des cellules individuelles. Cette procédure peut être appliquée pour déchiffrer la réponse de diverses espèces bactériennes à pratiquement tout stress d'intérêt, y compris la croissance dans des conditions particulières (c.-à-d., milieu de croissance, pH, température, concentration de sel), ou l'exposition aux antibiotiques ou à d'autres composés antimicrobiens.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1613100</td>
			<td>Certified molecular biology agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A24858</td>
			<td>Cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>CAX2-S0000</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ONIX2 1.0.1</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne 96-well plate with lid</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7672-7596</td>
			<td>Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td>Blue frame (125 &#956;L, 1,7 x 2,8 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agarose medium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002232</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>B04A-03-5PK</td>
			<td>Plate for Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2105</td>
			<td>Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S34854</td>
			<td>DNA fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>30034301</td>
			<td>Automated plate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-scale analysis of bacterial growth under stress treatments

L'analyse de la capacité bactérienne de croître et de survivre dans des conditions de stress est essentielle pour un large éventail d'études de microbiologie. Il est pertinent de caractériser la réponse des cellules bactériennes aux traitements induisant le stress tels que l'exposition à des antibiotiques ou à d'autres composés antimicrobiens, l'irradiation, le pH non physiologique, la température ou la concentration de sel. Différents traitements de stress peuvent perturber différents processus cellulaires, y compris la division cellulaire, la réplication de l'ADN, la synthèse des protéines, l'intégrité de la membrane, ou la régulation du cycle cellulaire. Ces effets sont généralement associés à des phénotypes spécifiques à l'échelle cellulaire. Par conséquent, pour comprendre l'étendue et la causalité des déficiences de croissance ou de viabilité induites par le stress, il faut une analyse minutieuse de plusieurs paramètres, tant au niveau unicellulaire qu'au niveau de la population. La stratégie expérimentale présentée ici combine des tests traditionnels de surveillance de la densité optique et de placage avec des techniques d'analyse unicellulaire s'ils ont été techniques telles que la cytométrie du débit et l'imagerie par microscopie en temps réel dans les cellules vivantes. Ce cadre à plusieurs échelles permet une description temporelle de l'impact des conditions de stress sur le sort d'une population bactérienne.

La procédure décrite a été utilisée pour analyser le comportement des cellules Escherichia coli K12 lors d'une exposition transitoire à la céphalexine, un antibiotique qui inhibe spécifiquement la division cellulaire (figure 1A)13. La souche hupA-mCherry E. coli qui produit la protéine HU étiquetée fluorescente associée à l'ADN chromosomique a été utilisée pour étudier la dynamique du chromosome tout au long de ce traitement8,9. Les cellules hupA-mCherry E. coli en croissance exponentielle ont été analysées avant (t0) et 60 min après l'incubation avec de la céphalexine (t60). Ensuite, l'antibiotique a été emporté et le rétablissement de la population cellulaire après 1 h (t120) et 2 h (t180) a été analysé (Figure 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig1.jpg"> Figure 1 : Procédure d'analyse de la réponse bactérienne aux traitements contre le stress. (A) Schéma tique de la méthode. (B) Dessin animé illustrant la morphologie cellulaire pendant la croissance normale dans le milieu riche et pendant l'exposition transitoire à la céphalexine (Ceph.), de l'addition à (t0) et après lavage de céphalexinde de (t60) à (t180). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
L'évolution parallèle de l'OD et de l'UC/mL est un premier indicateur qui aide à comprendre l'effet des traitements contre le stress. Ces deux paramètres sont strictement corrélés pendant la croissance non perturbée, mais sont souvent découplés et évoluent indépendamment sous l'effort. Les cultures cellulaires de plus en plus en présence de céphalexine ont montré des augmentations semblables d'OD600nm pendant que les cultures non stressées (figure 2A), montrant que le médicament n'a pas affecté la synthèse de masse cellulaire. Cependant, la concentration de cellules viables n'a pas augmenté lorsque la céphalexine était présente en raison de l'inhibition stricte de la division cellulaire (figure 2B). Les cellules ont commencé à se diviser à nouveau lorsque la céphalexine a été enlevée et a finalement atteint une concentration équivalente à la culture non stressée à (t180). Ces résultats reflètent l'effet bactériostatique de la céphalexine, qui induit une inhibition entièrement réversible de la division cellulaire. Différentes contraintes entraîneront un découplage différent des courbes OD et CFU/mL, selon l'effet induit (p. ex., modification de la morphologie cellulaire comme la filamentation ou le renflement, la mort cellulaire avec ou sans lyse). Une liste non exhaustive des résultats possibles indicatifs de différents effets induits par le stress est présentée à la figure 2C.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig2.jpg"> Figure 2 : Surveillance de la croissance bactérienne des cellules non traitées et traitées à la céphalexine au niveau de la population. (A) Surveillance de la densité optique (OD600nm/mL). (B) Concentration de cellules viables (CFU/mL) dans les cultures non traitées et céphalexines-60min-traitées. Les barres d'erreur indiquent l'écart type pour un triplicate expérimental. (C) Schémas des résultats possibles et des effets de stress associés. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
L'analyse à cellule unique est essentielle pour interpréter avec précision la réponse au stress observée au niveau de la population. La cytométrie de flux permet l'examen de la taille des cellules et de la teneur en ADN de plusieurs milliers de cellules14,15 (figure 3). L'exposition à la céphalexine a provoqué l'augmentation parallèle de la taille des cellules et de la teneur en ADN (t60). Lorsque la céphalexine a été enlevée, la taille des cellules de la population et la teneur en ADN ont graduellement diminué pour devenir semblables à la population non stressée àt 180. Ces résultats montrent que la céphalexine n'a pas inhibé la réplication de l'ADN et provoqué la formation de cellules filamenteuses qui contenaient plusieurs équivalents chromosomiques. Ces filaments divisés en cellules avec la taille normale de cellules et la teneur en ADN quand le médicament a été emporté. Les résultats de cytométrie de flux seraient très différents pour les contraintes qui inhibent la synthèse de l'ADN, qui conduisent à la formation de cellules filamenteuses contenant un seul chromosome non-réplication. Dans ce cas, la taille des cellules augmenterait de la même façon, mais ne serait pas associée à une augmentation de la teneur en ADN.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig3.jpg"> Figure 3 : Analyse cytométrie représentative du flux des cellules non traitées et traitées à la céphalexine 60min. (A) Histogrammes de distribution de taille cellulaire (FSC-H). (B) Histogrammes de contenu d'ADN (FL1-SYTO9). n - 120 000 cellules analysées. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
L'imagerie par microscopie instantanée a été utilisée pour examiner la morphologie cellulaire et l'organisation intracellulaire de l'ADN démontrée par la localisation HU-mCherry (Figure 4A). La céphalocine a provoqué la formation de longues cellules avec la largeur normale de cellules et aucun septa de division. Ces filaments lisses contenaient régulièrement des structures d'ADN espacées appelées nucléoïdes, confirmant que la céphalexine n'affectait pas la réplication et la ségrégation chromosomiques. L'analyse quantitative de l'image a largement confirmé l'augmentation de la taille des cellules et de la teneur en ADN précédemment observée avec la cytométrie du débit (figure 4B,C). Les résultats seraient très différents pour les stress qui induisaient des dommages à l'ADN, qui conduisent à la formation de cellules filamenteuses dans lesquelles la réplication se poursuit, mais la ségrégation est altérée. Dans ce cas, la taille des cellules et la teneur en ADN augmenteraient de la même façon, mais les cellules abriteraient une seule masse non structurée d'ADN. Les images instantanées pourraient également révéler d'autres types de formes cellulaires aberrantes ou la présence de mini, d'anuccléates ou de cellules lysées (cellules fantômes).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig4.jpg"> Figure 4 : Analyse instantanée de microscopie des cellules non traitées et de céphalexine-60min-traitées. (A) Images de microscopie représentatives montrant le contraste de phase (gris) et le signal HU-mCherry (rouge). (B) Histogrammes de distribution de longueur de cellules. Échelle Bar 5 m. (C) Histogrammes du nombre de nucléoïdes par cellule. Entre 800 et 2 000 cellules ont été analysées pour chaque échantillon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig4large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
La microscopie en accéléré associée à l'appareil microfluidique16 a aidé à déterminer les phénotypes précédemment observés et fournit des informations supplémentaires sur le développement et la causalité de l'insuffisance de croissance. Les images en accéléré(figure 5A et film 1) ont confirmé que l'allongement cellulaire (synthèse de masse cellulaire) et la réplication et la ségrégation chromosomiques n'étaient pas inhibés par l'exposition à la céphalexine. En outre, il a indiqué le processus de rétablissement quand la céphalexine a été enlevée. L'analyse de la lignée cellulaire filamenteuse a montré que la division cellulaire redémarre 20 min après avoir emporté le médicament (figure 5B). Les cellules divisées résultantes étaient viables, parce qu'elles à leur tour divisées, menant finalement à la formation de 33 cellules présentant la taille normale et la teneur en ADN. Cela a permis de calculer un temps de production global de 31 min sur les 180 min de l'expérience, ce qui est similaire au temps de génération calculé pour la population non stressée à partir des mesures CFU/mL (33 min).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig5.jpg"> Figure 5 : Analyse en accéléré de microscopie des cellules traitées par céphalexine-60min. (A) Images de microscopie représentatives montrant le contraste de phase (gris) et le signal HU-mCherry (rouge). La cellule filamentelle surveillée est indiquée par le contour blanc, et les cellules divisées par différentes couleurs. Barre d'échelle de 5 m. (B) Représentation schématique de la lignée cellulaire filamenteuse correspondant au panneau (A) et au film 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/60576/60576vid1.jpg"> Film 1: Film microfluidique de E. coli HU-mCherry traité à la céphalexine. La céphalexine a été injectée après 60 min, suivie de l'injection d'un milieu RDM frais pendant 3 h. Temps indiqué en jaune (1 cadre toutes les 10 min). Barre d'échelle de 5 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/Movie1.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour visionner cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).</a>

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Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Ce protocole permet une description temporelle de la croissance bactérienne dans des conditions de stress aux niveaux de la cellule unique et de la population cellulaire.

Analyse à plusieurs échelles de la croissance bactérienne sous traitement du stress

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

Le but global de cette méthode est d’analyser l’effet du traitement du stress sur les cellules bactériennes, à la fois à la cellule unique et au niveau de la population. Il fournit une vision globale de l’effet du stress sur plusieurs aspects de la croissance bactérienne, y compris la viabilité cellulaire, la morphologie et la teneur en ADN. Il permet également de caractériser le rétablissement de la population.Cette méthode pourrait être utilisée dans l’industrie pharmaceutique pour dépister l’activité de la nouvelle molécule antimicrobienne et apprécier leur impact sur la viabilité et la croissance des bactéries. Le traitement induisant le stress a une inefficacité, comme la dose et dépendant du temps. Il peut être nécessaire d’exécuter des tests préliminaires pour déterminer la dose optimale et la durée du traitement avant de commencer ce protocole.La démonstration visuelle de cette méthode permet d’imaginer des détails importants de chaque étape critique et comment les exécuter correctement. Pour commencer, inoculer cinq millilitres de MOPS EZ Rich Defined Medium avec une seule colonie d’E.Coli MG1655 HU-PAmCherry et croître à 37 degrés Celsius avec des secousses à 140 rotations par minute pendant la nuit. Le lendemain matin, extraire 100 microlitres de l’échantillon et le diluer avec 900 microlitres de milieu pour mesurer la densité optique à 600 nanomètres.Ensuite, diluer la culture dans un tube à essai contenant du milieu frais à un OD600 nanomètres de 0,01. Incuber le tube à essai inoculé à 37 degrés Celsius avec secousse à 140 RPM jusqu’à ce que la densité optique atteint 0,2, correspondant à la phase exponentielle complète dans le milieu riche. Ensuite, aliquot les échantillons de culture pour l’imagerie par microscopie time-lapse, la dilution et l’analyse de placage, l’analyse de cytométrie de flux, et l’imagerie instantanée de microscopie.Exposez les 4,4 millilitres restants de la culture cellulaire dans le tube à essai à un traitement spécifique du stress. Par exemple, 4,4 microlitres de céphalexine à cinq microgrammes par millilitre et incuber à 37 degrés Celsius avec secousse à 140 RPM. Préparez dix dilutions en série, jusqu’à 10 à moins sept, des 200 microlitres d’échantillon de culture dans un milieu frais.Mélanger entre chaque dilution par vortex très doux ou en inversant le tube. Plaque 100 microlitres de la dilution appropriée sur les plaques d’agarose LB non sélectionnées et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, comptez le nombre de colonies pour déterminer la concentration de cellules viables dans chaque échantillon de culture.Tracez le CFU par millilitre en fonction du temps pour les cultures cellulaires non traitées et traitées. Mesurer l’OD600 de la culture sur un spectrophotomètre. Diluer l’échantillon de culture avec un milieu frais à quatre degrés Celsius pour obtenir un échantillon avec OD600 à 0,06, correspondant à environ 15 000 cellules par microlitre.Pour la coloration de l’ADN, mélanger l’échantillon bactérien dilué avec une solution millilitre de 10 microgrammes par millilitre de colorant fluorescent à l’ADN à la ration de volume de un à un et incuber dans l’obscurité pendant 15 minutes. Avant l’injection de l’échantillon, mélanger l’échantillon par vortex très doux ou en inversant le tube. Passez l’échantillon dans le cytomètre d’écoulement à un débit d’environ 120 000 cellules par minute.Acquérir de la lumière éparse vers l’avant et éparpillée latéralement ainsi que du colorant fluorescent d’ADN/signal fluorescent avec les réglages appropriés. Tracez l’histogramme de densité cellulaire épars vers l’avant pour représenter la distribution de la taille des cellules et tracer l’histogramme de densité fluorescente de colorant fluorescent/cellule de signal fluorescent de l’ADN pour représenter la teneur en ADN dans la population cellulaire. Tout d’abord, préchauffer la chambre de microscope thermostatée à 37 degrés Celsius pour stabiliser la température.Préparez les diapositives montées sur l’agarose telles que décrites dans le manuscrit. Placez la diapositive sur l’étape du microscope et effectuez l’acquisition d’images à l’aide de la lumière transmise avec un objectif de contraste du visage et avec une excitation de source lumineuse à 560 nanomètres pour mCherry. Sélectionnez les champs de vision qui contiennent des cellules isolées afin de faciliter la détection automatisée des cellules lors de l’analyse d’images.Assurez-vous qu’au moins 300 cellules sont photographiées pour permettre une analyse statistique robuste de la population cellulaire. Tout d’abord, retirez la solution de conservation de la plaque microfluidique et remplacez-la par un milieu frais préchauffé à 37 degrés Celsius tel que décrit dans le Guide des utilisateurs de logiciels microfluidiques. Attachez la plaque microfluidique au système multiple.Et dans le logiciel microfluidique, cliquez sur le bouton Seal pour sceller sur la plaque le système multiple. Après cela, cliquez sur le bouton d’amorçage. Placez la plaque microfluidique avec le système multiple au stade du microscope et préchauffez à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour éviter la dilatation de la chambre microfluidique.Scellez la plaque microfluidique sur le système microfluidique en cliquant sur le bouton Seal Off. Remplacer le milieu du puits huit par 150 microlitres d’échantillon de culture et remplacer le milieu du puits un à cinq par le milieu désiré, avec ou sans le réacompteur induisant le stress. Sceller la plaque microfluidique et la placer au microscope.Dans le logiciel microfluidique, exécutez la procédure de chargement cellulaire. Vérifiez que le chargement des cellules est satisfaisant en regardant sous le microscope dans la lumière transmise. Concentrez-vous soigneusement en mode lumière transmise et sélectionnez plusieurs champs de vision qui présentent des bactéries isolées et ne sont pas surpeuplés, soit environ 10 à 20 cellules par 100 microlitres carrés.Dans le logiciel microfluidique, cliquez sur le bouton Exécuter une séquence personnalisée, puis programmez l’injection du support induisant le stress pendant 10 minutes à deux ISP, suivie d’une injection à un PSI pour la durée souhaitée du traitement de stress. Effectuez l’imagerie par microscopie en mode time-lapse avec un cadre toutes les 10 minutes, en utilisant le contraste de phase dans la lumière transmise et une source de lumière d’excitation de 560 nanomètres pour le signal mCherry si nécessaire. Commencez l’acquisition d’images microscopiques et le protocole d’injection microfluidique en même temps.Ouvrez le logiciel Fidji et le plugin MicrobeJ. Pour l’analyse instantanée, déposez toutes les images correspondant à une diapositive microscope dans la barre de chargement MicrobeJ pour concatenate images et enregistrer le fichier piles d’images obtenues. Pour les données time-lapse, il suffit de laisser tomber la pile d’images dans la barre de chargement de MicrobeJ.Exécutez la détection automatisée des contours de la cellule en fonction de la segmentation de l’image de contraste de phase et exécutez la détection des nucléoïdes en fonction de la segmentation du signal fluorescent d’ADN souillé. Vérifiez l’exactitude de la détection cellulaire visuellement et utilisez l’outil d’édition MicrobeJ pour la correction si nécessaire. Enregistrez le fichier de résultat obtenu.Cliquez sur l’icône ResultJ pour compléter l’analyse et obtenir la fenêtre ResultJ. De nombreux types de graphiques de sortie sont générés. Tracez les histogrammes normalisés de la forme ou de la longueur des cellules et du nombre nucléoïde moyen par cellule.Cette étude a analysé le comportement des cellules K-12 d’Escherichia coli pendant l’exposition transitoire à la céphalexine, un antibiotique qui inhibe spécifiquement la division cellulaire. Les cultures cellulaires qui se développent en présence de céphalexine ont montré des augmentations similaires de l’OD600 à mesure que les cultures non stressées. La concentration des cellules viables n’a pas augmenté quand la céphalexine était présente.Les cellules ont commencé à se diviser à nouveau lorsque la céphalexine a été enlevée et a finalement atteint une concentration équivalente à la culture non stressée après deux heures. Différentes contraintes ont entraîné un découplage différent des courbes od et CFU par millilitre, selon l’effet induit. L’exposition à la céphalexine a provoqué une augmentation parallèle de la taille des cellules et de la teneur en ADN.Quand la céphalexine a été enlevée, la taille et la teneur en ADN de cellules de population ont graduellement diminué et sont devenues semblables à la population non stressée après deux heures. La céphalexine a provoqué la formation de longues cellules avec la largeur normale de cellules alors aucun septa de division. L’analyse quantitative de l’image a confirmé l’augmentation de la taille des cellules et de la teneur en ADN.Les images en accéléré confirment que l’allongement cellulaire et la réplication et la ségrégation chromosomiques n’ont pas été inhibés par l’exposition à la céphalexine. L’analyse de la lignée cellulaire filamentée a montré que la division cellulaire a redémarré environ 20 minutes après avoir emporté le médicament. Il est crucial de s’assurer que la population bactérienne est en pleine croissance exponentielle avant d’induire des traitements contre le stress.Le traitement induisant le stress utilisé pour ces approches pourrait être dangereux pour l’expérimental, comme le composé génotoxique. Alors manipulez le composé soigneusement et portez le gant, le masque, les lunettes, et le manteau de laboratoire.

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