Name: multi-scale analysis of bacterial growth under stress treatments
Uploaded: 2019-11-28T14:30:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments at JoVE.com

Forfatterne takker F. kjeks for å gi hupA-mCherry belastning, A. Dedieu for teknisk assistanse med flowcytometri, og a. Ducret for hjelp med MicrobeJ. Finansiering: C. Lesterlin erkjenner INSERM og CNRS institusjoner så vel som ATIP-Avenir programmet, Schlumberger stiftelsen for utdanning og forskning (FSER 2019), den ANR finansiering for PlasMed forskningsprogram (ANR-18-CE35-0008) samt FINOVI for finansiering til J. Cayron; La Ligue contre Le kreft for finansiering av flyten flowcytometer utstyr. Forfatter bidrag: CL og JC utformet prosedyren og skrev avisen; JC utførte eksperimenter og analysert dataene.

1. cellekultur, stress-induksjon, og prøvetaking prosedyre
Merk: Bruk sterile kultur glass, pipette tips og vekstmedium filtrert på 0,22 μm for å unngå bakgrunns partikler. Her dyrkes cellekulturer i lave autofluorescence rike definerte medium (se tabell over materialer)7,8.
<ol><li>Strek bakteriell stamme av interesse fra en frossen glyserol lager på en Luria-buljong (LB) agarose plate (med selektiv antibiotika hvis nødvendig) og ruge ved 37 ° c over natten (17 h). Merk: eksempel eksperimentet som presenteres her bruker Escherichia coli MG1655 hupA-mCherry. Denne belastningen produserer fluorescensmerkete merket delenhet α av HU nucleoid tilhørende protein, og dermed gir lys mikroskopi visualisering av kromosom i levende celler9.</li>
	<li>Vaksinere 5 mL medium med en enkelt koloni og vokse ved 37 ° c med risting ved 140 rotasjon per minutt (rpm) over natten (17 h). Flasker (≥ 50 mL) eller store diameter (≥ 2 cm) reagensrør må brukes for å sikre tilfredsstillende lufting av den urolige kulturen.</li>
	<li>Neste morgen måle optisk tetthet på 600 NM (OD600nm) og fortynne kulturen i et reagensrør som inneholder friskt medium til en OD600nm av 0,01. Det totale volumet av kulturen må justeres avhengig av antall tid poeng som skal analyseres under eksperimentet.</li>
	<li>Last en 200 μL prøve av kulturen inn i en mikroplate (0,2 mL per brønn av arbeidsvolum med en klar gjennomsiktig bunn) og plasser den i en automatisert plate leser (se tabell over materialer) for OD600nm overvåking under Inkubasjons ved 37 ° c.</li>
	<li>Ruge det inokulert test røret ved 37 ° c med risting (140 RPM) til OD600nm = 0,2, tilsvarende full eksponentiell fase i rikt medium. Merk: det er viktig å dyrke cellene i minst 4 − 5 generasjoner før du oppnår riktig eksponentiell vekst. Den innledende inokulum som ble brukt i trinn 1,3 (OD600nm = 0,01) må tilpasses i tilfelle av vekst i fattigere medium (dvs. hvor eksponentiell fase er nådd under OD 0,2), eller hvis flere generasjoner er ønsket (for eksempel for spesifikke fysiologiske studier eller til utvidet stress behandlinger).</li>
	<li>Ved OD600nm = 0,2, ta følgende kultur prøver tilsvarende til t0 tid punkt (eksponentielt voksende celler før stress induksjon): (1) en 150 μL prøve å bli umiddelbart lagt i mikrovæskebasert apparat for time-lapse mikroskopi Imaging (se pkt. 2); (2) en 200 μL prøve for fortynning og plating analysen (se pkt. 3); (3) en 250 μL prøve som skal settes på is for strømnings flowcytometri analyse (avsnitt 4); (4) en 10 μL prøve skal umiddelbart avsettes på en agarose-montert lysbilde for mikroskopi Snapshot Imaging (se avsnitt 5).</li>
	<li>Utsett celle kulturen som gjenstår i test røret til den spesifikke stress behandlingen du ønsker å undersøke og ruge ved 37 ° c med risting (140 RPM). Merk: kulturen vokser i den automatiserte plate leser for OD600nm overvåking bør også utsettes for stress behandling.</li>
	<li>På relevante tidspunkt etter stress behandling (t1, t2, t3, osv.), ta følgende celleprøver fra stresset kultur: (1) en 200 μL prøve for fortynning og plating analysen (se pkt. 2); (2) en 250 μL prøve som skal settes på is for strømnings flowcytometri analyse (avsnitt 3); (4) en 10 μL prøve skal umiddelbart avsettes på en agarose-montert lysbilde for mikroskopi Snapshot Imaging (se avsnitt 4). Merk: hver stress-inducing behandling har en virkningsgrad som er dose-og tidsavhengig. Derfor kan det være nødvendig å kjøre foreløpige tester for å bestemme dosen og varigheten av behandlingen som skal brukes for optimale resultater. Dette kan gjøres ved å utføre OD overvåking ved hjelp av en automatisert plate leser (potensielt assosiert med plating analyser) av en cellekultur behandlet med en rekke doser og eksponeringstider. I eksperimentet presenteres her, celle kulturen ble behandlet med cellen divisjon-hemme antibiotika Cephalexin (Ceph.) ved 5 μg/mL endelig konsentrasjon for 60 min. Cephalexin ble deretter vasket bort av pelleting cellene i en 15 mL rør ved hjelp av sentrifugering (475 g, 5 min), fjerne supernatanten, blanding cellen pellet i et likt volum av friskt medium av milde pipettering, og overføring til en ren tube. De vasket cellene ble inkubert ved 37 ° c med risting (140 RPM) for å tillate utvinning. Prøven ble tatt på t60 (60 min etter Cephalexin tillegg tilsvarende til ' Cephalexin-60min-behandlet ' Sample), t120 (60 min etter vask), og t180 (120 min etter vask).</li>
</ol>2. plating analysen
Merk: plating analysen gir mulighet for å måle konsentrasjonen av celler i stand til å generere en CFU i kulturen prøvene. Denne prosedyren avslører hastigheten som en celle deler i to levedyktige celler og gjør det mulig å oppdage celledeling arrestasjoner (f. eks, økning av bakteriell generasjon tid cellelyse).
<ol><li>Forbered 10-fold seriell fortynninger opp til 10-7 av 200 μL av kultur prøve i friskt medium. Plate 100 μL av riktig fortynning på ikke-selektive LB agarose plater for å oppnå mellom 3 − 300 kolonier etter natten inkubasjons ved 37 ° c. Merk: seriell fortynning i friskt medium må utføres raskt for å begrense bakterie divisjoner. Alternativt kan forskerne vurdere å bruke en saltoppløsning uten en karbon kilde for å hindre celle divisjoner under fortynning prosessen.</li>
	<li>Neste dag, telle antall kolonier for å bestemme konsentrasjonen av levedyktige celler (CFU/mL) i hver kultur prøven. Plotte CFU/mL som en funksjon av tid for ubehandlet og behandlet cellekulturer.</li>
</ol>3. Flow flowcytometri
Merk: følgende avsnitt beskriver utarbeidelse av celleprøver for Flow flowcytometri analyse. Denne analyse teknikken avslører fordelingen av Cellestørrelse og DNA-innhold for et stort antall celler. Når det er mulig, anbefales det å behandle flyt flowcytometri prøvene umiddelbart. Alternativt kan prøvene holdes på is (for opp til 6 h) og analyseres samtidig på slutten av dagen, når plating og mikroskopi Imaging er utført.
<ol><li>Fortynne 250 μL av kultur prøve for å oppnå 250 μL ved en konsentrasjon på ~ 15 000 celler/μL (tilsvarende en OD600nm ~ 0,06) i friskt medium ved 4 ° c. Merk: Inkubasjons på isen vil begrense vekst og morfologiske modifikasjon av cellene. Alternativt kan brukeren vurdere å utføre fiksering av cellene i 75% etanol, som vanligvis anbefales for Flow flowcytometri10.</li>
	<li>For DNA farging, bland bakteriell prøve med en 10 μg/mL løsning av DNA fluorescerende fargestoff (ratio 1:1) og ruge i mørket i 15 minutter før analysere prøven.</li>
	<li>Pass prøven i strømnings flowcytometer med en ~ 120 000 celler/min strømningshastighet. Erverve Forward-spredte (FSC) og side-spredte (SSC) lys samt DNA fluorescerende fargestoff fluorescens signal (FL-1) med de riktige innstillingene.</li>
	<li>Plot The FSC og FL-1 celle tetthet histogrammer å representere fordelingen av Cellestørrelse og DNA-innhold i cellen befolkningen.</li>
</ol>4. øyeblikksbilde mikroskopi avbildning
Merk: følgende del beskriver utarbeidelse av mikroskopi lysbilder og bilde oppkjøpet for befolkningen Snapshot analyse. Denne prosedyren vil gi informasjon om morfologi av cellene (celle lengde, bredde, form) og intracellulære organisering av nucleoid DNA.
<ol><li>Varm opp det thermostated mikroskop kammeret ved 37 ° c for å stabilisere temperaturen før observasjonene starter. Dette kammeret tillater temperatur modulering av mikroskop optikk og prøven scenen under time-lapse eksperimenter.</li>
	<li>Klargjør de agarose lysbildene som beskrevet i Lesterlin og Dubarry7.<ol>
<li>Fjern plastfilmen fra bunnen av den blå rammen (se tabell over materialer), slik at den uthult plastfilmen på den andre siden. Stick den blå rammen på et mikroskop glass lysbilde.</li>
		<li>Pipette ~ 150 μL av smeltet 1% agarose medium løsning og hell innenfor den blå rammen kupé. Dekk raskt med en ren dekkglass for å fjerne overflødig væske og vent noen minutter på at agarose puten stivner ved romtemperatur.</li>
		<li>Når Celleprøven er klar, fjerner du dekkglass og plastfilmen fra den blå rammen. Hell 10 μL av celleprøve på agarose puten og vipp glass skyve forsiktig for å spre dråpe. Når all væsken er adsorberes, stikker du en ren dekkglass på den blå rammen for å forsegle prøven. Den mikroskopi raset er nå klar for mikroskopi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plasser lysbildet på scenen for mikroskopet og utfør bilde anskaffelse ved hjelp av overført lys (med mål for fase kontrast) og med lys kilde eksitasjon på de aktuelle bølgelengdene (560 NM for mCherry).</li>
	<li>Velg visningsfelt som inneholder isolerte celler for å forenkle automatisk celle registrering under bildeanalyse. Sørg for at minst 300 celler er avbildet for å tillate robust statistisk analyse av cellen befolkningen.</li>
</ol>5. materialer tid-lapse mikroskopi tenkelig
Merk: følgende del forklarer utarbeidelse av mikrovæskebasert platene (se tabell over materialer), celle lasting, materialer program, og time-lapse image oppkjøp. Denne bildebehandlings prosedyren viser atferden til enkeltceller i sanntid.
<ol><li>Fjern bevarings løsningen fra mikrovæskebasert platen og Bytt den ut med friskt medium forvarmet til 37 ° c, som beskrevet i brukerveiledningen for mikrovæskebasert-programvaren.</li>
	<li>Forsegle mikrovæskebasert platen til manifold systemet og klikk på priming knappen.</li>
	<li>Plasser mikrovæskebasert plate med manifold system på mikroskopet scenen og varm ved 37 ° c for ~ 2 h før du starter mikroskopi oppkjøpet. Merk: Dette forvarming trinnet er avgjørende for å unngå utvidelse av mikrovæskebasert kammeret, noe som ville endre fokus for mikroskopet under tidsforløp eksperimentet og kompromiss bilde oppkjøpet.</li>
	<li>Forsegle mikrovæskebasert plate. Bytt medium fra brønn 8 med 150 μL av kultur prøve og Bytt ut mediet fra brønn 1 til 5 ved ønsket medium med eller uten stress-inducing reagens.</li>
	<li>Forsegle mikrovæskebasert plate og plassere den på mikroskopet scenen.</li>
	<li>På mikrovæskebasert programvare (se tabell over materialer) kjøre celle lasting prosedyren. Kontroller at lastingen av cellene er tilfredsstillende ved å se under mikroskopet i overført lys. Kjør celle lasting prosedyren en gang hvis celle tettheten i kammeret er utilstrekkelig.</li>
	<li>Utfør nøye fokus i overført lys modus og velg flere visningsfelt som viser isolerte bakterier. Det er viktig å velge felt som ikke er overfylte for å kunne overvåke veksten av isolerte celler over tid (~ 10 − 20 celler per 100 μm2 anbefales). Dette vil også lette celle deteksjon under bildeanalyse.</li>
	<li>Klikk på Opprett en protokoll-knappen på mikrovæskebasert programvare. Program injeksjon av vekstmedium for 1 − 2 generasjonstid ekvivalenter å tillate for cellene å tilpasse (valgfritt). Deretter programmere injeksjon av stress-inducing medium i løpet av 10 min ved 2 PSI, etterfulgt av injeksjon på 1 PSI for ønsket varighet av stress behandling. Hvis du har tenkt å analysere utvinningen av cellene etter stress, programmere injeksjon av frisk vekstmedium for ønsket varighet. Merk: i eksperimentet presenteres her, Cephalexin ble injisert i 10 min ved 2 PSI, etterfulgt av 50 min på 1 PSI. Deretter ble frisk vekstmedium injisert ved 2 PSI i 10 min, etterfulgt av 3 t på 1 PSI.</li>
	<li>Utfør mikroskopi Imaging i time-lapse modus med 1 ramme hver 10 min bruker fase kontrast i overført lys og en 560 NM eksitasjon lyskilde for mCherry signalet hvis nødvendig. Merk: det er viktig å begynne med mikroskopisk bildeoppkjøp samtidig som starten av mikrovæskebasert injeksjon protokollen.</li>
</ol>6. bildeanalyse
Merk: denne delen beskriver kort de viktigste trinnene for behandling og analyse av øyeblikksbilder og tidsforløp mikroskopi avbildninger. Åpning og visualisering av mikroskopi bilder er gjort med åpen kilde ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)11. Kvantitativ bildeanalyse utføres ved hjelp av åpen kilde ImageJ/Fiji programvare sammen med den frie MicrobeJ plugin12 (https://microbej.com). Denne protokollen bruker MicrobeJ 5.13 I-versjon.
<ol><li>Åpne Fiji programvare og MicrobeJ plugin.</li>
	<li>For Snapshot analyse, drop alle bilder som tilsvarer ett mikroskop lysbilde (ett utvalg) i MicrobeJ lasting bar å sammenkoble bilder og lagre den oppnådde bildet stabler filen. For tid-lapse data, rettferdig miste bildet stabel inn i lessing stang av MicrobeJ.</li>
	<li>Kjør Automatisert påvisning av cellene skisserer basert på segmentering av fase kontrast bilde og, hvis relevant, av nucleoids basert på segmentering av farget DNA fluorescens signal. Kontroller nøyaktigheten av celle deteksjon visuelt og bruke MicrobeJ redigeringsverktøy for korrigering hvis nødvendig. Lagre resultatfilen som er innhentet. Merk: innstillingene som brukes for påvisning av E. coli celler er angitt i tabellen av materialer (se kommentarer/beskrivelse kolonne av MicrobeJ). For andre bakterielle arter (spesielt for ikke-Rod-form bakterier), må brukeren avgrense innstillingene før deteksjon (se MicrobeJ tutorial). For tidsforløpbilder, kjører en semi-automatisert deteksjon av cellene ved hjelp av MicrobeJ redigering verktøyet kan foretrekkes å tillate fokusering på skjebnen til enkelte celler (se MicrobeJ tutorial).</li>
	<li>Klikk på ikonet ResultJ å fullføre analysen og få ResultJ vinduet. Mange forskjellige typer output grafer kan genereres fra det punktet. Plot normalisert histogrammer av celle form/lengde og gjennomsnittlig nucleoid tall per celle.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Donachie, W. D., Begg, K. J., Vicente, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+length,+cell+growth+and+cell+division.">Cell length, cell growth and cell division.</a> Nature. 264 (5584), 328-333 (1976).</li><li>Donachie, W. D., Blakely, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+the+initiation+of+chromosome+replication+to+cell+size+in+Escherichia+coli.">Coupling the initiation of chromosome replication to cell size in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Microbiology. 6 (2), 146-150 (2003).</li><li>Patterson, D., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Elevated+Temperatures+on+Protein+Synthesis+in+Escherichia+coli.">Effect of Elevated Temperatures on Protein Synthesis in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 112 (3), 1177 (1972).</li><li>Begg, K. J., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+and+division+in+Escherichia+coli:+experiments+with+shape+and+division+mutants.">Cell shape and division in Escherichia coli: experiments with shape and division mutants.</a> Journal of Bacteriology. 163 (2), 615-622 (1985).</li><li>Van De Putte, P., Van Dillewijn, J., Roersch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Selection+of+Mutants+of+Escherichia+Coli+with+Impaired+Cell+Division+at+Elevated+Temperature.">The Selection of Mutants of Escherichia Coli with Impaired Cell Division at Elevated Temperature.</a> Mutation Research. 106, 121-128 (1964).</li><li>Walker, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+characterization+of+temperature-sensitive+cell+division+mutants+of+Escherichia+coli.">Initial characterization of temperature-sensitive cell division mutants of Escherichia coli.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 47 (5), 1074-1079 (1972).</li><li>Lesterlin, C., Duabrry, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Bacterial+Chromosome+Architecture.">Investigating Bacterial Chromosome Architecture.</a> Chromosome Architecture. 1431, 61-72 (2016).</li><li>Stracy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+superresolution+microscopy+reveals+the+organization+of+RNA+polymerase+in+the+bacterial+nucleoid.">Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (32), E4390-E4399 (2015).</li><li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells.">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li><li>Lesterlin, C., Pages, C., Dubarry, N., Dasgupta, S., Cornet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetry+of+chromosome+Replichores+renders+the+DNA+translocase+activity+of+FtsK+essential+for+cell+division+and+cell+shape+maintenance+in+Escherichia+coli.">Asymmetry of chromosome Replichores renders the DNA translocase activity of FtsK essential for cell division and cell shape maintenance in Escherichia coli.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000288 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji+-+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis.">Fiji - an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), (2019).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).</li><li>Rolinson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+beta-lactam+antibiotics+on+bacterial+cell+growth+rate.">Effect of beta-lactam antibiotics on bacterial cell growth rate.</a> Journal of General Microbiology. 120 (2), 317-323 (1980).</li><li>Boye, E., L&#248;bner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+illuminating+microbiology.">Flow cytometry: illuminating microbiology.</a> The New Biologist. 2 (2), 119-125 (1990).</li><li>Rieseberg, M., Kasper, C., Reardon, K. F., Scheper, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+biotechnology.">Flow cytometry in biotechnology.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (3-4), 350-360 (2001).</li><li>Nolivos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+AcrAB-TolC+multidrug+efflux+pump+in+drug-resistance+acquisition+by+plasmid+transfer.">Role of AcrAB-TolC multidrug efflux pump in drug-resistance acquisition by plasmid transfer.</a> Science. 364 (6442), 778-782 (2019).</li><li>Chao, Y., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixation+methods+for+observation+of+bacterial+cell+morphology+and+surface+ultrastructures+by+atomic+force+microscopy.">Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).</li></ol>

Forfatterne erklærte ingen konkurrerende interesser.

Det er viktig å ta hensyn til vekst tilstanden i cellene under prosedyren. Vokse cellene over flere generasjoner før de når en full eksponentiell fase. For suksessen med denne metoden, er det viktig at alle celler prøvene er samlet samtidig, og det er best å analysere bare én behandlet og en ubehandlet kultur på samme tid. Celleprøver for mikroskopi avbildning må opprettholdes ved eksperimentell temperatur gjennom hele prosedyren. Det er da viktig å forvarming av mikroskopet kammeret og mikrovæskebasert kammer før begynnelsen av eksperimentet. Hvis celleprøver for strømnings flowcytometri ikke kan analyseres lett, kan de holdes på isen for opp til 6 h. Inkubasjons på isen vil begrense vekst og morfologiske modifikasjon av cellene. Alternativt kan brukeren vurdere å bruke fiksering av cellene i etanol 75%, som vanligvis anbefales for Flow flowcytometri10. Hvis protokollen krever vask stresset spole fra mediet, sentrifuger og pipette celler svært nøye for å unngå å skade de potensielle avvikende celler.
Både Flow flowcytometri og Snapshot analyse gir tilgang til Cellestørrelse og DNA-innhold parametere, med øyeblikksbilder gir ekstra observasjon av cellen morfologi. DNA farging med DAPI10 (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) eller andre stabile DNA fargestoffer kan utføres hvis ingen fluorescerende fusjon er tilgjengelig for å observere nucleoids i organismen av interesse. Hvis flyt flowcytometri analyse ikke kan utføres, er det viktig å avbilde og analysere et stort antall celler ved mikroskopi.
Mikroskopi avbildning kan også utføres ved hjelp av stammer som frakter fluorescerende fusjoner til proteiner som er involvert i bestemte veier av interesse. Dette vil bidra til å avdekke effekten av stress på en rekke cellulære prosesser som for eksempel replikering, transkripsjon, celle veggen syntese, eller celledeling. Metoden kan brukes på en rekke bakterielle arter, det eneste kravet er at mikrovæskebasert apparatet må være kompatibel med morfologi av cellene. Standard mikrovæskebasert plater er praktisk for stang-form bakterier med en cellebredde mellom 0,7 μm og 4,5 μm. Men, cocci, ovococci, eller andre bakterielle stammer med særegne former må testes. Alternativt, hvis mikrovæskebasert eksperimenter ikke kan utføres på grunn av utilgjengelighet av utstyret eller inkompatible bakterielle stammer, kan tidsforløp Imaging utføres på agarose-monterte lysbilder for en maksimal varighet på 2h.
Den samlede fordelen med denne multi-skala analyse er å gi en global visjon av effekten av stress induksjon på flere aspekter av bakteriell vekst evne (dvs., masse syntese, celle levedyktighet, celle morfologi, membran integritet, DNA-innhold) og måten disse utvikler seg med tiden i en bakteriell befolkning vokser under stress forhold. Den gjør det også mulig å analysere restaurering av normal vekst på enkelt cellenivå og befolkningsnivå. Tilnærmingen gjelder for et bredt spekter av bakterielle arter og til nesten alle slags stress behandling, for eksempel eksponering for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser, analyse av påvirkning av interaksjon med andre organismer i multispecies populasjoner, eller effekten av genetisk mutasjon.

Det overordnede formålet med denne protokollen er å analysere atferden til bakterielle celler utsatt for stress behandlinger på befolkningen og på enkelt cellenivå. Bakteriell vekst og levedyktighet er tradisjonelt adressert på befolkningsnivå ved hjelp av optisk tetthet overvåking (OD600nm), som er en proxy av bakteriell cellemasse syntese, eller av plating analyser for å bestemme konsentrasjonen av levedyktige celler i kulturen (koloni forming enhet per MILLILITER, CFU/ml). Under normale (trykklette) vekstforhold, OD600nm og CFU/ml målinger er strengt korrelert fordi bakteriell dobling tid avhenger direkte på celle massen økning1,2. Imidlertid er denne sammenhengen ofte forstyrret under forhold som påvirker celle massen syntese3, celle divisjon4, eller som utløser cellelyse. Et enkelt eksempel er levert av stress behandlinger som hemmer celledeling, noe som resulterer i dannelsen av trådformede bakterielle celler5,6. Trådformede celler forlenge normalt fordi cellen masse syntese er upåvirket, men de er ikke i stand til å dele inn i levedyktige celler. Kulturen optisk tetthet vil følgelig øke over tid i en normal hastighet, men ikke konsentrasjonen av levedyktige celler bestemmes av plating analyser (CFU/mL). I dette tilfellet, som i mange andre, optisk tetthet og plating målinger er informative, men ikke klarer å gi en helhetlig forståelse av den observerte stress-indusert effekt. Disse ensemble analysene må kombineres med én celle analyse teknikker for å tillate en inngående karakterisering av stress-indusert vekst mangler.
Her beskrives en prosedyre som kombinerer fire komplementære eksperimentelle tilnærminger: (1) tradisjonell plating analyser og grunnleggende optisk tetthet overvåking for å overvåke celle levedyktighet og cellemasse syntese, henholdsvis; (2) Flow flowcytometri å evaluere Cellestørrelse og DNA-innhold parametere på et stort antall celler; (3) mikroskopi Snapshot Imaging å analysere celle morfologi; og (4) tidsforløp én celle Imaging i mikrovæskebasert kamre for undersøkelse av den timelige dynamikken i cellen skjebne. Dette multi-skala rammeverk kan tolke den globale effekter på cellevekst og levedyktighet i lys av atferden til enkeltceller. Denne prosedyren kan brukes til å dechiffrere responsen av ulike bakteriearter til nesten alle stress av interesse, inkludert vekst under spesielle forhold (dvs. vekstmedium, pH, temperatur, saltkonsentrasjon), eller eksponering for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1613100</td>
			<td>Certified molecular biology agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A24858</td>
			<td>Cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>CAX2-S0000</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ONIX2 1.0.1</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne 96-well plate with lid</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7672-7596</td>
			<td>Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td>Blue frame (125 &#956;L, 1,7 x 2,8 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agarose medium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002232</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>B04A-03-5PK</td>
			<td>Plate for Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2105</td>
			<td>Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S34854</td>
			<td>DNA fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>30034301</td>
			<td>Automated plate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-scale analysis of bacterial growth under stress treatments

Analyse av bakteriell evne til å vokse og overleve under stress forhold er avgjørende for et bredt spekter av mikrobiologi studier. Det er relevant å karakterisere responsen av bakterielle celler til stress-inducing behandlinger som eksponering for antibiotika eller andre antimikrobielle forbindelser, bestråling, ikke-Fysiologiske pH, temperatur, eller saltkonsentrasjon. Ulike stress behandlinger kan forstyrre ulike cellulære prosesser, inkludert celledeling, DNA-replikering, proteinsyntese, membran integritet eller celle syklus regulering. Disse effektene er vanligvis forbundet med bestemte fenotyper på mobilnettet skala. Derfor krever forståelse av omfanget og årsakssammenheng av stress-indusert vekst eller levedyktighet mangler en grundig analyse av flere parametre, både på single-celle og på befolkningsnivå. Den eksperimentelle strategien som presenteres her kombinerer tradisjonell optisk tetthet overvåking og plating analyser med enkelt celle analyse teknikker som flyt flowcytometri og sanntid mikroskopi Imaging i levende celler. Dette multiscale rammeverket tillater en tids løst beskrivelse av virkningen av stress forhold på skjebnen til en bakteriell befolkning.

Prosedyren beskrevet ble brukt til å analysere atferden til Escherichia coli K12 celler under transient eksponering for Cephalexin, et antibiotikum som spesifikt hemmer Cell Division (figur 1A)13. Den hupA-mCherry E. coli stamme som produserer fluorescensmerkete merket Hu protein knyttet til kromosom DNA ble brukt til å undersøke dynamikken i kromosom gjennom denne behandlingen8,9. Den eksponentielt voksende hupA-MCherry E. coli celler ble analysert før (t0) og 60 min etter inkubasjons med Cephalexin (t60). Deretter ble antibiotika vasket bort og utvinningen av cellen befolkning etter 1 h (t120) og 2 h (t180) ble analysert (figur 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig1.jpg"> Figur 1: prosedyre for analyse av bakteriell respons på stress behandlinger. (A) skjematisk av metoden. (B) Cartoon illustrerer cellen morfologi under normal vekst i rikt medium og under forbigående eksponering for Cephalexin (Ceph.), fra tillegg til (t0) og etter Cephalexin vasking fra (t60) til (t180). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Den parallelle utviklingen av OD og CFU/mL er en første indikator som bidrar til å forstå effekten av stress behandlinger. Disse to parametrene er strengt korrelert under Uaffisert vekst, men er ofte lokomotivet og utvikles uavhengig under stress. Cell kulturer vokser i nærvær av Cephalexin utstilt lignende OD600nm øker som trykklette kulturer (figur 2A), viser at stoffet ikke påvirker celle massen syntese. Men konsentrasjonen av levedyktige celler ikke øke når Cephalexin var tilstede på grunn av streng hemming av celledeling (figur 2B). Celler begynte å dele igjen når Cephalexin ble fjernet og til slutt nådde en konsentrasjon som tilsvarer den trykklette kulturen på (t180). Disse resultatene reflekterer den bakteriostatisk effekten av Cephalexin, som induserer en fullt reversibel hemming av celledeling. Ulike påkjenninger vil resultere i ulike frakobling av OD og CFU/mL kurver, avhengig av effekten indusert (f. eks modifisering av cellen morfologi som filamentation eller svulmende, celle død med eller uten lyse). En ufullstendig liste over mulige resultat resultater indikasjon på ulike stress-indusert effekter er presentert i figur 2C.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig2.jpg"> Figur 2: bakteriell vekst overvåking av ubehandlet og Cephalexin-behandlet celler på befolkningsnivå. (A) overvåking av optisk TETTHET (OD600nm/ml). (B) konsentrasjon av levedyktig celle (CFU/ml) innenfor ubehandlet og Cephalexin-60min-behandlede kulturer. Feilfelt angir standardavviket for en eksperimentell tre eksemplarer. (C) skjematisk mulige resultater og tilhørende stress effekter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
En-celle analyse er viktig å nøyaktig tolke stress responsen observert på befolkningsnivå. Flow flowcytometri tillater undersøkelse av Cellestørrelse og DNA-innhold av flere tusen celler14,15 (Figur 3). Eksponering for Cephalexin provoserte parallell økning av Cellestørrelse og DNA-innhold (t60). Når Cephalexin ble fjernet, befolknings Cellestørrelse og DNA-innhold gradvis redusert til å bli lik den trykklette befolkningen på t180. Disse resultatene viser at Cephalexin ikke hemmer DNA-replikering og provoserte dannelsen av trådformede celler som inneholdt flere kromosom ekvivalenter. Disse filamenter delt inn i celler med normal Cellestørrelse og DNA-innhold når stoffet ble vasket bort. Flow flowcytometri resultater vil være svært forskjellig for påkjenninger som hemmer DNA-syntese, noe som fører til dannelsen av trådformede celler som inneholder bare en ikke-replikerer kromosom. I så fall vil Cellestørrelse øke tilsvarende, men vil ikke bli assosiert med økning i DNA-innhold.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig3.jpg"> Figur 3: representativ flyt flowcytometri analyse av ubehandlede og Cephalexin-60min-behandlede celler. (A) Cellestørrelse distribusjon histogrammer (FSC-H). (B) DNA-innhold histogrammer (FL1-SYTO9). n = 120 000 celler analysert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Snapshot mikroskopi Imaging ble brukt til å undersøke cellen morfologi og intracellulære organisering av DNA vist av HU-mCherry lokalisering (Figur 4A). Cephalexin provoserte dannelsen av lange celler med normal cellebredde og ingen divisjon septa. Disse glatte filamenter inneholdt regelmessig linjeavstand DNA strukturer kalt nucleoids, bekrefter at Cephalexin ikke påvirker kromosom replikering og segregering. Kvantitativ bildeanalyse i stor grad bekreftet Cellestørrelse og DNA-innhold øker tidligere observert med Flow flowcytometri (Figur 4B, C). Resultatene ville være svært forskjellig for påkjenninger som induserer DNA-skade, noe som fører til dannelsen av trådformede celler der replikering fortsetter, men segregering er svekket. I så fall vil Cellestørrelse og DNA-innhold øke på samme måte, men cellene ville havne en enkelt ustrukturert masse av DNA. Snapshot-bilder kan også avsløre andre typer avvikende celle figurer eller tilstedeværelsen av mini-, anucleate-eller lysert-celler (spøkelses celler).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig4.jpg"> Figur 4: mikroskopi øyeblikksbilde analyse av ubehandlede og Cephalexin-60min-behandlede celler. (A) representative mikroskopi bilder som viser fase kontrast (grå) og Hu-mCherry signal (rød). (B) celle lengde distribusjon histogrammer. Scale bar = 5 μm. (C) histogrammer av antall nucleoid per celle. Mellom 800 og 2 000 celler ble analysert for hver prøve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Time-lapse mikroskopi knyttet til mikrovæskebasert apparater16 bidratt til å bestemme fenotyper tidligere observert og gir ytterligere innsikt om utvikling og årsakssammenheng av vekst mangel. Tidsforløpbilder (figur 5A og film 1) bekreftet at celle forlengelse (cellemasse syntese), og kromosom replikering og segregering ikke ble hemmet av eksponering for Cephalexin. I tillegg avslørte prosessen med utvinning når Cephalexin ble fjernet. Analyse av trådformede celle avstamning viste at celledeling starter på nytt ~ 20 min etter å ha vasket bort stoffet (figur 5B). Den resulterende delte celler var levedyktig, fordi de i sin tur delt, til slutt fører til dannelsen av 33 celler som viser normal størrelse og DNA-innhold. Dette tillot beregning av en samlet generasjon tid på ~ 31 min over 180 min av eksperimentet, som ligner på generering tid beregnet for trykklette befolkningen fra CFU/mL målinger (~ 33 min).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig5.jpg"> Figur 5: mikroskopi tidsforløp analyse av Cephalexin-60min-behandlede celler. (A) representative mikroskopi bilder som viser fase kontrast (grå) og Hu-mCherry signal (rød). Den overvåkede trådformede cellen indikeres av hvit omrisset og delte celler med forskjellige farger. Scale bar = 5 μm. (B) skjematisk fremstilling av trådformede celle avstamning tilsvarende panel (A) og til film 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/60576/60576vid1.jpg"> Film 1: mikrovæskebasert film av E. coli Hu-mCherry behandlet med Cephalexin. Cephalexin ble injisert etter 60 min, etterfulgt av injeksjon av fersk RDM medium for 3 h. tid angitt i gult (1 ramme hver 10 min). Scale bar = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/Movie1.mp4" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne videoen (Høyreklikk for å laste ned).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments at JoVE.com

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Denne protokollen tillater en tid-løst beskrivelse av bakteriell vekst under stress forhold på enkelt celle og cellen befolkning nivåer.

Multi-skala analyse av bakteriell vekst under stress behandlinger

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

Det overordnede formålet med denne metoden er å analysere effekten av stressbehandling på bakterielle celler, både på enkeltcelle og på befolkningsnivå. Det gir en global visjon om effekten av stress på flere aspekter av bakteriell vekst, inkludert celle levedyktighet, morfologi, og DNA-innhold. Det gjør det også mulig å karakterisere befolkningsutvinningen.Denne metoden kan brukes i farmasøytisk industri for å screene for aktiviteten til nye antimikrobielle molekyler og setter pris på deres innvirkning på bakterier levedyktighet og vekst. Stressfremkallende behandling har en ineffektivitet, som dose og tidsavhengig. Det kan være nødvendig å kjøre foreløpige tester for å bestemme den optimale dosen og varigheten av behandlingen før du starter denne protokollen.Den visuelle demonstrasjonen av denne metoden gjør det mulig å forestille seg viktige detaljer om hvert kritiske trinn og hvordan du utfører dem riktig. Til å begynne med inokulerer du fem milliliter MOPS EZ Rich Defined Medium med en enkelt koloni av E.Coli MG1655 HU-PAmCherry og vokser med 37 grader Celsius med risting på 140 rotasjoner per minutt over natten. Neste morgen trekker du ut 100 mikroliter av prøven og fortynner den med 900 mikroliter medium for å måle den optiske tettheten ved 600 nanometer.Deretter fortynner du kulturen i et testrør som inneholder friskt medium til en OD600 nanometer på 0,01. Inkuber det inokulerte testrøret ved 37 grader Celsius med risting ved 140 RPM til den optiske tettheten når 0,2, tilsvarende full eksponentiell fase i rikt medium. Deretter, aliquot kultur prøver for time-lapse mikroskopi imaging, fortynning og plating analyse, flyt cytometri analyse, og mikroskopi snapshot imaging.Utsett de resterende 4,4 milliliter cellekulturen i testrøret for spesifikk stressbehandling. For eksempel, 4,4 mikroliter av cephalexin ved fem mikrogram per milliliter og inkuber ved 37 grader Celsius med risting ved 140 RPM. Forbered ti ganger seriefortynninger, opptil 10 til minus syvende, av de 200 mikroliter av kulturprøve i friskt medium.Bland mellom hver fortynning ved svært mild vortexing eller ved å snu røret. Plate 100 mikroliter av riktig fortynning på ikke-valgte LB agarose plater og inkubere over natten ved 37 grader Celsius. Neste dag teller du antall kolonier for å bestemme konsentrasjonen av levedyktige celler i hvert kulturutvalg.Plott CFU per milliliter som en funksjon av tid for de ubehandlede og behandlede cellekulturene. Mål OD600 av kulturen på et spektrofotometer. Fortynn kulturprøven med friskt medium ved fire grader Celsius for å få en prøve med OD600 på 0,06, tilsvarende ca. 15 000 celler per mikroliter.For DNA-farging, bland den fortynnede bakterielle prøven med et 10 mikrogram per milliliter løsning av DNA fluorescerende fargestoff ved volumrasjonen på en til en og inkubere i mørket i 15 minutter. Før injeksjon av prøven, bland prøven ved svært mild vortexing eller ved å snu røret. Send prøven inn i strømningssytometeret med en strømningshastighet på ca. 120 000 celler per minutt.Få foroverspredt og sidesplaget lys samt DNA fluorescerende fargestoff /fluorescerende signal med de riktige innstillingene. Plott den fremoverspredte celletettheten histogrammet for å representere fordelingen av cellestørrelse og plotte DNA fluorescerende fargestoff / fluorescerende signalcelletetthet histogrammet for å representere DNA-innholdet i cellepopulasjonen. Først forvarm det termostaterte mikroskopkammeret ved 37 grader Celsius for å stabilisere temperaturen.Forbered de agarosemonterte lysbildene som beskrevet i manuskriptet. Plasser lysbildet på mikroskopstadiet og utfør bildeoppkjøp ved hjelp av overført lys med et ansiktskontrastmål og med lyskildeutseelse på 560 nanometer for mCherry. Velg synsfelt som inneholder isolerte celler for å forenkle automatisert cellegjenkjenning under bildeanalyse.Kontroller at minst 300 celler er avbildet for å tillate robust statistisk analyse av cellepopulasjonen. Fjern først konserveringsløsningen fra mikrofluidplaten og bytt den ut med friskt medium forvarmet til 37 grader Celsius som beskrevet i brukerhåndboken for mikrofluidisk programvare. Fest mikrofluidisk plate til manifoldsystemet.Og i mikrofluidisk programvare klikker du på Seal-knappen for å forsegle platen til manifoldsystemet. Etter det, Klikk på Priming knappen. Plasser mikrofluidplaten med manifoldsystemet på mikroskopstadiet og forvarm ved 37 grader Celsius i to timer for å unngå utvidelse av mikrofluidkammeret.Forsegle mikrofluidplaten på mikrofluidsystemet ved å klikke på Tetningsknappen. Erstatt mediet fra godt åtte med 150 mikroliter kulturprøve og erstatt mediet fra godt en til fem med ønsket medium, med eller uten stressfremkallende reagens. Forsegle mikrofluidisk plate og plasser den på mikroskopstadiet.I mikrofluidisk programvare, kjøre celle lasting prosedyren. Kontroller at lasting av cellene er tilfredsstillende ved å se under mikroskopet i overført lys. Fokuser forsiktig i overført lysmodus og velg flere synsfelt som viser isolerte bakterier og ikke er overbefolket, rundt 10 til 20 celler per 100 firkantede mikroliter.I mikrofluidisk programvare, klikk på Kjør en egendefinert sekvens knappen, deretter programmere injeksjon av stress-inducing medium under 10 minutter på to PSI, etterfulgt av injeksjon på en PSI for ønsket varighet av stressbehandling. Utfør mikroskopiavbildning i tidsforløpsmodus med én ramme hvert 10. Start det mikroskopiske bildeoppkjøpet og den mikrofluidiske injeksjonsprotokollen samtidig.Åpne Fiji-programvaren og MicrobeJ-plugin-modulen. For snapshot analyse, slipp alle bilder som tilsvarer ett mikroskop lysbilde inn i MicrobeJ lasting bar for å sammenkoble bilder og lagre den oppnådde bildestabler filen. For tidsforløpsdata, bare slipp bildestakken inn i lastelinjen til MicrobeJ.Kjør den automatiserte oppdagelsen av cellens konturer basert på segmentering av fasekontrastbilde og kjør påvisning av nukleider basert på segmentering av det beisede DNA-fluorescerende signalet. Kontroller nøyaktigheten av celledeteksjonen visuelt, og bruk MikrobeJ-redigeringsverktøyet for korrigering om nødvendig. Lagre den oppnådde resultatfilen.Klikk på ikonet ResultJ for å fullføre analysen og få ResultatJ-vinduet. Mange forskjellige typer utdatagrafer genereres. Plott de normaliserte histogrammene av celleform eller lengde og gjennomsnittlig nukleoid nummer per celle.Denne studien analyserte oppførselen til Escherichia coli K-12 celler under forbigående eksponering for cephalexin, et antibiotikum som spesifikt hemmer celledeling. Cellekulturer som vokser i nærvær av cephalexin viste lignende OD600 øker som de ustressede kulturer. Konsentrasjonen av levedyktige celler økte ikke når cephalexin var tilstede.Celler begynte å dele seg igjen når cephalexin ble fjernet og til slutt nådde en konsentrasjon tilsvarende den ustressede kulturen etter to timer. Ulike påkjenninger resulterte i forskjellig frakobling av OD og CFU per milliliter kurver, avhengig av effekten indusert. Eksponering for cephalexin provoserte en parallell økning av cellestørrelse og DNA-innhold.Da cephalexin ble fjernet, reduserte populasjonscellestørrelsen og DNA-innholdet gradvis og ble lik den ustressede befolkningen etter to timer. Cephalexin provoserte dannelsen av lange celler med normal cellebredde da ingen divisjon septa. Kvantitativ bildeanalyse bekreftet cellestørrelsen og DNA-innholdet øker.Time-lapse bilder bekrefter at celle forlengelse og kromosom replikering og segregering ikke ble hemmet av eksponering for cephalexin. Analyse av filamented celle avstamning viste at celledeling startet omtrent 20 minutter etter vask bort stoffet. Det er avgjørende å sørge for at bakteriepopulasjonen er i full eksponentiell vekst før du induserer stressbehandlinger.Stressfremkallende behandling som brukes til disse tilnærmingene kan være farlig for eksperimentell, som gentoksisk forbindelse. Så håndtere sammensatte nøye og bære hanske, maske, briller, og lab pels.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Vekst av Mycobacterium tuberculosis Biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Spytt, spyttkjertel, og Hemolymph Collection fra Ixodes Scapularis Flått

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Adhesion analysen til Study leucocyte Rekruttering til humane Sinus endotelet under forhold med Skjær Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generasjon og Multi-fenotypiske Høy innhold Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In vitro og in vivo modell for å studere bakteriell adhesjon til fartøyet veggen under strømningsforhold

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Metoder for å hemme bakterie Pyomelanin Produksjon og Bestem tilsvarende økning i Følsomhet for oksidativt stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analyse av Adhesjon Under skjærspenning for studier av T-lymfocytter-adhesjonsmolekyl Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

En ny metode for kvalitativ Multi-skala analyse av bakterielle biofilmer på Trådformede soppkolonier Bruke Confocal og elektronmikroskopi

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Immunofluorescensanalyse av stress-granulatdannelse etter bakteriell utfordring av mammalceller

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...