Name: multi-scale analysis of bacterial growth under stress treatments
Uploaded: 2019-11-28T14:30:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments at JoVE.com

Авторы благодарят Ф. Корнеза за предоставление штамма hupA-mCherry, А. Дедье за техническую помощь с цитометрией и А. Дюкре за помощь в MicrobeJ. Финансирование: C. Lesterlin признает Inserm и CNRS учреждений, а также aTIP-Avenir программы, Schlumberger Фонд образования и исследований (FSER 2019), ANR финансирования программы PlasMed исследований (ANR-18-CE35-0008), а также FINOVI для финансирования J. Cayron; La Ligue contre le cancer для финансирования цитометрического оборудования потока. Вклад автора: C.L. и J.C. конструировали процедуру и написали бумагу; J.C. провел эксперименты и проанализировал данные.

<ol>
	<li>Donachie, W. D., Begg, K. J., Vicente, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+length,+cell+growth+and+cell+division.">Cell length, cell growth and cell division.</a> Nature. 264 (5584), 328-333 (1976).</li><li>Donachie, W. D., Blakely, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+the+initiation+of+chromosome+replication+to+cell+size+in+Escherichia+coli.">Coupling the initiation of chromosome replication to cell size in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Microbiology. 6 (2), 146-150 (2003).</li><li>Patterson, D., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Elevated+Temperatures+on+Protein+Synthesis+in+Escherichia+coli.">Effect of Elevated Temperatures on Protein Synthesis in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 112 (3), 1177 (1972).</li><li>Begg, K. J., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+and+division+in+Escherichia+coli:+experiments+with+shape+and+division+mutants.">Cell shape and division in Escherichia coli: experiments with shape and division mutants.</a> Journal of Bacteriology. 163 (2), 615-622 (1985).</li><li>Van De Putte, P., Van Dillewijn, J., Roersch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Selection+of+Mutants+of+Escherichia+Coli+with+Impaired+Cell+Division+at+Elevated+Temperature.">The Selection of Mutants of Escherichia Coli with Impaired Cell Division at Elevated Temperature.</a> Mutation Research. 106, 121-128 (1964).</li><li>Walker, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+characterization+of+temperature-sensitive+cell+division+mutants+of+Escherichia+coli.">Initial characterization of temperature-sensitive cell division mutants of Escherichia coli.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 47 (5), 1074-1079 (1972).</li><li>Lesterlin, C., Duabrry, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Bacterial+Chromosome+Architecture.">Investigating Bacterial Chromosome Architecture.</a> Chromosome Architecture. 1431, 61-72 (2016).</li><li>Stracy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+superresolution+microscopy+reveals+the+organization+of+RNA+polymerase+in+the+bacterial+nucleoid.">Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (32), E4390-E4399 (2015).</li><li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells.">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li><li>Lesterlin, C., Pages, C., Dubarry, N., Dasgupta, S., Cornet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetry+of+chromosome+Replichores+renders+the+DNA+translocase+activity+of+FtsK+essential+for+cell+division+and+cell+shape+maintenance+in+Escherichia+coli.">Asymmetry of chromosome Replichores renders the DNA translocase activity of FtsK essential for cell division and cell shape maintenance in Escherichia coli.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000288 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji+-+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis.">Fiji - an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), (2019).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).</li><li>Rolinson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+beta-lactam+antibiotics+on+bacterial+cell+growth+rate.">Effect of beta-lactam antibiotics on bacterial cell growth rate.</a> Journal of General Microbiology. 120 (2), 317-323 (1980).</li><li>Boye, E., L&#248;bner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+illuminating+microbiology.">Flow cytometry: illuminating microbiology.</a> The New Biologist. 2 (2), 119-125 (1990).</li><li>Rieseberg, M., Kasper, C., Reardon, K. F., Scheper, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+biotechnology.">Flow cytometry in biotechnology.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (3-4), 350-360 (2001).</li><li>Nolivos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+AcrAB-TolC+multidrug+efflux+pump+in+drug-resistance+acquisition+by+plasmid+transfer.">Role of AcrAB-TolC multidrug efflux pump in drug-resistance acquisition by plasmid transfer.</a> Science. 364 (6442), 778-782 (2019).</li><li>Chao, Y., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixation+methods+for+observation+of+bacterial+cell+morphology+and+surface+ultrastructures+by+atomic+force+microscopy.">Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).</li></ol>

Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Необходимо обратить внимание на состояние роста клеток во время процедуры. Расти клетки в течение нескольких поколений, прежде чем достичь полной экспоненциальной фазы. Для успеха этого метода важно, чтобы все образцы клеток собирались одновременно, и лучше всего анализировать только одну обработанную и одну необработанную культуру одновременно. Образцы клеток для микроскопии должны поддерживаться при экспериментальной температуре на протяжении всей процедуры. Затем необходимо разогреть камеру микроскопа и микрофлюидную камеру до начала эксперимента. Если образцы клеток для цитометрии потока не могут быть проанализированы легко, они могут храниться на льду до 6 ч. Инкубация на льду ограничит рост и морфологическую модификацию клеток. Кроме того, пользователь может рассмотреть вопрос об использовании фиксации клеток в этаноле 75%, который обычно рекомендуется для потока цитометрии10. Если протокол требует мытья стресс индуктора из среды, центрифуги и пипетки клетки очень тщательно, чтобы избежать повреждения потенциальных аномальных клеток.
Как цитометрия потока, так и анализ моментальных снимков дают доступ к размеру клеток и параметрам содержания ДНК, при этом снимки обеспечивают дополнительное наблюдение за морфологией клеток. Окрашивание ДНК DAPI10 (4',6-diamidino-2-phenylindole) или другими стабильными красителями ДНК может быть выполнено, если не доступно флуоресцентное слияние для наблюдения ядер в интересуемом организме организма. Если анализ цитометрии потока не может быть выполнен, важно, чтобы изображение и анализ большого количества клеток с помощью микроскопии.
Микроскопическая визуализация также может быть выполнена с использованием штаммов, несущих флуоресцентные слияния белков, участвующих в конкретных путей интереса. Это помогло бы выявить влияние стресса на различные клеточные процессы, такие как репликация, транскрипция, синтез клеточной стенки, или деление клеток. Метод может быть применен к ряду бактериальных видов, единственным требованием является то, что микрофлюидный аппарат должен быть совместим с морфологией клеток. Стандартные микрофлюидные пластины удобны для бактерий стержня с шириной клеток между 0,7 мкм и 4,5 мкм. Тем не менее, кокки, ovococci, или другие бактериальные штаммы с своеобразными формами должны быть проверены. Кроме того, если микрофлюидные эксперименты не могут быть выполнены из-за отсутствия оборудования или несовместимых бактериальных штаммов, замедленное изображение может быть выполнено на агарозных слайдах в течение максимальной продолжительности 2ч.
Общее преимущество этого многомасштабного анализа заключается в том, чтобы обеспечить глобальное видение влияния индукции стресса на несколько аспектов способности роста бактерий (т.е. синтез массы, жизнеспособность клеток, морфология клеток, целостность мембраны, содержание ДНК) и способ они развиваются со временем в бактериальной популяции растет в стрессовых условиях. Это также позволяет анализировать восстановление нормального роста на одноклеточном уровне и уровне популяции. Этот подход применим к широкому кругу видов бактерий и практически к любому виду лечения стресса, например, к воздействию антибиотиков или других противомикробных соединений, анализу влияния взаимодействия с другими организмами на многовидовые населения, или эффект генетической мутации.

Общая цель этого протокола заключается в анализе поведения бактериальных клеток, подверженных стрессовому лечению в популяции и на одноклеточном уровне. Бактериальный рост и жизнеспособность традиционно решаются на уровне популяции с помощью мониторинга оптической плотности (OD600nm),который является прокси синтеза бактериальной массы клеток, или путем покрытия анализы для определения концентрации жизнеспособных клеток в культуре (колонии формирования единицы на миллилитр, CFU / mL). При нормальных (без стресса) условиях выращивания, OD600nm и CFU/mL измерения строго коррелируют, потому что бактериальное удвоение время напрямую зависит от увеличения массы клеток1,2. Однако, эта корреляция часто нарушается в условиях, которые влияют на синтез клеточной массы3, клеточное деление4, или что вызвать лиза клетки. Простой пример обеспечивается стресс лечения, которые подавляют деление клеток, которые приводят к образованию нитевидных бактериальных клеток5,6. Пятковые клетки удлиняются обычно, потому что синтез клеточной массы не влияет, но они не в состоянии разделить на жизнеспособные клетки. Оптическая плотность культуры, следовательно, будет увеличиваться с течением времени с нормальной скоростью, но не концентрацией жизнеспособных клеток, определяемых анализами покрытий (CFU/mL). В этом случае, как и во многих других, оптическая плотность и измерения покрытия являются информативными, но не обеспечивают всестороннего понимания наблюдаемого стрессового эффекта. Эти ансамбль анализы должны быть объединены с одноклеточными методами анализа, чтобы позволить углубленной характеристики стресс-индуцированных недостатков роста.
Здесь описывается процедура, которая сочетает в себе четыре взаимодополняющих экспериментальных подхода: (1) традиционные анализы напольное покрытие и базовый мониторинг оптической плотности для мониторинга жизнеспособности клеток и синтеза клеточной массы, соответственно; (2) цитометрия потока для оценки размера клеток и параметров содержания ДНК на большом количестве клеток; (3) микроскопическая снимка для анализа морфологии клеток; и (4) замедленного одноклеточного изображения в микрофлюидных камерах для изучения временной динамики судьбы клеток. Эта многомасштабная структура позволяет интерпретировать глобальное воздействие на рост клеток и жизнеспособность в свете поведения отдельных клеток. Эта процедура может быть применена для расшифровки реакции различных видов бактерий практически на любой стресс, представляющий интерес, включая рост в особых условиях (т.е. среду роста, рН, температуру, концентрацию соли), или воздействие антибиотиков или других противомикробных соединений.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1613100</td>
			<td>Certified molecular biology agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A24858</td>
			<td>Cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>CAX2-S0000</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ONIX2 1.0.1</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne 96-well plate with lid</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7672-7596</td>
			<td>Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td>Blue frame (125 &#956;L, 1,7 x 2,8 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agarose medium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002232</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>B04A-03-5PK</td>
			<td>Plate for Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2105</td>
			<td>Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S34854</td>
			<td>DNA fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>30034301</td>
			<td>Automated plate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-scale analysis of bacterial growth under stress treatments

Анализ бактериальной способности расти и выживать в стрессовых условиях имеет важное значение для широкого спектра микробиологических исследований. Уместно охарактеризовать реакцию бактериальных клеток на стрессообразующие методы лечения, такие как воздействие антибиотиков или других противомикробных соединений, облучение, нефизиологический рН, температура или концентрация соли. Различные методы лечения стресса могут нарушить различные клеточные процессы, включая деление клеток, репликацию ДНК, синтез белка, целостность мембраны или регулирование клеточного цикла. Эти эффекты, как правило, связаны с конкретными фенотипами в клеточном масштабе. Поэтому понимание масштабов и причинно-следственной связи вызванных стрессом недостатков роста или жизнеспособности требует тщательного анализа нескольких параметров, как на одноклеточном, так и на уровне населения. Экспериментальная стратегия, представленная здесь, сочетает в себе традиционные оптические мониторинга плотности и анализы покрытия с одноклеточными методами анализа, такими как цитометрия потока и микроскопическая визуализация в реальном времени в живых клетках. Эта многомасштабная структура позволяет своевременно описывать влияние стрессовых условий на судьбу бактериальной популяции.

Описанная процедура была использована для анализа поведения клеток Escherichia coli K12 во время преходящего воздействия цефалексина, антибиотика, который специально подавляет деление клеток(рисунок 1А)13. HupA-mCherry E. coli штамм, который производит флуоресцентно помечены HU белка, связанного с хромосомной ДНК был использован для исследования динамики хромосомы на протяжении всего этого лечения8,9. Экспоненциально растущие клетки hupA-mCherry E. coli были проанализированы ранее (т0)и 60 мин после инкубации с цефалексином (т60). Затем антибиотик смыло и было проанализировано восстановление популяции клеток после 1 ч(т 120)и 2 ч (т180)(рисунок 1В).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig1.jpg"> Рисунок 1: Процедура анализа бактериальной реакции на стрессовое лечение. (A) Схема метода. (B) Мультфильм, иллюстрирующие морфологию клеток во время нормального роста в богатой среде и во время преходящего воздействия цефалексина (Цеф.), от добавления на (т0) и после стирки цефалэксина от (t60) до (t180). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Параллельная эволюция OD и CFU/mL является первым индикатором, который помогает понять эффект лечения стресса. Эти два параметра строго коррелируются во время невозмутимого роста, но часто разъединяются и развиваются независимо под стрессом. Клеточные культуры, растущие в присутствии цефалексина выставлены аналогичные OD600nm увеличивается, как без стресса культур(Рисунок 2A), показывая, что препарат не влияет на синтез клеточной массы. Однако концентрация жизнеспособных клеток не увеличивалась при цефалексине из-за строгого ингибирования деления клеток(рисунок 2В). Клетки начали делитьснова когда cephalexin извлекли и окончательн достигли концентрации эквивалентную к unstressed культуре на (t180). Эти результаты отражают бактериостатический эффект цефалеста, который вызывает полностью обратимое ингибирование деления клеток. Различные напряжения приведут к различному разъединению кривых OD и CFU/mL, в зависимости от индуцированного эффекта (например, модификации морфологии клеток, такой как нити или выпуклые, гибель клеток с или без лисиса). Неполный список возможных результатов, свидетельствуют о различных стресс-индуцированных эффектов представлен на рисунке 2C.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig2.jpg"> Рисунок 2: Мониторинг роста бактерий необработанных и цефалэксинобработанных клеток на уровне популяции. (A) Мониторинг оптической плотности (OD600nm/mL). (B) Концентрация жизнеспособных клеток (CFU/mL) в необработанных и цефалексин-60мин обработанных культур. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение для экспериментального тройного. (C) Схема возможных результатов и связанных с ними стрессовых эффектов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Одноклеточный анализ необходим для точной интерпретации реакции на стресс, наблюдаемой на уровне населения. Цитометрия потока позволяет изучить размер клетки и содержание ДНК нескольких тысяч клеток14,15 (рисунок 3). Воздействие цефалексина спровоцировало параллельное увеличение размера клеток и содержания ДНК (т60). Когда цефалексин был удален, размер клеток популяции и содержание ДНК постепенно уменьшались, чтобы стать похожими на ненапряженную популяцию наt 180. Эти результаты показывают, что цефалексин не препятствовал репликации ДНК и спровоцировал образование нитевидных клеток, содержащих несколько хромосомных эквивалентов. Эти нити делятся на клетки с нормальным размером клеток и содержанием ДНК, когда препарат был смыт. Результаты цитометрии потока будут очень разными для стрессов, которые подавляют синтез ДНК, которые приводят к образованию нитевидных клеток, содержащих только одну нереплицирующую хромосому. В этом случае размер клеток будет увеличиваться аналогичным образом, но не будет связан с увеличением содержания ДНК.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig3.jpg"> Рисунок 3: Представитель ный анализ цитометрии потока необработанных и цефалэксин-60мин обработанных клеток. (A) Гистограммы распределения размеров клеток (FSC-H). (B) Гистограммы содержания ДНК (FL1-SYTO9). n - проанализировано 120 000 клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Снимок микроскопии изображения был использован для изучения морфологии клеток и внутриклеточной организации ДНК показано HU-mCherry локализации (Рисунок 4A). Цефалексин спровоцировал образование длинных клеток с нормальной шириной клеток и отсутствием делениессты. Эти гладкие нити содержали регулярно расположенные структуры ДНК, называемые нуклеоидами, подтверждая, что цефалексин не влияет на репликацию и сегрегацию хромосом. Количественный анализ изображений в значительной степени подтвердил размер клетки и увеличение содержания ДНК, ранее наблюдаемое с цитометрией потока(рисунок 4B,C). Результаты будут очень разными для стрессов, которые вызывают повреждение ДНК, которые приводят к образованию нитевидных клеток, в которых репликация продолжается, но сегрегация нарушается. В этом случае размер клеток и содержание ДНК будут увеличиваться аналогичным образом, но клетки будут питать единую неструктурированную массу ДНК. Снимки могут также выявить другие виды аномальных форм клеток или наличие мини, ануклиата или лисердных клеток (клеток-призраков).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig4.jpg"> Рисунок 4: Микроскопия снимок анализа необработанных и цефалексин-60min обработанных клеток. (A) Представитель микроскопии изображения, показывающие фазовый контраст (серый) и HU-mCherry сигнал (красный). (B) Гистограммы распределения длины клетки. Шкала бар No 5 мкм. (C) Гистограммы числа нуклеоидов на клетку. Для каждого образца было проанализировано от 800 до 2000 клеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Микроскопия, связанная с микрофлюидным аппаратом16, помогла определить ранее наблюдаемые фенотипы и дает дополнительные сведения о развитии и причинно-следственной связи дефицита роста. Time-lapse изображения(Рисунок 5A и фильм 1) подтвердили, что удлинение клеток (синтез клеточной массы), и хромосома репликации и сегрегации не были ингибированы воздействием цефалексина. Кроме того, он показал процесс восстановления, когда цефалексин был удален. Анализ нитевидной линии клеток показал, что деление клеток перезапускается на 20 мин после смывания препарата(рисунок 5В). В результате разделенные клетки были жизнеспособными, потому что они, в свою очередь, разделились, что в конечном итоге привело к образованию 33 клеток, демонстрирующих нормальный размер и содержание ДНК. Это позволило просчитать общее время генерации в размере 31 мин в течение 180 мин эксперимента, что аналогично времени генерации, рассчитанной для неподчеркнутой популяции из измерений CFU/mL (33 мин).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig5.jpg"> Рисунок 5: Микроскопия покадрового анализа цефалэксин-60мин обработанных клеток. (A) Представитель микроскопии изображения, показывающие фазовый контраст (серый) и HU-mCherry сигнал (красный). Контролируемой нитевидной ячейки указывается белый контур, и разделенные клетки разными цветами. Шкала бар No 5 мкм. (B) Схематическое представление нитевидной линии клеток, соответствующих панели (A) и фильм 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/60576/60576vid1.jpg"> Фильм 1: Микрофлюидический фильм E. coli HU-mCherry лечится цефалексином. Cephalexin был введен после 60 мин, а затем инъекции свежей среды RDM в течение 3 ч. Время, указанное желтым (1 кадр каждые 10 мин). Шкала бар No 5 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/Movie1.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео (право нажмите, чтобы скачать).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments at JoVE.com

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Этот протокол позволяет улавливаться описанием роста бактерий в стрессовых условиях на одноклеточных и клеточных уровнях населения.

Многомасштабный анализ роста бактерий при стрессовом лечении

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

Общая цель этого метода заключается в анализе влияния лечения стресса на бактериальные клетки, как на одной клетке, так и на уровне населения. Он обеспечивает глобальное видение влияния стресса на несколько аспектов роста бактерий, включая жизнеспособность клеток, морфологию и содержание ДНК. Это также позволяет охарактеризовать восстановление населения.Этот метод может быть использован в фармацевтической промышленности для проверки активности новой молекулы противомикробных препаратов и оценить их влияние на жизнеспособность и рост бактерий. Стресс-индуцирующего лечения имеет неэффективность, такие как доза и зависит от времени. Возможно, необходимо провести предварительные тесты, чтобы определить оптимальную дозу и продолжительность лечения до начала этого протокола.Визуальная демонстрация этого метода позволяет изнять важные детали каждого важного шага и как выполнить их должным образом. Для начала, привить пять миллилитров MOPS E'Rich Defined Medium с одной колонией E.Coli MG1655 HU-PAmCherry и расти при 37 градусах по Цельсию с встряхивания на 140 вращений в минуту на ночь. На следующее утро извлечь 100 микролитров образца и разбавить его 900 микролитров среднего для измерения оптической плотности на 600 нанометров.Затем разбавьте культуру в пробирку, содержащую свежую среду до OD600 нанометров 0,01. Инкубировать привитую пробирку при 37 градусах по Цельсию при тряске при 140 об/мин до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет 0,2, что соответствует полной экспоненциальной фазе в богатой среде. Затем, aliquot образцы культуры для покадровой микроскопии изображения, разбавления и покрытия анализа, анализ цитометрии потока, и микроскопии снимок изображения.Выставить оставшиеся 4,4 миллилитров клеточной культуры в пробирке для специфического лечения стресса. Например, 4,4 микролитера цефалексина по пять микрограмм на миллилитр и инкубируют при 37 градусах Цельсия при тряске при 140 об/мин. Подготовка десятикратных серийных разбавлений, до 10 до минус седьмой, из 200 микролитров образца культуры в свежей среде.Смешайте между каждым разбавлением, очень нежным вихрем или инвертированием трубки. Плита 100 микролитров соответствующего разбавления на не отобранных пластинах LB агарозы и инкубировать на ночь при 37 градусах по Цельсию. На следующий день подсчитайте количество колоний, чтобы определить концентрацию жизнеспособных клеток в каждом образце культуры.Участок CFU на миллилитр, как функция времени для необработанных и обработанных клеточных культур. Измерьте OD600 культуры на спектрофотометре. Разбавить образец культуры свежей средой при четырех градусах по Цельсию, чтобы получить образец с OD600 на уровне 0,06, что соответствует примерно 15 000 клеток на микролитер.Для окрашивания ДНК смешайте разбавленный бактериальный образец с раствором 10 микрограмм на миллилитр флуоресцентного красителя в объемном рационе один к одному и инкубировать в темноте в течение 15 минут. Перед инъекцией образца смешайте образец очень нежным вихрем или инвертированием трубки. Перевечь образец в цитометр потока со скоростью потока около 120 000 клеток в минуту.Приобретайте рассеянный вперед и рассеянный по стороне свет, а также флуоресцентный краситель/флуоресцентный сигнал ДНК с соответствующими настройками. Участок вперед рассеянной плотности клеток гистограммы для представления распределения размера клетки и участок ДНК флуоресцентный краситель / флуоресцентные сигнальные клетки плотности гистограммы для представления содержания ДНК в популяции клеток. Во-первых, разогреть термостатированную камеру микроскопа при температуре 37 градусов по Цельсию, чтобы стабилизировать температуру.Подготовь слайды, установленные на агарозе, как описано в рукописи. Поместите слайд на сцену микроскопа и выполните получение изображения с помощью передаваемого света с целью контрастности лица и с возбуждением источника света на 560 нанометров для mCherry. Выберите поля зрения, содержащие изолированные ячейки, чтобы облегчить автоматическое обнаружение ячеек во время анализа изображений.Убедитесь, что по крайней мере 300 клеток изображены, чтобы обеспечить надежный статистический анализ популяции клеток. Во-первых, удалить решение сохранения из микрофлюидной пластины и заменить его свежей среде разогретой до 37 градусов по Цельсию, как описано в Microfluidic Software User Guide. Прикрепите микрофлюидную пластину к многообразной системе.А в микрофлюидном программном обеспечении нажмите на кнопку Seal, чтобы запечатать на пластине многообразную систему. После этого нажмите на кнопку Priming. Распогрейте микрофлюидную пластину с многообразной системой на стадии микроскопа и разогрейте при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов, чтобы избежать расширения микрофлюидной камеры.Запечатайте микрофлюидную пластину на микрофлюидной системе, нажав на кнопку Seal Off. Замените среду из восьми хорошо с 150 микролитров образца культуры и заменить средний от одного до пяти с желаемой среде, с или без стресс-индуцирующих реагент. Печать микрофлюидной пластины и поместите его на стадии микроскопа.В микрофлюидной программе запустите процедуру загрузки клеток. Убедитесь, что загрузка клеток является удовлетворительным, глядя под микроскопом в передаваемом свете. Тщательно сосредоточьтесь в режиме передаваемого света и выберите несколько полей зрения, которые показывают изолированные бактерии и не переполнены, около 10 до 20 клеток на 100 квадратных микролитров.В микрофлюидного программного обеспечения, нажмите на кнопку Run пользовательской последовательности, а затем запрограммировать инъекцию стресса вызывающих среды в течение 10 минут на двух PSI, а затем инъекции в одном PSI в течение длительного времени лечения стресса. Выполняйте микроскопию в замедленном режиме с одним кадром каждые 10 минут, используя фазовую контрастность в передаваемом свете и 560 нанометровый источник света для сигнала mCherry, если это необходимо. Запустите приобретение микроскопического изображения и протокол микрофлюидной инъекции одновременно.Откройте программное обеспечение Фиджи и плагин MicrobeJ. Для анализа снимков опустите все изображения, соответствующие одному микроскопу, в бар загрузки MicrobeJ, чтобы сокатить изображения и сохранить полученный файл стеков изображений. Для данных замедленного действия просто опустите стек изображения в планку загрузки MicrobeJ.Запустите автоматизированное обнаружение контуров клетки на основе сегментации фазового контрастного изображения и запустите обнаружение нуклеоидов на основе сегментации окрашенного флуоресцентного сигнала ДНК. Проверьте точность визуального обнаружения ячейки и при необходимости используйте инструмент редактирования MicrobeJ для коррекции. Сохранить полученный файл результата.Нажмите на значок ResultJ, чтобы завершить анализ и получить окно ResultJ. Генерируется множество различных типов выходных графиков. Участок нормализованных гистограмм формы клетки или длины и среднего нуклеоидного числа на клетку.Это исследование проанализировало поведение клеток Escherichia coli K-12 во время переходного воздействия цефалексина, антибиотика, который специально подавляет деление клеток. Клеточные культуры, растущие в присутствии цефалексина, проявляли аналогичные увеличения OD600 по мере того, как неподготовляемые культуры. Концентрация жизнеспособных клеток не возрастала при присутствуют цефалексин.Клетки начали делиться снова, когда цефалексин был удален и в конечном итоге достигли концентрации, эквивалентной неподступной культуре через два часа. Различные напряжения привели к различным разгермевания OD и CFU на миллилитр кривых, в зависимости от эффекта индуцированных. Воздействие цефалексина спровоцировало параллельное увеличение размера клеток и содержания ДНК.Когда цефалексин был удален, размер клеток популяции и содержание ДНК постепенно уменьшались и стали похожи на неподдерживаемую популяцию через два часа. Цефалексин спровоцировал образование длинных клеток с нормальной шириной клеток, тогда не было деления септы. Количественный анализ изображений подтвердил увеличение размера клетки и содержания ДНК.Покадровые изображения подтверждают, что удлинение клеток и репликация хромосом и сегрегация не были ингибированы воздействием цефалексина. Анализ линии нитей клеток показал, что деление клеток возобновилось примерно через 20 минут после смывания препарата. Очень важно, чтобы убедиться, что бактериальная популяция находится в полном экспоненциальном росте, прежде чем вызывать стресс лечения.Стресс-индуцирующего лечения, используемого для этих подходов может быть опасным для экспериментальных, как генотоксические соединения. Так обрабатывать соединения тщательно и носить перчатки, маски, очки, и лабораторные пальто.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Рост Микобактерий туберкулеза Биопленки

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Слюна, слюнные железы, и гемолимфы Коллекция от иксодовых клещей Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Расход Адгезия Анализ по изучению лейкоцитов набора на человека печеночных синусоидальных эндотелия в условиях напряжения сдвига

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Генерация и нескольких фенотипическая Скрининг высокого содержания<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; транспозонов мутанты

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

В пробирке и в естественных моделью для изучения бактериальной адгезии к стенке сосуда в проточных условиях

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Методы подавления бактериального Pyomelanin Производство и определить соответствующую увеличению чувствительности к окислительному стрессу

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Анализ адгезии при сдвиге стресса для изучения Т-лимфоцитами взаимодействий молекул адгезии

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Новый метод для качественного многомасштабном анализа Бактериальный биопленок на нитчатых конидий с помощью конфокальной и электронной микроскопии

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Иммунофлуоресцентный анализ образования гранулята после бактериальной выделения клеток млекопитающих

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...