Name: multi-scale analysis of bacterial growth under stress treatments
Uploaded: 2019-11-28T14:30:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments at JoVE.com

Yazarlar HupA-mCherry suşu sağlamak için F. Cornet teşekkür, Sitometri ile teknik yardım için A. Dedieu, ve A. Ducret MicrobeJ ile yardım için. Finansman: C. Lesterlin, Inserm ve CNRS kurumlarının yanı sıra ATIP-Avenir programı, Schlumberger Eğitim ve Araştırma Vakfı (FSER 2019), PlazMed araştırma programı (ANR-18-CE35-0008) için ANR finansmanı ve J. Cayron'a kaynak sağlamak için FINOVI'yi kabul eder; Akış sitometre ekipman finansmanı için La Ligue contre le kanser. Yazar katkıları: C.L. ve J.C. prosedürü tasarladı lar ve makale yazdılar; J.C. deneyleri yaptı ve verileri analiz etti.

1. Hücre kültürü, stres indüksiyonu ve örnekleme prosedürü
NOT: Arka plan parçacıklarından kaçınmak için steril kültür cam takımları, pipet uçları ve 0,22 m'de filtrelenmiş büyüme ortamı kullanın. Burada, hücre kültürleri düşük otofloresan zengin tanımlanmış ortamda yetiştirilir (Malzeme Tablosubakınız )7,8.
<ol><li>Bir Luria-Broth (LB) agarose plaka (gerekirse seçici antibiyotik ile) ve 37 ° C gecede (17 saat) inkübat üzerinde dondurulmuş gliserol stok ilgi bakteriyel zorlanma çizgi. NOT: Burada sunulan örnek deneyde Escherichia coli MG1655 hupA-mCherry kullanabilirsiniz. Bu tür, HU nükleoid ilişkili proteinin floresan etiketli α alt birimini üreterek canlı hücrelerdeki kromozomun ışık mikroskobu görselleştirilmesine olanak sağlar9.</li>
	<li>Tek bir koloni ile orta 5 mL aşılamak ve 37 °C dakikada 140 dönüş (rpm) gecede (17 saat) sallayarak büyümek. Çalkalanan kültürün tatmin edici bir şekilde aeretilmesini sağlamak için şişeler (≥50 mL) veya büyük çaplı (≥2 cm) test tüpleri kullanılmalıdır.</li>
	<li>Ertesi sabah 600 nm (OD600nm)optik yoğunluğu ölçmek ve 0,01 bir OD600nm taze orta içeren bir test tüpü içine kültürü seyreltmek. Kültürün toplam hacmi, deney sırasında analiz edilecek zaman noktalarının sayısına bağlı olarak ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Kültürün 200 μL'lik bir örneğini bir mikro plakaya (şeffaf bir alt kısımla çalışma hacminin kuyusu başına 0,2 mL) yükleyin ve 37 °C'de kuluçka sırasında OD600nm izleme için otomatik bir plaka okuyucusuna (Bkz. Malzeme Tablosunabakın).</li>
	<li>Aşılanmış test tüpünü 37 °C'de sallayarak (140 rpm) OD600nm = 0.2'ye inkütün, zengin ortamda tam üstel faza karşılık gelen. NOT: Uygun üstel büyüme elde etmeden önce en az 4−5 nesil boyunca hücreleri büyütmek çok önemlidir. Adım 1.3'te kullanılan ilk inokül (OD600nm = 0,01) daha yoksul ortamda büyüme durumunda (örneğin, üstel fazın OD 0.2'nin altına ulaştığı durumlarda) veya daha fazla nesil isteniyorsa (örn. belirli fizyolojik çalışmalar veya genişletilmiş stres tedavileri için) uyarlanmalıdır.</li>
	<li>OD600nm = 0.2'de, t0 zaman noktasına karşılık gelen aşağıdaki kültür örneklerini alın (stres indüksiyonundan önce katlanarak büyüyen hücreler): (1) Zaman atlamalı mikroskopi görüntüleme için mikroakışkan cihaza hemen yüklenmek üzere 150 μL'lik bir numune (bkz. bölüm 2); (2) Seyreltme ve kaplama taslısı için 200 μL'lik bir numune (bkz. bölüm 3); (3) Akış sitometrisi analizi için buza konulacak 250 μL numune (bölüm 4); (4) Mikroskop anlık görüntüleme için agarose monte edilmiş bir slayta hemen 10 μL'lik bir numune yatırılmalıdır (bkz. bölüm 5).</li>
	<li>Test tüpünde kalan hücre kültürünü, 37 °C'de titreyerek (140 rpm) araştırmak ve kuluçkaya yatırmak istediğiniz özel stres tedavisine maruz bırakın. NOT: OD600nm izleme için otomatik plaka okuyucuda büyüyen kültür de stres tedavisine tabi tutulmalıdır.</li>
	<li>Stres tedavisinden sonra ilgili zaman noktalarında (t1, t2, t3, vb.), stresli kültürden aşağıdaki hücre örneklerini alın: (1) Seyreltme ve kaplama tsay için 200 μL numune (bkz. bölüm 2); (2) Akış sitometri analizi için buza konulması gereken 250 μL'lik bir numune (bölüm 3); (4) Mikroskopi enstantane görüntülemesi için agarose monte edilmiş bir slayta hemen 10 μL'lik bir numune yatırılmalıdır (bkz. bölüm 4). NOT: Her stresin neden olduğu tedavidoz ve zamana bağlı bir verime sahiptir. Bu nedenle, optimal sonuçlar için kullanılacak tedavinin dozu ve süresini belirlemek için ön testler inyapılması gerekebilir. Bu dozlar ve maruz kalma süreleri bir dizi ile tedavi bir hücre kültürünün otomatik bir plaka okuyucu (potansiyel kaplama tahlilleri ile ilişkili) kullanarak OD izleme gerçekleştirerek yapılabilir. Burada sunulan deneyde hücre kültürü hücre bölünmesi inhibe edici antibiyotik sefalikin (Ceph.) ile 5 μg/mL son konsantrasyonda 60 dk ile tedavi edildi. Cephalexin daha sonra santrifüj (475 g, 5 dk) kullanarak 15 mL'lik bir tüpteki hücreleri peletleyerek, süpernatantı çıkararak, hücre peletini nazik pipetleme ile eşit hacimde taze ortamda yeniden sulandırarak ve temiz bir tüpe aktararak yıkandı. Yıkanan hücreler 37 °C'de, iyileşmek için sallayarak (140 rpm) kuluçkaya yatırıldı. Örnek t60 (60 dk sonra sefaleksin ilavesi 'sefaleksin-60min tedavi' örneğine karşılık gelen, t120 (60 dk yıkadıktan sonra) ve t180 (yıkamadan sonra 120 dk) olarak alınmıştır.</li>
</ol>2. Kaplama tsay
NOT: Kaplama tonu, kültür örneklerinde CFU üretebilen hücrelerin konsantrasyonunu ölçmeye olanak sağlar. Bu işlem, bir hücrenin iki canlı hücreye bölünme hızını ortaya çıkarır ve hücre bölünmesi tutuklamalarını (örn. hücre lizisinin bakteri üretim süresinin artması) saptamaya olanak tanır.
<ol><li>200 μL'lik kültür numunesinin 10-7'sine kadar 10 kat seri seyreltmeleri taze ortamda hazırlayın. 37 °C'de gece kuluçkadan sonra 3−300 koloni arasında elde etmek için seçici olmayan LB agarose plakaları üzerinde uygun seyreltme plakası 100 μL. NOT: Bakteri bölünmelerini sınırlamak için taze ortamda seri seyreltme hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Alternatif olarak, araştırmacılar seyreltme işlemi sırasında hücre bölünmelerini önlemek için bir karbon kaynağı olmadan tuzlu bir çözüm kullanarak düşünebilirsiniz.</li>
	<li>Ertesi gün, her kültür örneğinde canlı hücrelerin (CFU/mL) konsantrasyonunu belirlemek için kolonilerin sayısını sayın. Tedavi edilmemiş ve tedavi edilen hücre kültürleri için zamanın bir fonksiyonu olarak CFU/mL'yi çizin.</li>
</ol>3. Akış sitometrisi
NOT: Aşağıdaki bölümde akış sitometri sitometrisi analizi için hücre örneklerinin hazırlanması açıklanmaktadır. Bu analiz tekniği çok sayıda hücre için hücre büyüklüğü ve DNA içeriğinin dağılımını ortaya koymaktadır. Mümkün olduğunda, akış sitometri örneklerinin hemen işlenmesi tavsiye edilir. Alternatif olarak, numuneler buzüzerinde tutulabilir (6 saate kadar) ve gün sonunda aynı anda analiz edilebilir, kaplama ve mikroskopi görüntüleme yapıldıktan sonra.
<ol><li>250 μL kültür örneğini seyreltin ve 4 °C'de taze ortamda ~15.000 hücre/μL konsantrasyonda (OD600nm ~0.06'ya karşılık gelen) 250 μL elde edin. NOT: Buz üzerinde kuluçka hücrelerin büyüme ve morfolojik modifikasyon usınırlar. Alternatif olarak, kullanıcı genellikle akış sitometri10için tavsiye edilir, % 75 etanol hücrelerin fiksasyon gerçekleştirmeyi düşünebilirsiniz.</li>
	<li>DNA boyama için, bakteri örneğini DNA floresan boyanın 10 μg/mL çözeltisi (oran 1:1) ile karıştırın ve numuneyi analiz etmeden önce karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>~ 120.000 hücre / dk akış hızı ile akış sitometre içine örnek geçirin. Uygun ayarlarla ileriye dağılmış (FSC) ve yan lara dağılmış (SSC) ışığın yanı sıra DNA floresan boya floresan floresan sinyali (FL-1) edinin.</li>
	<li>FSC ve FL-1 hücre yoğunluğu histogramlarını, hücre popülasyonundaki hücre büyüklüğü ve DNA içeriğinin dağılımını temsil edecek şekilde çizin.</li>
</ol>4. Enstantane mikroskopi görüntüleme
NOT: Aşağıdaki bölümde nüfus anlık analizi için mikroskopi slaytlarının hazırlanması ve görüntü edinimi açıklanmaktadır. Bu prosedür, hücrelerin morfolojisi (hücre uzunluğu, genişliği, şekli) ve nükleoid DNA'nın hücre içi organizasyonu ile ilgili bilgi sağlayacaktır.
<ol><li>Gözlemlere başlamadan önce sıcaklığı dengelemek için termosesmikroskop haznesini 37 °C'de önceden ısıtın. Bu oda, zaman atlamalı deneyler sırasında mikroskop optiklerinin ve numune aşamasının sıcaklık modülasyonuna izin verir.</li>
	<li>Lesterlin ve Dubarry7'deaçıklandığı gibi agarose monte edilmiş slaytları hazırlayın.<ol>
<li>Plastik filmi mavi çerçevenin altından çıkarın (Bkz. Malzemeler Tablosu),diğer tarafta içi boş plastik film bırakarak. Mavi çerçeveyi mikroskop cam slaytına yapıştırın.</li>
		<li>Pipet ~150 μL eritilmiş % 1 agarose orta çözelti ve mavi çerçeve bölmesi içinde dökün. Hızla aşırı sıvı kaldırmak için temiz bir coverslip ile kapak ve oda sıcaklığında katılaşmak için agarose ped için birkaç dakika bekleyin.</li>
		<li>Hücre örneği hazır olduğunda, kapak kayslipini ve plastik filmi mavi çerçeveden çıkarın. Agarose pedüzerine 10 μL'lik hücre örneğini dökün ve damlacığı yaymak için cam kaydırağı hafifçe yatırın. Tüm sıvı adsorbe edildiğinde, numuneyi mühürlemek için mavi çerçeveye temiz bir kapak kaydırın. Mikroskopi slaytı artık mikroskopi için hazır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin ve iletilen ışığı kullanarak (faz kontrastı hedefiyle) ve ışık kaynağı uyarma ile uygun dalga boylarında (mCherry için 560 nm) görüntü edinimi gerçekleştirin.</li>
	<li>Görüntü analizi sırasında otomatik hücre algılamasını kolaylaştırmak için yalıtılmış hücreler içeren görünüm alanlarını seçin. Hücre popülasyonunun sağlam istatistiksel analizine olanak sağlamak için en az 300 hücrenin görüntülendirilediğinden emin olun.</li>
</ol>5. Mikroakışkanlar zaman atlamalı mikroskopi görüntüleme
NOT: Aşağıdaki bölümde mikroakışkan plakaların hazırlanması (Bkz. Malzeme Tablosu),hücre yüklemesi, mikroakışkanprogramı ve zaman atlamalı görüntü edinimi açıklanmaktadır. Bu görüntüleme prosedürü gerçek zamanlı olarak tek tek hücrelerin davranışını ortaya koymaktadır.
<ol><li>Koruma çözeltisini mikroakışkan plakadan çıkarın ve mikroakışkan yazılım kullanım kılavuzunda açıklandığı gibi önceden ısıtılmış 37 °C'ye kadar taze orta ile değiştirin.</li>
	<li>Mikroakışkan plakayı manifold sistemine kapatın ve Priming düğmesine tıklayın.</li>
	<li>Mikroakışkan plakayı manifold sistemi yle mikroskop aşamasına yerleştirin ve mikroskobu edinmeye başlamadan önce 37 °C'de ~2 saat önceden ısıtın. NOT: Bu ön ısıtma adımı mikroakışkan haznenin genişlemesini önlemek için önemlidir, bu da zaman atlamalı deney sırasında mikroskobun odaklaşmasını ve görüntü ediniminin tehlikeye atılmasını değiştirir.</li>
	<li>Mikroakışkan plakayı kapatın. Ortayı kuyu 8'den 150 μL kültür örneği ile değiştirin ve ortayı 1'den 5'e kadar istediğiniz ortamla veya strese neden edici reaktifolmadan değiştirin.</li>
	<li>Mikroakışkan plakayı kapatın ve mikroskop aşamasına yerleştirin.</li>
	<li>Mikroakışkan yazılımda (bkz. Malzemeler Tablosu)hücre yükleme işlemini çalıştırın. Aktarılan ışıkta mikroskop altına bakarak hücrelerin yüklenmesinin tatmin edici olup olmadığını kontrol edin. Bölmedeki hücre yoğunluğu yetersizse hücre yükleme işlemini ikinci kez çalıştırın.</li>
	<li>İletilen ışık modunda dikkatlice odaklanın ve izole edilmiş bakterileri gösteren çeşitli görüş alanlarını seçin. Zaman içinde yalıtılmış hücrelerin büyümesini izleyebilmek için aşırı kalabalık olmayan alanları seçmek önemlidir (~100 μm2'de ~10−20 hücre önerilir). Bu da görüntü analizi sırasında hücre algılama kolaylaştıracaktır.</li>
	<li>Mikroakışkan yazılımda Protokol Oluştur düğmesine tıklayın. Hücrelerin uyum sağlaması için 1−2 nesil zaman eşdeğerleri için büyüme ortamının enjeksiyonu program (isteğe bağlı). Daha sonra 2 psi 10 dakika boyunca stres indükleyen orta enjeksiyon programı, stres tedavisi nin istenen süre için 1 psi enjeksiyon ardından. Eğer stres ten sonra hücrelerin iyileşme analiz etmek niyetinde, program taze büyüme orta istenen süre için enjeksiyon. NOT: Burada sunulan deneyde sefaleksin 2 psi'de 10 dakika, ardından 1 psi'de 50 dk enjekte edildi. Daha sonra, taze büyüme ortamı 10 dakika için 2 psi enjekte edildi, 1 psi 3 saat izledi.</li>
	<li>İletilen ışıkta faz kontrastı ve gerekirse mCherry sinyali için 560 nm uyarma ışık kaynağı kullanarak her 10 dakikada bir 1 kare ile hızlandırılmış modda mikroskopi görüntüleme yapın. NOT: Mikroskobik enjeksiyon protokolünün başlamasıyla aynı anda mikroskobik görüntü edinimi nin başlatılması önemlidir.</li>
</ol>6. Görüntü analizi
NOT: Bu bölümde, anlık görüntü ve hızlandırılmış mikroskopi görüntülerinin işlenmesi ve analiz edilmesinin temel adımları kısaca açıklanmaktadır. Mikroskopi görüntülerinin açılması ve görüntülenmesi açık kaynak ImageJ/Fiji (https://fiji.sc/)11ile yapılır. Kantitatif görüntü analizi ücretsiz MicrobeJ eklentisi12 (https://microbej.com) ile birlikte açık kaynak ImageJ / Fiji yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Bu protokol MicrobeJ 5.13I sürümünü kullanır.
<ol><li>Fiji yazılımını ve MicrobeJ eklentisini açın.</li>
	<li>Anlık görüntü analizi için, görüntüleri bir araya getirmek ve elde edilen görüntü yığınları dosyasını kaydetmek için bir mikroskop slaytına (bir örnek) karşılık gelen tüm görüntüleri MicrobeJ yükleme çubuğuna bırakın. Hızlandırılmış veriler için görüntü yığınını MicrobeJ yükleme çubuğuna bırakmanın.</li>
	<li>Hücre anahatlarının faz kontrast ı görüntüsünün ve ilgiliyse nükleoidlerin lekeli DNA floresan sinyalinin segmentasyonuna dayalı olarak otomatik olarak algılanmasını çalıştırın. Hücre algılamanın doğruluğunu görsel olarak kontrol edin ve gerekirse düzeltme için MicrobeJ düzenleme aracını kullanın. Elde edilen sonuç dosyasını kaydedin. NOT: E. coli hücrelerinin tespiti için kullanılan ayarlar Malzeme Tablosu'nda belirtilmiştir (bkz. MicrobeJ'in Yorumlar/Açıklama sütunu). Diğer bakteri türleri için (özellikle çubuk şeklinde olmayan bakteriler için), kullanıcı algılamadan önce ayarları hassaslaştırmalıdır (Bkz. MicrobeJ öğretici). Hızlandırılmış görüntüler için, microbeJ düzenleme aracını kullanarak hücrelerin yarı otomatik olarak algılanması, tek tek hücrelerin kaderine odaklanılmasıiçin tercih edilebilir (bkz.</li>
	<li>Analizi tamamlamak ve ResultJ penceresini elde etmek için ResultJ simgesine tıklayın. Bu noktadan birçok farklı türde çıktı grafiği oluşturulabilir. Hücre şekli/uzunluğu ve hücre başına ortalama nükleoid sayısının normalleştirilmiş histogramlarını çizin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Donachie, W. D., Begg, K. J., Vicente, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+length,+cell+growth+and+cell+division.">Cell length, cell growth and cell division.</a> Nature. 264 (5584), 328-333 (1976).</li><li>Donachie, W. D., Blakely, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+the+initiation+of+chromosome+replication+to+cell+size+in+Escherichia+coli.">Coupling the initiation of chromosome replication to cell size in Escherichia coli.</a> Current Opinion in Microbiology. 6 (2), 146-150 (2003).</li><li>Patterson, D., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Elevated+Temperatures+on+Protein+Synthesis+in+Escherichia+coli.">Effect of Elevated Temperatures on Protein Synthesis in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 112 (3), 1177 (1972).</li><li>Begg, K. J., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+and+division+in+Escherichia+coli:+experiments+with+shape+and+division+mutants.">Cell shape and division in Escherichia coli: experiments with shape and division mutants.</a> Journal of Bacteriology. 163 (2), 615-622 (1985).</li><li>Van De Putte, P., Van Dillewijn, J., Roersch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Selection+of+Mutants+of+Escherichia+Coli+with+Impaired+Cell+Division+at+Elevated+Temperature.">The Selection of Mutants of Escherichia Coli with Impaired Cell Division at Elevated Temperature.</a> Mutation Research. 106, 121-128 (1964).</li><li>Walker, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+characterization+of+temperature-sensitive+cell+division+mutants+of+Escherichia+coli.">Initial characterization of temperature-sensitive cell division mutants of Escherichia coli.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 47 (5), 1074-1079 (1972).</li><li>Lesterlin, C., Duabrry, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Bacterial+Chromosome+Architecture.">Investigating Bacterial Chromosome Architecture.</a> Chromosome Architecture. 1431, 61-72 (2016).</li><li>Stracy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+superresolution+microscopy+reveals+the+organization+of+RNA+polymerase+in+the+bacterial+nucleoid.">Live-cell superresolution microscopy reveals the organization of RNA polymerase in the bacterial nucleoid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (32), E4390-E4399 (2015).</li><li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells.">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li><li>Lesterlin, C., Pages, C., Dubarry, N., Dasgupta, S., Cornet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetry+of+chromosome+Replichores+renders+the+DNA+translocase+activity+of+FtsK+essential+for+cell+division+and+cell+shape+maintenance+in+Escherichia+coli.">Asymmetry of chromosome Replichores renders the DNA translocase activity of FtsK essential for cell division and cell shape maintenance in Escherichia coli.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000288 (2008).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji+-+an+Open+Source+platform+for+biological+image+analysis.">Fiji - an Open Source platform for biological image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), (2019).</li><li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicrobeJ,+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis.">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).</li><li>Rolinson, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+beta-lactam+antibiotics+on+bacterial+cell+growth+rate.">Effect of beta-lactam antibiotics on bacterial cell growth rate.</a> Journal of General Microbiology. 120 (2), 317-323 (1980).</li><li>Boye, E., L&#248;bner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+illuminating+microbiology.">Flow cytometry: illuminating microbiology.</a> The New Biologist. 2 (2), 119-125 (1990).</li><li>Rieseberg, M., Kasper, C., Reardon, K. F., Scheper, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+biotechnology.">Flow cytometry in biotechnology.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 56 (3-4), 350-360 (2001).</li><li>Nolivos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+AcrAB-TolC+multidrug+efflux+pump+in+drug-resistance+acquisition+by+plasmid+transfer.">Role of AcrAB-TolC multidrug efflux pump in drug-resistance acquisition by plasmid transfer.</a> Science. 364 (6442), 778-782 (2019).</li><li>Chao, Y., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+fixation+methods+for+observation+of+bacterial+cell+morphology+and+surface+ultrastructures+by+atomic+force+microscopy.">Optimization of fixation methods for observation of bacterial cell morphology and surface ultrastructures by atomic force microscopy.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 92 (2), 381-392 (2011).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip çıkarları ilan etti.

Bu işlem sırasında hücrelerin büyüme durumuna dikkat etmek esastır. Tam bir üstel aşamaya ulaşmadan önce birkaç nesil boyunca hücreleri büyütün. Bu yöntemin başarısı için, tüm hücre örneklerinin aynı anda toplanması önemlidir ve aynı anda sadece bir tedavi ve bir işlenmemiş kültürü analiz etmek en iyisidir. Mikroskopi görüntüleme için hücre örnekleri işlem boyunca deneysel sıcaklıkta muhafaza edilmelidir. Daha sonra deney başlamadan önce mikroskop odası ve mikroakışkan oda önceden ısıtmak için gereklidir. Akış sitometrisi için hücre örnekleri kolayca analiz edilemezse, 6 saate kadar buzda tutulabilir. Alternatif olarak, kullanıcı genellikle akış sitometri10için tavsiye edilir etanol% 75, hücrelerin fiksasyon kullanarak düşünebilirsiniz. Protokol, potansiyel anormal hücrelere zarar vermemek için stres indüktörünü orta, santrifüj ve pipet hücrelerinden çok dikkatli bir şekilde yıkamayı gerektiriyorsa.
Hem akış sitometrisi hem de anlık görüntü analizi hücre büyüklüğü ve DNA içerik parametrelerine erişim sağlar ve anlık görüntüler hücre morfolojisinin ek gözlemini sağlar. DAPI10 (4',6-diamidino-2-fenilindole) veya diğer stabil DNA boyaları ile DNA boyama ilgi organizmasındanü gözlemlemek için floresan füzyon mevcut değilse yapılabilir. Akış sitometrisi analizi yapılamıyorsa, çok sayıda hücrenin mikroskopi ile görüntülemesi ve analiz edilmesi önemlidir.
Mikroskopi görüntüleme, belirli ilgi yollarında yer alan proteinlere floresan füzyon taşıyan suşlar kullanılarak da yapılabilir. Bu çoğaltma, transkripsiyon, hücre duvarı sentezi veya hücre bölünmesi gibi hücresel süreçlerin çeşitli stresetkisini ortaya yardımcı olacaktır. Bu yöntem bir dizi bakteri türüne uygulanabilir, tek gereklilik mikroakışkan aygıtın hücrelerin morfolojisi ile uyumlu olmasıdır. Standart mikroakışkan plakalar, hücre genişliği 0,7 ila 4,5 m arasında olan çubuk şeklindeki bakteriler için uygundur. Ancak, kok, ovokok veya kendine özgü şekillere sahip diğer bakteri suşlarının test edilmesi gerekir. Alternatif olarak, ekipmanın yetersizliği veya uyumsuz bakteriyel suşlar nedeniyle mikroakışkan deneyler yapılamıyorsa, agarose monte edilmiş slaytlarda maksimum 2 saat süreyle hızlandırılmış görüntüleme yapılabilir.
Bu çok ölçekli analizin genel avantajı, stres indüksiyonunun bakteri üreme yeteneğinin çeşitli yönleri (yani, kitle sentezi, hücre canlılığı, hücre morfolojisi, membran bütünlüğü, DNA içeriği) üzerindeki etkisinin küresel bir vizyon sağlamasıdır. bu stres koşulları altında büyüyen bir bakteri popülasyonu zamanla gelişir. Aynı zamanda tek hücreli ve nüfus düzeyinde normal büyümenin restorasyon analiz sağlar. Bu yaklaşım, çok çeşitli bakteri türlerine ve antibiyotik veya diğer antimikrobiyal bileşiklere maruz kalma, diğer organizmalarla etkileşimin çok türdeki etkisinin analizi gibi hemen hemen her türlü stres tedavisi için geçerlidir. popülasyonları, ya da genetik mutasyonun etkisi.

Bu protokolün genel amacı, popülasyonda ve tek hücreli düzeyde stres tedavisine maruz kalan bakteri hücrelerinin davranışlarını analiz etmektir. Bakteri üremesi ve canlılığı geleneksel olarak, bakteri hücre kitle sentezinin bir vekili olan optik yoğunluk izleme (OD600nm)veya kültürdeki canlı hücrelerin konsantrasyonunun (mililitre başına koloni oluşturan birim, CFU/mL) belirlenmesi için yapılan kaplama tahlilleri kullanılarak nüfus düzeyinde ele alınır. Normal (stressiz) büyüme koşullarında, OD600nm ve CFU/mL ölçümleri kesinlikle ilişkilidir, çünkü bakteriyel katlama süresi doğrudan hücre kütlesi artışına bağlıdır1,2. Ancak, bu korelasyon genellikle hücre kitle sentezini etkileyen koşullar altında bozulur3, hücre bölünmesi4, veya hücre lisis tetikleyen. Basit bir örnek, ipliksi bakteri hücrelerinin oluşumuna neden hücre bölünmesi inhibe stres tedavileri tarafından sağlanır5,6. Filamentli hücreler, hücre kitle sentezinden etkilenmediği için normal olarak uzatırlar, ancak canlı hücrelere bölünemezler. Kültür optik yoğunluğu sonuç olarak normal bir oranda zaman içinde artacak, ancak kaplama tahlilleri (CFU/ mL) tarafından belirlenen canlı hücrelerin konsantrasyonu değil. Bu durumda, diğerleri gibi, optik yoğunluk ve kaplama ölçümleri bilgilendirici ama gözlenen stres kaynaklı etkisi kapsamlı bir anlayış sağlamak için başarısız. Bu topluluk tahlilleri strese bağlı büyüme eksiklikleri derinlemesine karakterizasyonu sağlamak için tek hücreli analiz teknikleri ile kombine edilmesi gerekir.
Burada, dört tamamlayıcı deneysel yaklaşımı birleştiren bir prosedür tanımlanmıştır: (1) hücre canlılığını ve hücre kitle sentezini izlemek için sırasıyla geleneksel kaplama tahlilleri ve temel optik yoğunluk izleme; (2) hücre büyüklüğü ve DNA içerik parametrelerini çok sayıda hücre üzerinde değerlendirmek için akış sitometri; Hücre morfolojisini analiz etmek için mikroskop anlık görüntüleme; ve (4) hücre kaderinin zamansal dinamiklerinin incelenmesi için mikroakışkan odalarda zaman atlamalı tek hücreli görüntüleme. Bu çok ölçekli çerçeve, tek tek hücrelerin davranışları ışığında hücre büyümesi ve canlılığı üzerindeki küresel etkilerin yorumlanmasına olanak sağlar. Bu prosedür, belirli koşullar altında büyüme (örneğin, büyüme ortamı, pH, sıcaklık, tuz konsantrasyonu) veya antibiyotiklere veya diğer maruz kalma da dahil olmak üzere, ilgi hemen hemen her stres, çeşitli bakteri türlerinin tepkisini deşifre etmek için uygulanabilir antimikrobiyal bileşikler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1613100</td>
			<td>Certified molecular biology agarose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>A24858</td>
			<td>Cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX Microfluidic System</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>CAX2-S0000</td>
			<td>Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 FG</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ONIX2 1.0.1</td>
			<td>Microfluidic software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellASIC ONIX2 Manifold Basic</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>CAX2-MBC20</td>
			<td>Manifold system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoOne 96-well plate with lid</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>CC7672-7596</td>
			<td>Microplate with 0,2 mL well working volume and clear flat bottom, for automated plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli strain carrying a chromosomal insertion for a hupA-mCherry fusion</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Created by P1 transduction of hupA-mCherry in E. coli MG1655</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
			<td>Image software. Cite Schindelin et al. if used in publication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Frame</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0578</td>
			<td>Blue frame (125 &#956;L, 1,7 x 2,8 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Broth agarose medium</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>3002232</td>
			<td>Growth medium for plating assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicrobeJ</td>
			<td>Imagej/Fiji plugin</td>
			<td>https://www.microbej.com/</td>
			<td>Microscopy image analysis plugin. Cite Ducret et al. If used in publication; Detection settings: For bacteria : Area (&#956;m2): 0,1-max; Length (&#956;m): 0,5-max; Width (&#956;m): 0,6-max; Range (&#956;m): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. For nucleoid: Tolerance: 500; Threshold: Local; 0-max for all other parameters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidic Plates CellASIC ONIX</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>B04A-03-5PK</td>
			<td>Plate for Microfluidic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS EZ Rich Defined Medium (RDM)</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>M2105</td>
			<td>Growth rich medium, 10x MOPS Mixture, 0,132 M K2HPO4, 10x AGCU, 5x Supplement EZ, 20% Glucose. Filtered at 0,22 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain</td>
			<td>ThermoFisher scientific</td>
			<td>S34854</td>
			<td>DNA fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>30034301</td>
			<td>Automated plate reader</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-scale analysis of bacterial growth under stress treatments

Stres koşullarında büyüme ve hayatta kalma yeteneğinin analizi çok çeşitli mikrobiyoloji çalışmaları için gereklidir. Bakteri hücrelerinin antibiyotiklere veya diğer antimikrobiyal bileşiklere, ışınlamalara, fizyolojik olmayan pH, sıcaklık veya tuz konsantrasyonuna maruz kalma gibi strese neden olan tedavilere verdiği yanıtı karakterize etmek le ilgilidir. Farklı stres tedavileri hücre bölünmesi, DNA replikasyonu, protein sentezi, membran bütünlüğü veya hücre döngüsü düzenlemesi gibi farklı hücresel süreçleri bozabilir. Bu etkiler genellikle hücresel ölçekte belirli fenotipler ile ilişkilidir. Bu nedenle, strese bağlı büyüme veya canlılık eksikliklerinin kapsamını ve nedenselliğini anlamak, hem tek hücrede hem de popülasyon düzeylerinde çeşitli parametrelerin dikkatli bir şekilde analizini gerektirir. Burada sunulan deneysel strateji, canlı hücrelerde akış sitometrisi ve gerçek zamanlı mikroskopi görüntüleme gibi tek hücreli analiz teknikleri ile geleneksel optik yoğunluk izleme ve kaplama tahlilleri birleştirir. Bu çok ölçekli çerçeve bir bakteri popülasyonunun kaderi üzerinde stres koşullarının etkisi nin zaman çözülmüş bir açıklama sağlar.

Açıklanan prosedür sefaleksin geçici maruzkalma sırasında Escherichia coli K12 hücrelerinin davranışını analiz etmek için kullanılmıştır, özellikle hücre bölünmesi inhibe bir antibiyotik (Şekil 1A)13. Kromozom DNA'sı ile ilişkili floresan etiketli HU proteini üreten hupA-mCherry E. coli suşu bu tedavi boyunca kromozomun dinamiklerini araştırmak için kullanılmıştır8,9. Üssel olarak büyüyen hupA-mCherry E. coli hücreleri önce analiz edildi (t0) ve 60 dk sonra sefaleksin ile kuluçka (t60). Daha sonra antibiyotik yıkandı ve hücre popülasyonunun 1 saat (t120)ve 2 saat (t180)sonrası iyileşmesi analiz edildi (Şekil 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig1.jpg"> Şekil 1: Stres tedavilerine bakteriyel yanıtAnalizi için prosedür. (A) Yöntemin şeması. (B) Zengin ortamda normal büyüme sırasında hücre morfolojisini gösteren karikatür ve sefaleksine geçici maruz kalma sırasında (Ceph.), ek (t0) ve sefaleksin yıkandıktan sonra (t60) den (t180). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
OD ve CFU/mL'nin paralel evrimi, stres tedavilerinin etkisini anlamaya yardımcı olan ilk göstergedir. Bu iki parametre kesinlikle tedirgin büyüme sırasında korelasyon ama genellikle uncoupled ve stres altında bağımsız olarak gelişmeye. Sefalosin varlığında büyüyen hücre kültürleri benzer OD600nm gösterdi gibi stressiz kültürler (Şekil 2A), ilacın hücre kitle sentezini etkilemediğini gösteren. Ancak, sefaleksin hücre bölünmesinin sıkı inhibisyonu nedeniyle mevcut olduğunda canlı hücrelerin konsantrasyonu artmadı (Şekil 2B). Sefalosin çıkarıldığında hücreler tekrar bölünmeye başladı ve sonunda stresli olmayan kültüre eşdeğer bir konsantrasyona ulaştı (t180). Bu sonuçlar sefaleksin bakteriyostatik etkisini yansıtır, hangi hücre bölünmesi tamamen geri dönüşümlü inhibisyonu neden olur. Farklı gerilmeler, indüklenen etkiye bağlı olarak OD ve CFU/mL eğrilerinin farklı bir şekilde ayrılmasına neden olur (örneğin, filamentasyon veya şişkinlik gibi hücre morfolojisinin değiştirilmesi, hücre ölümü ile veya lysis olmadan). Farklı strese bağlı etkileri gösteren olası sonuç sonuçlarının kapsamlı olmayan bir listesi Şekil 2C'devermiştir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig2.jpg"> Şekil 2: İşlenmemiş ve sefaleksin tedavi edilen hücrelerin popülasyon düzeyinde bakteri üremesi izlenmesi. (A) Optik yoğunluk izleme (OD600nm/mL). (B) Tedavi edilmeyen ve sefaleksin-60dk tedavi edilen kültürlerde canlı hücre konsantrasyonu (CFU/mL). Hata çubukları, deneysel bir üçleme için standart sapmayı gösterir. (C) Olası sonuçların şemaları ve ilişkili stres etkileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Nüfus düzeyinde gözlenen stres yanıtını doğru bir şekilde yorumlamak için tek hücreli analiz gereklidir. Akış sitometrisi hücre büyüklüğü ve dna içeriğinin binlerce hücrenin incelenmesini sağlar14,15 (Şekil 3). Sefaleksin maruz hücre büyüklüğü ve DNA içeriği (t60)paralel artış açıktı. Sefaleksin çıkarıldığında, popülasyon hücre büyüklüğü ve DNA içeriği yavaş yavaş azaldı ve t180'dekistressiz popülasyona benzer hale geldi. Bu sonuçlar, sefateksin DNA replikasyonünü inhibe etmediğini ve çeşitli kromozom eşdeğerleri içeren ipliksi hücrelerin oluşumunu tetiklediğini göstermektedir. Bu iplikler ilaç yıkandığında normal hücre büyüklüğü ve DNA içeriği olan hücrelere ayrılmıştır. Akış sitometri sonuçları DNA sentezini inhibe eden stresler için çok farklı olacaktır, bu da sadece bir tane çoğalmayan kromozom içeren ipliksi hücrelerin oluşumuna yol açar. Bu durumda, hücre boyutu benzer şekilde artacak ama DNA içeriğinde artış ile ilişkili olmaz.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig3.jpg"> Şekil 3: Tedavi edilmeyen ve sefaleksin-60dk tedavi edilen hücrelerin temsili akış sitometri analizi. (A) Hücre büyüklüğü dağılımı histogramları (FSC-H). (B) DNA içeriği histogramları (FL1-SYTO9). n = 120.000 hücre analiz edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Kanaat mikroskobu görüntülemesi, HÜCRE MORfolojisi ve HU-mCherry lokalizasyonu ile gösterilen DNA'nın hücre içi organizasyonunu incelemek için kullanılmıştır(Şekil 4A). Sefaleksin normal hücre genişliği ve bölünme septa ile uzun hücrelerin oluşumunu kışkırttı. Bu pürüzsüz filamentler düzenli olarak çekirdekoid adı verilen aralıklı DNA yapıları içeriyordu, sefaleksin kromozom replikasyon ve segregasyon etkilemediğini doğrulayan. Kantitatif görüntü analizi büyük ölçüde hücre büyüklüğü ve DNA içeriği artış daha önce akış sitometrisi ile gözlenen doğruladı(Şekil 4B,C). DNA hasarına neden olan ve çoğalmanın devam ettiği ancak segregasyonun bozulduğu ipliksi hücrelerin oluşumuna yol açan stresler için sonuçlar çok farklı olacaktır. Bu durumda, hücre büyüklüğü ve DNA içeriği benzer şekilde artacaktır, ancak hücreler tek bir yapılandırılmamış DNA kütlesi barındırır. Anlık görüntüler de anormal hücre şekilleri veya mini, anükleat veya lysed hücrelerin (hayalet hücreleri) varlığını diğer tür ortaya çıkarabilir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig4.jpg"> Şekil 4: Tedavi edilmeyen ve sefaleksin-60dk tedavi edilen hücrelerin mikroskopi enstantane analizi. (A) Faz kontrastı (gri) ve HU-mCherry sinyalini (kırmızı) gösteren temsili mikroskopi görüntüleri. (B) Hücre uzunluğu dağılımı histogramları. Ölçek Çubuğu = 5 μm. (C) Hücre başına nükleoid sayısının histogramları. Her örnek için 800 ila 2.000 hücre analiz edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Mikroakışkan cihaz16 ile ilişkili hızlandırılmış mikroskopi daha önce gözlenen fenotiplerin belirlenmesine yardımcı oldu ve büyüme eksikliğinin gelişimi ve nedenselliği ile ilgili ek bilgiler sağladı. Zaman atlamalı görüntüler(Şekil 5A ve Film 1)hücre uzaması (hücre kitle sentezi) ve kromozom replikasyonu ve segregasyonusefaleksine maruz kalarak inhibe olmadığını doğruladı. Buna ek olarak, sefaleksin çıkarıldığında iyileşme sürecini ortaya koymuştur. Filamentli hücre soyundan gelen analizler, hücre bölünmesinin ilacı yıkadıktan sonra ~20 dk yeniden başladığını göstermiştir(Şekil 5B). Ortaya çıkan bölünmüş hücreler, onlar sırayla bölünmüş, sonunda normal boyut ve DNA içeriği sergileyen 33 hücre oluşumuna yol açan, çünkü canlı idi. Bu, CFU/mL ölçümlerinden (~33 dk) elde edilen stressiz popülasyon için hesaplanan üretim süresine benzer olan 180 dakika boyunca toplam 31 dk'lık bir üretim süresinin hesaplanmasına olanak sağladı.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60576/60576fig5.jpg"> Şekil 5: Sefaleksin-60min-tedavi edilen hücrelerin mikroskopi zaman atlamalı analizi. (A) Faz kontrastı (gri) ve HU-mCherry sinyalini (kırmızı) gösteren temsili mikroskopi görüntüleri. İzlenen ipliksi hücre beyaz anahat ile gösterilir ve farklı renklere göre hücreleri bölünür. Ölçek Çubuğu = 5 μm. (B) Panele (A)ve Film 1'ekarşılık gelen ipliksi hücre soyundan gelen şematik gösterimi . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/60576fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/60576/60576vid1.jpg"> Film 1: E. coli HU-mCherry ve sefaleksin ile tedavi Mikroakışkan film. Sefaleksin 60 dakika sonra enjekte edildi, taze RDM orta enjeksiyonu takip 3 saat. Zaman sarı (1 kare her 10 dakika) gösterilir. Ölçek Çubuğu = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60576/Movie1.mp4" target="_blank">Bu videoyu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın (İndirmek için sağ tıklatın).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments at JoVE.com

Multi-scale Analysis of Bacterial Growth Under Stress Treatments

Bu protokol, tek hücreli ve hücre popülasyon seviyelerinde stres koşulları altında bakteri üremesinin zaman içinde çözümlenmiş bir tanımını sağlar.

Stres Tedavileri Altında Bakteriyel Büyümenin Çok Ölçekli Analizi

Analysis of the bacterial ability to grow and survive under stress conditions is essential for a wide range of microbiology studies. It is relevant to ...

Bu yöntemin genel amacı, stres tedavisinin hem tek hücrede hem de popülasyon düzeyinde bakteri hücreleri üzerindeki etkisini analiz etmektir. Bu hücre canlılığı, morfolojisi ve DNA içeriği de dahil olmak üzere bakteri üremesi çeşitli yönleri üzerinde stresin etkisi küresel bir vizyon sağlar. Ayrıca nüfus kurtarma karakterize sağlar.Bu yöntem ilaç endüstrisinde yeni antimikrobiyal molekülün aktivitesini taramak ve bakterilerin canlılığı ve büyümesi üzerindeki etkilerini takdir etmek için kullanılabilir. Strese neden olan tedavi, doz ve zamana bağlı gibi bir verimsizliğe sahiptir. Bu protokole başlamadan önce optimal dozu ve tedavi süresini belirlemek için ön testlerin yapılması gerekebilir.Bu yöntemin görsel gösterimi, her kritik adımın önemli ayrıntılarını niçin doğru şekilde gerçekleştireceklerini hayal etmenizi sağlar. Başlamak için, E.Coli MG1655 HU-PAmCherry tek bir koloni ile MOPS EZ Zengin Tanımlı Orta beş mililitre aşılamak ve bir gecede dakikada 140 rotasyonlar sallayarak 37 derece santigrat büyümek. Ertesi sabah, numunenin 100 mikrolitresini ayıklayın ve optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçmek için 900 mikrolitre orta ile seyreltin.Daha sonra, 0,01 bir OD600 nanometre taze orta içeren bir test tüpü kültürü seyreltmek. Optik yoğunluk 0,2'ye ulaşana kadar 140 RPM'de sallayarak 37 santigrat derecede aşılanmış test tüpünü kuluçkaya yatırın, bu da zengin ortamda tam üstel faza karşılık gelir. Daha sonra, zaman atlamalı mikroskopi görüntüleme, seyreltme ve kaplama tahlil, akış sitometri analizi ve mikroskopi enstantane görüntüleme için kültür örnekleri aliquot.Test tüpündeki kalan 4,4 mililitre hücre kültürünü belirli stres tedavisine maruz bırakın. Örneğin, mililitre başına beş mikrogram ve 140 RPM sallayarak 37 santigrat derecede kuluçka sefaleksin 4.4 mikrolitre. Taze ortamda 200 mikrolitre kültür numunesinin 10 ila 7'nci derecesini kadar on kat seri seyreltme hazırlayın.Çok nazik girdap veya tüp ters çevirerek her seyreltme arasında karıştırın. Plaka 100 mikrolitre uygun seyreltme olmayan seçilmiş LB agarose plakaları ve inkübasyon gecede 37 santigrat derece. Ertesi gün, her kültür örneğinde canlı hücrelerin konsantrasyonu belirlemek için kolonilerin sayısını saymak.İşlenmemiş ve tedavi edilen hücre kültürleri için zamanın bir fonksiyonu olarak mililitre başına CFU'yu çizin. Kültürün OD600'ini spektrofotometrede ölçün. Mikrolitre başına yaklaşık 15.000 hücreye karşılık gelen 0,06'da OD600 ile numune almak için kültür örneğini dört santigrat derecede taze orta ile seyreltin.DNA boyama için seyreltilmiş bakteri örneğini, dna floresan boyanın mililitre çözeltisi başına 10 mikrogram ile bire bir hacim rasyonda karıştırın ve karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın. Numunenin enjeksiyonundan önce, numuneyi çok nazik girdaplarla veya tüpü ters çevirerek karıştırın. Dakikada yaklaşık 120,000 hücrelik bir akış hızında numuneyi akış sitometresine geçirin.Uygun ayarlarla ileriye dağılmış ve yan alıkonan ışığın yanı sıra DNA floresan boya/floresan sinyali elde edin. Hücre büyüklüğünün dağılımını temsil etmek için ileriye dağılmış hücre yoğunluğu histogramını çizin ve hücre popülasyonundaki DNA içeriğini temsil etmek için DNA floresan boya/floresan hücre yoğunluğu histogramını çizin. İlk olarak, sıcaklığı dengelemek için termosesif mikroskop haznesini 37 santigrat derecede önceden ısıtın.El yazmasında açıklandığı gibi agarose monte slaytlar hazırlayın. Slaytı mikroskop aşamasına yerleştirin ve iletilen ışığı yüz kontrastı hedefiyle ve mCherry için 560 nanometre ışık kaynağı uyarma ile görüntü edinimi gerçekleştirin. Görüntü analizi sırasında otomatik hücre algılamasını kolaylaştırmak için yalıtılmış hücreler içeren görünüm alanlarını seçin.Hücre popülasyonunun sağlam istatistiksel analizine olanak sağlamak için en az 300 hücrenin görüntülendirilediğinden emin olun. İlk olarak, koruma çözeltisini mikroakışkan plakadan çıkarın ve Mikroakışkan Yazılım Kullanım Kılavuzu'nda açıklandığı gibi önceden ısıtılmış 37 dereceye kadar önceden ısıtılmış taze ortamla değiştirin. Mikroakışkan plakayı manifold sistemine takın.Ve mikroakışkan yazılımda, plakayı manifold sistemine kapatmak için Seal düğmesine tıklayın. Bundan sonra, Priming düğmesine tıklayın. Mikroakışkan haznenin genişlemesini önlemek için mikroakışkan plakayı mikroskop aşamasında manifold sistemi yle yerleştirin ve 37 derece santigrat derecede iki saat önceden ısıtın.Seal Off düğmesine tıklayarak mikroakışkan sistemdeki mikroakışkan plakayı kapatın. Ortayı kuyu sekizden 150 mikrolitre kültür numunesi ile değiştirin ve ortayı 1'den 5'e kadar istediğiniz ortamla değiştirin, strese neden olan reaktifle veya strese neden olan reaktifolmadan. Mikroakışkan plakayı kapatın ve mikroskop aşamasına yerleştirin.Mikroakışkan yazılımda, hücre yükleme işlemini çalıştırın. Aktarılan ışıkta mikroskop altına bakarak hücrelerin yüklenmesinin tatmin edici olup olmadığını kontrol edin. İletilen ışık moduna dikkatlice odaklanın ve izole edilmiş bakterileri gösteren ve aşırı kalabalık olmayan çeşitli görüş alanlarını seçin, 100 kare mikrolitrede yaklaşık 10 ila 20 hücre.Mikroakışkan yazılımda, Özel Sırayı Çalıştır düğmesine tıklayın, ardından iki PSI'da 10 dakika boyunca strese neden olan ortamın enjeksiyonuna program verin ve ardından stres tedavisinin istenen süresi boyunca bir PSI'ya enjeksiyon uyguluyoruz. İletilen ışıkta faz kontrastı ve gerekirse mCherry sinyali için 560 nanometre uyarma ışık kaynağı kullanarak, her 10 dakikada bir kare ile zaman atlamalı modda mikroskopi görüntüleme yapın. Mikroskobik görüntü edinimi ve mikroakışkan enjeksiyon protokolünü aynı anda başlatın.Fiji yazılımını ve MicrobeJ eklentisini açın. Anlık görüntü analizi için, görüntüleri biraraya getirmek ve elde edilen görüntü yığınları dosyasını kaydetmek için bir mikroskop slaytına karşılık gelen tüm görüntüleri MicrobeJ yükleme çubuğuna bırakın. Hızlandırılmış veriler için görüntü yığınını MicrobeJ yükleme çubuğuna bırakmanın.Faz kontrast ı görüntüsünün segmentasyonuna dayalı olarak hücrenin anahatlarının otomatik olarak algılanmasını çalıştırın ve lekeli DNA floresan sinyalinin segmentasyonuna dayalı nükleoidlerin algılanmasını çalıştırın. Hücre algılamanın doğruluğunu görsel olarak kontrol edin ve gerekirse düzeltme için MicrobeJ düzenleme aracını kullanın. Elde edilen sonuç dosyasını kaydedin.Analizi tamamlamak ve ResultJ penceresini elde etmek için ResultJ simgesine tıklayın. Birçok farklı türde çıktı grafiği oluşturulur. Hücre şekli veya uzunluğu ve hücre başına ortalama nükleoid sayısı normalleştirilmiş histogramları çizin.Bu çalışma, özellikle hücre bölünmesini inhibe eden bir antibiyotik olan sefaleksine geçici maruzkalma sırasında Escherichia coli K-12 hücrelerinin davranışını analiz etti. Sefateksin varlığında büyüyen hücre kültürleri, stresli olmayan kültürler gibi benzer OD600 artışlar sergiledi. Sefaleksin mevcut olduğunda canlı hücrelerin konsantrasyonu artmadı.Cephalexin çıkarıldığında hücreler tekrar bölünmeye başladı ve iki saat sonra stressiz kültüre eşdeğer bir konsantrasyona ulaştı. Farklı gerilmeler, indüklenen etkiye bağlı olarak mililitre eğrileri başına OD ve CFU'nun farklı bir şekilde ayrılmasıyla sonuçlandı. Sefaleksin maruz hücre büyüklüğü ve DNA içeriği paralel bir artışa yol açtı.Sefaleksin çıkarıldığında, nüfus hücre büyüklüğü ve DNA içeriği yavaş yavaş azaldı ve iki saat sonra stressiz nüfusa benzer hale geldi. Sefaleksin normal hücre genişliği ile uzun hücrelerin oluşumunu kışkırttı sonra hiçbir bölünme septa. Kantitatif görüntü analizi hücre boyutunu ve DNA içeriğinin arttığını doğruladı.Hızlandırılmış görüntüler, hücre uzaması ve kromozom replikasyonu ve segregasyonunun sefaleksine maruz kalarak inhibe olmadığını doğrulamaktadır. Filamentli hücre soyundan gelen analizler, hücre bölünmesinin ilacı yıkadıktan yaklaşık 20 dakika sonra yeniden başladığını gösterdi. Bu bakteriyel popülasyon stres tedavileri indüklemeden önce tam üstel büyüme olduğundan emin olmak için çok önemlidir.Bu yaklaşımlar için kullanılan stres indükleme tedavisi deneysel için tehlikeli olabilir, genotoksik bileşik gibi. Bu yüzden bileşiği dikkatlice kullanın ve eldiven, maske, gözlük ve laboratuvar önlüğü giyin.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ixodes scapularis Keneler gelen tükürük, Tükürük Bezi ve hemolimf Koleksiyonu

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Üretim ve Çok fenotipik Yüksek içerik Eleme<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutantlar

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Yöntemler Bakteriyel Pyomelanin Üretim ønhibe ve Oksidatif Stres Duyarlılık içinde tekabül eden artış belirleme

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...