Name: process optimization using high throughput automated micro-bioreactors in chinese hamster ovary cell cultivation
Uploaded: 2020-05-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation at JoVE.com

作者感谢德国联邦教育和研究部联邦联邦联邦部长比尔东·福森（BMBF）和德国萨托里乌斯·斯蒂迪姆生物技术有限公司的生物加工团队的支持。

1. 前培养程序
注：重组性CHO DG44细胞，其活细胞浓度为1 x 107细胞/mL用于此协议。
<ol><li>将含有1.2 mL细胞的小瓶解冻至室温，并立即将细胞悬浮液转移到含有10 mL冷种子介质的15 mL锥形离心管中。</li>
	<li>在 190 x g和室温下使圆锥式离心管离心 5 分钟，并丢弃上清液。</li>
	<li>将150mL的种子介质预热至36.8°C。</li>
	<li>轻轻地将细胞颗粒悬浮在10 mL的预加...

<ol>
	<li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopharmaceutical+benchmarks+2018.">Biopharmaceutical benchmarks 2018.</a> Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).</li><li>Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHO+cells+in+biotechnology+for+production+of+recombinant+proteins:+current+state+and+further+potential.">CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).</li><li>Lai, T., Yang, Y., Ng, S. 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Lecture notes in electrical engineering. 39, (2009).</li><li>Bareither, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+disposable+small+scale+reactor+for+high+throughput+bioprocess+development:+a+proof+of+concept+study.">Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).</li><li>Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+cell+culture+flocculation+offer+for+antibody+purification+processes.">What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes.</a> Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).</li><li>Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. 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优化工艺，提高产量，对生物制药行业至关重要。摇瓶可能用于菌株的筛选;但是，在烧瓶中不监视过程参数（如 pH 和 DO）。微生物反应器具有优势，因为它们允许对过程进行持续监测和控制。微生物反应器中的这些控制回路也提供了与更大规模类似的条件，因此，其结果可与较大规模的生物反应器相媲美。微生物反应器的另一个优点是，与台式生物反应器相比，在时间和人工方面</...

2018年全球生物制药市场价值超过2500亿美元，并不断扩大1.制药公司正在从生产小分子药物转向生物技术产生的治疗药物，如重组蛋白。仅此一项，收入就超过1500亿美元。哺乳动物细胞现在广泛用于这些药物重组蛋白的产生。在目前68种经批准的哺乳动物细胞产品中，有57种是由中国仓鼠卵巢细胞（CHO）2产生的。CHO细胞专门用于生产需要翻译后修饰的重组蛋白。这些细胞是首选，因为它们生长在悬浮液中，从而在无血清化学定义的介质33，44中产生可重复的结果。使用CHO细胞的另一个优点是，该产品的甘油结构类似于人类单克隆抗体（mAb），由于基因扩增5，导致重组蛋白产量和特定生产力提高。
重组性CHO（rCHO）细胞培养的产量在过去二十年中增加了一百倍。这一改进归功于工艺参数的优化、喂养策略以及血清无化学定义的介质6的开发。随着药品需求的增加，生产过程发展的成本和时间效率的压力增加7.为了减轻压力，同时保证产品质量，制药行业的重点已转向设计质量 （QbD）。QbD 用于了解产品生产和流程。ObD 中使用的一个重要工具是实验设计 （DOE）。它通过揭示各种输入变量和结果输出数据之间的关系，帮助增加对流程的理解。在项目早期阶段，应用 DOE 方法优化生物工艺，有利于实现工艺条件，提高数量和质量。与老式策略相比，这种方法是有益的：一次一个因子 （OFAT）。使用经典、沙宁或塔古奇的DOE的统计方法远远优于OFAT8。
过程和介质优化可以在摇瓶中执行。烧瓶相对便宜。但是，无法控制温度、pH 值和溶解氧 （DO） 等参数。为了克服这些缺点，可以使用从工作体积为 0.5 L 到 5 L 的多用途台式生物反应器。这些反应堆提供广泛的在线监测和过程控制。然而，多用途生物反应器的使用是时间和劳动密集型的。为了克服这些缺点，采用了一种新型的一次性生物反应器，它结合了监测台式生物反应器的综合过程和易于处理摇瓶。高吞吐量筛选系统和一次性技术为提高工艺性能和开发效率做出了贡献。
在本文中，列出了在自动微生物反应器 （AMBR） 软件中加载配方的指南。本实验过程中研究了不同搅拌速度和pH值对活细胞浓度（VCC）和滴度的影响。实验软件MODDE12的设计进行了实验结果和分析。产品分析在带有蛋白质 A 柱的高压液相色谱 （HPLC） 系统中进行。它基于mAb的Fc区域与高亲和力10，11,11的蛋白质A结合的原则。使用此方法，可以识别和量化 mAb。定量在280nm的测量洗脱峰区进行。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>A-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Corning, Merck</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well deep well plates</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>A-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>A-0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ambr 15 automated microbioreactor system</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>001-2804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>001-1B86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam C Emulsion</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>A8011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Sterile filter</td>
			<td>Corning, Merck</td>
			<td>CLS431474</td>
			<td>0.1 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEDEX Detergent (3% Mucosol)</td>
			<td>Roche Innovatis AG</td>
			<td>05-650-658-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Roche Innovatis AG</td>
			<td>05-650-216-001</td>
			<td>CEDEX HiRes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO DG44 cell line</td>
			<td>Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOKO Feed Media A (FMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>CR80025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOKO Feed Media B (FMB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>CR80026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOKO Production Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>CR80027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOKO Stock Culture Meium</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>CR80028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromaster high pressure liquid chromatography system</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>Corning, Merck</td>
			<td>SIAL0790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1070179026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SUPLSU860181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich,Merck</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1502226</td>
			<td>POROS&#8482; A 1.7&#160;mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich,Merck</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich,Merck</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>VWRVK940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YSI</td>
			<td>YSI Inc</td>
			<td>2900D</td>
			<td>YSI 2900 Select</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process optimization using high throughput automated micro-bioreactors in chinese hamster ovary cell cultivation

优化生物工艺，提高所需产品的产量，在生物制药行业具有重要意义。这可以通过菌株选择和开发生物工艺参数来实现。摇瓶已用于此目的。然而，它们缺乏控制过程参数的能力，如pH值和溶解氧 （DO）。在自动化微生物反应器的帮助下，可以克服这一限制。这些生物反应器模仿大规模种植。该系统的主要优点之一是实验设计（DOE）在软件中集成。这种集成可以建立一个可以同时改变多个过程参数的设计。可在软件内分析关键工艺参数和最佳生物工艺条件。此处介绍的工作重点是向用户介绍软件中过程设计所涉及的步骤，并将 DOE 纳入培养运行中。

图2概述了本研究中进行的栽培情况。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60577/60577fig02.jpg"> 图2：在培养站中测试pH和搅拌器速度曲线的实验条件的原理图表示。该图还表示放置船只的正确布局。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60577/60577fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图形的较大版本。</a>
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Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

在这里，我们提出了一个详细的过程，在自动化的微生物反应器中运行实验设计，然后使用蛋白质A柱进行细胞收获和蛋白质定量。

中国仓鼠卵巢细胞培养中高通量自动化微生物反应器工艺优化

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

在这段视频中，用户通过规划和执行实验或DOE的设计，引入到微生物反应器软件中。还演示了分析仪辅助阀，以优化工艺条件。将 modet 并入自动化微生物反应器软件已正式用于数据分析。大量的实验可以小规模地同时进行规划和执行。演示这个程序的将是塔曼娜·纳格雷克，一个来自我实验室的博士生。从主要培养中的培养前程序开始，如文本协议中所述。若要创建新实验，请打开琥珀色自培养软件，并在简介选项卡中单击，创建新实验。在新的实验选项卡中，输入实验的名称以及进行实验的日期。激活培养过程中使用的容器中培养站的检查点。自动添加 DOE 标记也将激活，以便于 DOE 实验编程期间进行轻松转换。单击下一个"切换到下一个选项卡。要设置有关在容器中添加介质的信息，以及防泡、进料、饲料和葡萄糖，请激活添加介质板"检查点"。定义包含介质的板的类型、名称和位置。单击向容器添加媒体。输入要添加到容器的介质的体积。定义介质从板到容器的传输映射。单击下一个"切换到下一个选项卡。将媒体信息输入软件后，分配培养条件。单击条件介质，并填写温度、目标 DO、PH 上限和搅拌 RPM。然后单击向上搅拌"或向下搅拌。要在容器中添加接种，请激活添加细胞板。定义包含介质的板的类型、名称和位置。单击向容器添加单元格。输入接种时间和要添加到容器中的介质量。定义液体处理者将细胞从板转移到容器的路径。单击下一个"切换到下一个选项卡。要设置添加饲料、葡萄糖和防泡，请激活添加的进给板，并定义板类型、名称和位置。单击向容器添加进给，然后输入要添加到容器的进给量。根据栽培情况，添加饲料添加数量。对于这种栽培，反应堆每24小时喂72小时后。手动添加送餐之间的时间延迟，通过将数据输入从添加的单元格的延迟。第一天喂养是接种72小时后，下一天是96小时后，等等。定义从板到容器的进给的映射。若要在栽培过程中设置取样，请激活添加样品板"，并定义板材类型、名称和位置。检查从容器中取出样品"，并输入要从容器中去除的样品体积。确保在整个栽培过程中，体积不会低于 10 英里。添加栽培过程中要采集的样品数。与进料类似，添加每个输入采样点从容器中移除样品的时间。保存进程。它现在已准备好执行。最后，定义样品从容器转移到板的映射。打开琥珀色 15 DOE 软件。单击"调查"并选择新的。在创建调查"对话框"中输入新 DOE 调查的名称。为了将实验分配给 DOE 调查，请打开创建以研究不同参数的配方。单击浏览，然后选择相应的实验。容器标记已在列中登记。要定义所需的 DOE 因子，请选择参数并单击标记为 DOE 因子的列。选择"新"并添加单位、缩写以及因子的下限和上限。在"响应"选项卡中，定义要考虑用于分析数据的值。单击编辑 DOE 响应，并定义响应的名称、缩写、单位和最小和最大限制。定义响应后，为每个响应选择琥珀色变量，然后定义。响应可以自动与微生物生物反应器变量关联。从下拉列表中选择所需的变量。根据要求更改每个响应的方程。最小数据、最大值、第一个、最后一个和平均数据之间的选择。若要创建设计，请使用"开始设计向导"选择实验设计的类型，并添加或删除复制点和中心点的数量。选择目标，该目标决定设计和模型的选择。完成并创建可导入琥珀色自培养软件的工作数据包，如文本协议中所述。在实验选项卡中，单击创建 DOE 实验，然后浏览使用 DOE 软件创建的工作包。通过单击"开始"初始化进程。执行实验后，使用导出 DOE 结果导出数据。"导出 DOE 结果"窗口将打开，指示区域性容器和站的行列在表中。选择所需的行，然后单击导出选定的行"或导出实验数据"以存储所有结果并保存文件以进行进一步分析。通过切换到结果"选项卡并选择导入结果，将数据导入琥珀色 DOE 模块。浏览所需的数据文件，然后单击分析结果。自动化微生物生物反应器中的细胞生长可与多用途生物反应器相媲美。在比较三个不同尺度的细胞浓度时，观察到15毫升自动微生物生物反应器模仿两升玻璃生物反应器。摇瓶的结果也比较，以展示琥珀的好处。研究了不同搅拌速度和PH在自动微生物生物反应器中的影响。此处显示的是不同微生物生物反应器中活性细胞浓度（VCC）和单克隆抗体浓度的比较。可以观察到PH 6.9对VCC的负面影响。此外，与PH 7.1相比，PH 7.3的培养下细胞的生长显著改善。此处显示VCC和单克隆抗体浓度的响应轮廓图。在 PH 和不同搅拌器速度的容器中，这些值具有可比性，表明为该工艺收集的搅拌器速度对工艺输出没有显著影响。给机器的每个指令都必须仔细编写，以避免在执行实验时出错。该软件是灵活的，它可以运行一次许多实验，从而减少优化流程所用的时间。实验设计在生物工艺领域是有用的，因为实验结果对基于知识的过程有一定的理解作用，可以在一定程度上扩展到其他生物体。

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