Name: process optimization using high throughput automated micro-bioreactors in chinese hamster ovary cell cultivation
Uploaded: 2020-05-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation at JoVE.com

Os autores agradecem ao Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), ao Ministério Federal de Educação e Pesquisa, alemanha, e à equipe de BioProcessamento da Sartorius Stedim Biotech GmbH, Alemanha, pelo apoio.

1. Procedimento de pré-cultura
NOTA: Células COD44 recombinantes com uma concentração celular viável de 1 x 107 células/mL são usadas para este protocolo.
<ol><li>Descongele o frasco contendo 1,2 mL de células à temperatura ambiente e transfira imediatamente a suspensão celular para um tubo de centrífuga cônica de 15 mL contendo 10 mL de meio de semente sinuosa.</li>
	<li>Centrifugar o tubo cônico de centrífuga por 5 minutos a 190 x g e temp...

<ol>
	<li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopharmaceutical+benchmarks+2018.">Biopharmaceutical benchmarks 2018.</a> Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).</li><li>Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHO+cells+in+biotechnology+for+production+of+recombinant+proteins:+current+state+and+further+potential.">CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).</li><li>Lai, T., Yang, Y., Ng, S. 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Lecture notes in electrical engineering. 39, (2009).</li><li>Bareither, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+disposable+small+scale+reactor+for+high+throughput+bioprocess+development:+a+proof+of+concept+study.">Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).</li><li>Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+cell+culture+flocculation+offer+for+antibody+purification+processes.">What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes.</a> Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).</li><li>Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. 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A otimização do processo para aumentar o rendimento é de fundamental importância na indústria biofarmacêutica. Frascos de agitação poderiam potencialmente ser usados para a triagem da cepa; no entanto, o monitoramento dos parâmetros do processo, como pH e DO, não está disponível nos frascos. Os micro-bioreatores têm uma vantagem, pois permitem o monitoramento contínuo e o controle do processo. Esses laços de controle no micro-bioreator também fornecem uma condição semelhante àquelas em maior escala e, ...

O mercado biofarmacêutico global valia mais de US$ 250 bilhões em 2018 e vem continuamente expandindo1. As empresas farmacêuticas estão se afastando da produção de pequenos fármacos moleculares para terapêuticas biotecnológicas, como proteínas recombinantes. Só estes são responsáveis por uma receita de mais de US $ 150 bilhões1. As células dos mamíferos são agora amplamente utilizadas para a produção dessas proteínas farmacêuticas recombinantes. No período atual, dos 68 produtos aprovados produzidos por células de mamíferos, 57 são produzidos por células chinesas de ovário hamster (CHO)2. As células CHO são especificamente utilizadas para a produção de proteínas recombinantes que requerem modificações pós-translacionais. Estas células são preferidas à medida que crescem em uma suspensão e, assim, permitem resultados reprodutíveis em um meio quimicamente definido quimicamentelivre 3,4. A outra vantagem do uso de células CHO é que a estrutura glicana do produto se assemelha à do anticorpo monoclonal humano (mAb) e resulta em maior rendimento de proteína recombinante e produtividade específica devido à amplificação genética5.
O rendimento da cultura celular recombinante CHO (rCHO) aumentou cem vezes nas últimas duas décadas. Essa melhora é atribuída à otimização dos parâmetros do processo, à estratégia de alimentação e ao desenvolvimento do meio quimicamente definido quimicamente6. Com o aumento das exigências dos produtos farmacêuticos, a pressão aumenta sobre o custo e a eficiência de tempo para o desenvolvimento do processo produtivo7. Reduzir a pressão e, ao mesmo tempo, garantir a qualidade do produto redirecionou o foco da indústria farmacêutica em Qualidade por Design (QbD). O QbD é usado para entender a produção do produto, bem como o processo. Uma ferramenta vital usada no ObD é o Design of Experiment (DOE). Ele ajuda a aumentar a compreensão do processo, revelando a relação entre várias variáveis de entrada e dados de saída resultantes. A aplicação da abordagem do DOE para otimizar o bioprocesso é benéfica durante os estágios iniciais do projeto na assimilação das condições do processo e aumento da quantidade e qualidade do título. Essa abordagem é benéfica quando comparada com a estratégia antiquada: um fator de cada vez (OFAT). As abordagens estatísticas do DOE usando Classic, Shainin ou Taguchi são muito superiores ao OFAT8.
O processo e a otimização da mídia podem ser realizados em frascos de shake. Os frascos são relativamente baratos. No entanto, não é possível controlar parâmetros como temperatura, pH e oxigênio dissolvido (DO). Para superar essas desvantagens, podem ser utilizados bioreatores multiuso de bancada que variam de volume de trabalho de 0,5 L a 5 L. Os reatores fornecem um extenso monitoramento on-line e controle de processos. No entanto, o uso do bioreator multiuso é de tempo e trabalho intensivo. Para superar essas desvantagens, um novo bioreator de uso único que combina o processo abrangente de monitoramento do bioreator de bancada e fácil manuseio do frasco de shake é usado. O sistema de triagem de alto rendimento e a tecnologia de uso único contribuíram para aumentar a eficiência do desempenho e desenvolvimento do processo9.
Neste artigo, estão listadas as diretrizes para carregar a receita no software automatizado de micro-bioreator (AMBR). A influência de diferentes velocidades de agitador e pH na concentração celular viável (VCC) e título é estudada durante este experimento. O resultado experimental e a análise são realizados com o projeto do software de experimento MODDE 12. A análise do produto é realizada em um sistema de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com uma coluna de proteína A. Baseia-se no princípio de que a região Fc do mAb se liga à proteína A com alta afinidade10,11. Com este método, é possível identificar e quantificar o mAb. A quantificação é realizada sobre as áreas de pico de elução medidos em 280 nm.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>A-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Corning, Merck</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well deep well plates</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>A-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>A-0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ambr 15 automated microbioreactor system</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>001-2804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>001-1B86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam C Emulsion</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>A8011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Sterile filter</td>
			<td>Corning, Merck</td>
			<td>CLS431474</td>
			<td>0.1 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEDEX Detergent (3% Mucosol)</td>
			<td>Roche Innovatis AG</td>
			<td>05-650-658-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Roche Innovatis AG</td>
			<td>05-650-216-001</td>
			<td>CEDEX HiRes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO DG44 cell line</td>
			<td>Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOKO Feed Media A (FMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>CR80025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOKO Feed Media B (FMB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>CR80026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOKO Production Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>CR80027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOKO Stock Culture Meium</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>CR80028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromaster high pressure liquid chromatography system</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>Corning, Merck</td>
			<td>SIAL0790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1070179026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SUPLSU860181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich,Merck</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1502226</td>
			<td>POROS&#8482; A 1.7&#160;mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich,Merck</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich,Merck</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>VWRVK940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YSI</td>
			<td>YSI Inc</td>
			<td>2900D</td>
			<td>YSI 2900 Select</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process optimization using high throughput automated micro-bioreactors in chinese hamster ovary cell cultivation

A otimização de bioprocessos para aumentar o rendimento dos produtos desejados é de importância na indústria biofarmacêutica. Isso pode ser alcançado através da seleção de cepas e do desenvolvimento de parâmetros de bioprocesso. Frascos de agitação foram usados para este fim. Eles, no entanto, não têm a capacidade de controlar os parâmetros do processo, como pH e oxigênio dissolvido (DO). Essa limitação pode ser superada com a ajuda de um micro-bioreator automatizado. Estes bioreatores imitam o cultivo em uma escala maior. Uma das principais vantagens deste sistema é a integração do Design of Experiment (DOE) no software. Essa integração permite estabelecer um projeto onde vários parâmetros de processo podem ser variados simultaneamente. Os parâmetros críticos do processo e as condições ideais de bioprocesso podem ser analisados dentro do software. O foco do trabalho aqui apresentado é introduzir o usuário às etapas envolvidas na concepção do processo no software e incorporação do DOE dentro da corrida de cultivo.

Uma visão geral do cultivo realizado neste estudo é apresentada na Figura 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60577/60577fig02.jpg"> Figura 2: Representação esquemática das condições experimentais para testar perfis de pH e velocidade de agitador nas estações de cultura. A figura também representa o layout correto para colocar os vasos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_...

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Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Aqui, apresentamos um procedimento detalhado para executar um Projeto de Experimento em um micro-bioreator automatizado seguido de colheita celular e quantificação de proteínas usando uma coluna de Proteína A.

Otimização de processos usando micro-bioreatores automatizados de alto throughput no cultivo de células de ovário de hamster chinês

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

Neste vídeo, os usuários introduziram no software micro bioreator com planejamento e execução de projeto de experimentos ou DOE. As válvulas auxiliares analisadores também são demonstradas para otimizar a condição do processo. A incorporação do modet no software microreparator automatizado foi oficializada para a análise dos dados.Um grande número de experimentos pode ser planejado e executado simultaneamente em pequena escala. Demonstrando o procedimento será Tamanna Nagraik, uma estudante de doutorado do meu laboratório. Comece com o procedimento de pré-cultura no cultivo principal, conforme descrito no protocolo de texto.Para criar um novo experimento, abra o software de autocultura Amber e, na guia de introdução, clique, crie um novo experimento. Na nova guia de experimentos, digite o nome do experimento junto com a data em que ele será conduzido. Ative o posto de controle para a estação de cultura nos navios a serem utilizados durante o cultivo.As tags DOE de ação automática também serão ativadas para uma transição fácil durante a programação do experimento DOE. Clique em next"para mudar para a próxima guia. Para definir informações sobre a adição de mídia no vaso, juntamente com anti-espuma, inóculo, alimentação e glicose, ative a placa de mídia de adição"checkpoint.Defina o tipo de placa, nome e localização da placa que contém o meio. Clique em adicionar mídia aos vasos. Digite o volume da mídia a ser adicionada nos vasos.Defina o mapeamento da transferência de mídia da placa para os vasos. Clique em next"para mudar para a próxima guia. Depois que as informações da mídia foram alimentadas no software, atribua as condições de cultivo.Clique em mídia de condição e preencha a temperatura, alvo DO, limite PH superior e RPM de agitação. Em seguida, clique em Agitar"ou descer mexendo. Para definir a adição de inóculos nos vasos, ative a placa celular adicionar.Defina o tipo de placa, nome e localização da placa que contém o meio. Clique em adicionar células aos vasos. Insira o tempo da inoculação e o volume da mídia a ser adicionado aos vasos.Defina o caminho percorrido pelo manipulador líquido para transferir a célula da placa para os vasos. Clique em next"para mudar para a próxima guia. Para definir a adição de ração, glicose e anti-espuma, ative a placa de alimentação adicionar e defina o tipo de placa, nome e localização.Clique em adicionar alimentação aos vasos e digite o volume do feed a ser adicionado aos vasos. Dependendo do cultivo, adicione o número de adição de ração. Para este cultivo, o reator é alimentado após 72 horas a cada 24 horas.Adicione manualmente o atraso de tempo entre a alimentação, inserindo os dados em atraso das células adicionadas. O primeiro dia de alimentação é depois de 72 horas de inoculação, o próximo é depois de 96 horas, e assim por diante. Defina o mapeamento da transferência da alimentação da placa para os vasos.Para definir a amostragem durante o cultivo, ative a placa de amostra de ação e defina o tipo de placa, nome e localização. Verifique a amostra dos vasos e digite o volume da amostra a ser removida dos vasos. Certifique-se de que o volume não diminua abaixo de 10 mililiters durante todo o curso de cultivo.Adicione o número de amostras a serem colhidas durante o cultivo. Semelhante à alimentação, adicione o tempo da amostra sendo removida do vaso para cada ponto de amostra de entrada. Salve o processo.Agora está pronto para execução. Por fim, defina o mapeamento da transferência da amostra dos vasos para a placa. Abra o Software Amber 15 DOE.Clique em investigação" e selecione novo. Digite o nome da nova investigação do DOE na caixa de diálogo da investigação criada. Para atribuir um experimento à investigação do DOE, abra a receita criada para estudar os diferentes parâmetros.Clique em procurar e selecione o respectivo experimento. As etiquetas da nave já estão alistadas na coluna. Para definir o fator DOE desejado, selecione o parâmetro e clique na coluna rotulada, fator DOE.Selecione novas"e adicione as unidades, abreviação, bem como limite inferior e superior dos fatores. Na guia respostas, defina os valores a serem considerados para a análise dos dados. Clique em editar respostas do DOE e defina o nome da resposta, abreviação, unidades e limites mínimos e máximos.Uma vez definidas as respostas, selecione a variável âmbar para cada resposta e defina. Uma resposta pode ser automaticamente associada a uma variável bioreator de micróbios. Escolha a variável necessária na lista suspensa.Alterar a equação para cada resposta, dependendo da exigência. As escolhas entre os dados mínimo, máximo, primeiro, último e médio. Para criar um design, use o Assistente de Design Inicial para selecionar o tipo de design experimental e para adicionar ou remover o número de réplicas e pontos centrais.Selecione o objetivo, que determina a escolha de designs e modelos. Finalize e crie pacotes de trabalho que podem ser importados para o Software de autocultura Âmbar, conforme descrito no protocolo de texto. Na guia do experimento, clique em criar o experimento DOE e navegue pelo pacote de trabalho criado usando o software DOE.Inicialize o processo clicando em iniciar. Uma vez executado o experimento, exporte os dados usando os resultados do DOE de exportação. A janela de resultados do DOE de exportação é aberta, e as linhas que indicam o navio cultural e a estação estão listadas na tabela.Selecione as linhas desejadas e clique em exportar linhas selecionadas"ou exporte dados experimentais" para armazenar todos os resultados e salvar o arquivo para análise suplementar. Importe os dados para o Módulo Amber DOE mudando para a guia resultados e selecionando os resultados de importação. Procure o arquivo de dados desejado e clique em analisar resultados.O crescimento celular nos bioreatores automatizados de micróbios é comparável com os bioreatores multiuso. Comparando a concentração celular de três escalas diferentes, observa-se que o bioreator de micróbio automatizado de 15 mililitros imita o bioreator de vidro de dois litros. Os resultados do frasco de shake também são comparados para exibir o benefício de Amber.A influência da velocidade de agitação diferente e da PH é estudada nos bioreatores de micróbios automatizados. Aqui é mostrada uma comparação da concentração celular viável, ou VCC, e concentração de anticorpos monoclonais nos diferentes bioreatores de micróbios. Pode-se observar a influência negativa do PH 6.9 no VCC.Além disso, o crescimento das células melhorou significativamente sob a cultura em PH 7.3 em comparação com ph 7.1. Aqui estão as parcelas de contorno de resposta do VCC e a concentração de anticorpos monoclonais. Os valores são comparáveis nas embarcações com a mesma velocidade de PH e agitador diferente, indicando que a velocidade do agitador coletada para este processo não tem influência significativa na saída do processo.Todas as instruções dadas à máquina devem ser cuidadosamente escritas para evitar erros durante a execução do experimento. O software é flexível e pode executar uma série de experimentos ao mesmo tempo, reduzindo assim o tempo necessário para otimizar um processo. O desenho do experimento é útil no campo do bioprocesso, pois os resultados dão compreensão do processo baseado em conhecimento, que pode ser estendido a outros organismos até certo ponto.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bioengenharia

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Avaliação global da eficácia e segurança de entrega de droga Placenta-alvo usando três métodos complementares

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