Name: process optimization using high throughput automated micro-bioreactors in chinese hamster ovary cell cultivation
Uploaded: 2020-05-18T12:30:00
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Los autores quieren dar las gracias al Bundesministerium f'r Bildung und Forschung (BMBF), al Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania, y al equipo de Bioprocesamiento de Sartorius Stedim Biotech GmbH, Alemania, por su apoyo.

1. Procedimiento de precultura
NOTA: Para este protocolo se utilizan células CHO DG44 recombinantes con una concentración celular viable de 1 x 107 células/ml.
<ol><li>Descongelar el vial que contiene 1,2 ml de células a temperatura ambiente y transferir inmediatamente la suspensión celular a un tubo centrífugo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de medio de semilla fría.</li>
	<li>Centrifugar el tubo centrírico cónico durante 5 minutos a 190 x g...

<ol>
	<li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biopharmaceutical+benchmarks+2018.">Biopharmaceutical benchmarks 2018.</a> Nature Biotechnology. 36, 1136 (2018).</li><li>Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHO+cells+in+biotechnology+for+production+of+recombinant+proteins:+current+state+and+further+potential.">CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).</li><li>Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+Mammalian+cell+line+development+technologies+for+recombinant+protein+production.">Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production.</a> Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).</li><li>Carlage, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dynamic+changes+in+the+proteome+of+a+Bcl-XL+overexpressing+Chinese+hamster+ovary+cell+culture+during+exponential+and+stationary+phases.">Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases.</a> Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).</li><li>Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. 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Lecture notes in electrical engineering. 39, (2009).</li><li>Bareither, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+disposable+small+scale+reactor+for+high+throughput+bioprocess+development:+a+proof+of+concept+study.">Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).</li><li>Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+cell+culture+flocculation+offer+for+antibody+purification+processes.">What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes.</a> Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).</li><li>Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. 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La optimización del proceso para aumentar el rendimiento es de vital importancia en la industria biofarmacéutica. Los matraces de agitación podrían utilizarse potencialmente para el cribado de la cepa; sin embargo, la supervisión de los parámetros del proceso como pH y DO no están disponibles en los matraces. Los microbiorreactores tienen una ventaja, ya que permiten un seguimiento y control continuos del proceso. Estos bucles de control en el microbiorreactor también proporcionan una condición similar a las de ...

El mercado biofarmacéutico mundial valía más de 250.000 millones de dólares EE.UU. en 2018 y ha ido en continua expansión1. Las compañías farmacéuticas están pasando de producir pequeños fármacos moleculares a terapias producidas biotecnológicamente, como proteínas recombinantes. Estos son los únicos responsables de un ingreso de más de $150 mil millones1. Las células de mamíferos ahora se utilizan ampliamente para la producción de estas proteínas recombinantes farmacéuticas. En el período actual, entre los 68 productos aprobados producidos por células de mamíferos, 57 son producidos por células de ovario de hámster chino (CHO)2. Las células CHO se utilizan específicamente para la producción de proteínas recombinantes que requieren modificaciones post-traduccionales. Estas células son preferidas ya que crecen en una suspensión y, por lo tanto, permiten resultados reproducibles en un medio libre de suero definido químicamente3,,4. La otra ventaja de utilizar células CHO es que la estructura glicana del producto se asemeja a la del anticuerpo monoclonal humano (mAb) y da como resultado un mayor rendimiento proteico recombinante y una productividad específica debido a la amplificación del gen5.
El rendimiento del cultivo celular CHO recombinante (rCHO) se ha multiplicado por cien en las últimas dos décadas. Esta mejora se atribuye a la optimización de los parámetros del proceso, la estrategia de alimentación y el desarrollo del medio libre de suero definido químicamente6. Con el aumento de los requisitos de los productos farmacéuticos, la presión aumenta en el costo y la eficiencia del tiempo para el desarrollo del proceso de producción7. Para reducir la presión y garantizar la calidad del producto, se ha orientado el enfoque de la industria farmacéutica en la calidad por diseño (QbD). QbD se utiliza para comprender la producción del producto, así como el proceso. Una herramienta vital utilizada en el ObD es el Diseño del Experimento (DOE). Ayuda a aumentar la comprensión del proceso al revelar la relación entre varias variables de entrada y los datos de salida resultantes. La aplicación del enfoque DOE para optimizar el bioproceso es beneficiosa durante las primeras etapas del proyecto al asimilar las condiciones del proceso y aumentar la cantidad y calidad del título. Este enfoque es beneficioso en comparación con la estrategia anticuada: un factor a la vez (OFAT). Los enfoques estadísticos del DOE utilizando Classical, Shainin o Taguchi son muy superiores a los OFAT8.
El proceso y la optimización de medios se pueden realizar en matraces de agitación. Los matraces son relativamente baratos. Sin embargo, no es posible controlar parámetros como la temperatura, el pH y el oxígeno disuelto (DO). Para superar estos inconvenientes, se pueden utilizar biorreactores multiusos de sobremesa que van desde un volumen de trabajo de 0,5 L a 5 L. Los reactores proporcionan una amplia supervisión en línea y control de procesos. Sin embargo, el uso del biorreactor multiusos es intensivo en tiempo y mano de obra. Para superar estas desventajas, se utiliza un novedoso biorreactor de un solo uso que combina el proceso integral de monitorización del biorreactor de sobremesa y fácil manejo del matraz de agitación. El sistema de cribado de alto rendimiento y la tecnología de un solo uso han contribuido a mejorar la eficiencia del rendimiento y desarrollo de los procesos9.
En este artículo, se enumeran las pautas para cargar la receta en el software automatizado de microbiorreactor (AMBR). Durante el transcurso de este experimento se estudia la influencia de diferentes velocidades de agitador y pH en la concentración celular viable (VCC) y el titador. El resultado experimental y el análisis se llevan a cabo con el diseño del software de experimento MODDE 12. Los análisis de productos se llevan a cabo en un sistema de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con una columna de proteína A. Se basa en el principio de que la región Fc del mAb se une a la proteína A con alta afinidad10,,11. Con este método, es posible identificar y cuantificar el mAb. La cuantificación se lleva a cabo en las áreas de pico de elución medida a 280 nm.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>A-0040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 mM L-glutamine</td>
			<td>Corning, Merck</td>
			<td>25-005-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well deep well plates</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>A-0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL disposable pipette tips, sterilized</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>A-0039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ambr 15 automated microbioreactor system</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>001-2804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ambr 15 Cell Culture 24 Disposable Bioreactors - Sparged</td>
			<td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td>001-1B86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifoam C Emulsion</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>A8011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Sterile filter</td>
			<td>Corning, Merck</td>
			<td>CLS431474</td>
			<td>0.1 &#956;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CEDEX Detergent (3% Mucosol)</td>
			<td>Roche Innovatis AG</td>
			<td>05-650-658-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Roche Innovatis AG</td>
			<td>05-650-216-001</td>
			<td>CEDEX HiRes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO DG44 cell line</td>
			<td>Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOKO Feed Media A (FMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>CR80025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOKO Feed Media B (FMB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>CR80026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOKO Production Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>CR80027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHOKO Stock Culture Meium</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Merck</td>
			<td>CR80028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromaster high pressure liquid chromatography system</td>
			<td>VWR International</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Centrifuge tube</td>
			<td>Corning, Merck</td>
			<td>SIAL0790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1070179026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>56-40-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Vials</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>SUPLSU860181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich,Merck</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1502226</td>
			<td>POROS&#8482; A 1.7&#160;mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich,Merck</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich,Merck</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>VWRVK940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YSI</td>
			<td>YSI Inc</td>
			<td>2900D</td>
			<td>YSI 2900 Select</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

process optimization using high throughput automated micro-bioreactors in chinese hamster ovary cell cultivation

La optimización de los bioprocesos para aumentar el rendimiento de los productos deseados es importante en la industria biofarmacéutica. Esto se puede lograr mediante la selección de deformaciones unitarias y mediante el desarrollo de parámetros de bioproceso. Los matraces de agitación se han utilizado para este propósito. Sin embargo, carecen de la capacidad de controlar los parámetros del proceso, como el pH y el oxígeno disuelto (DO). Esta limitación se puede superar con la ayuda de un microbiorreactor automatizado. Estos biorreactores imitan el cultivo a mayor escala. Una de las principales ventajas de este sistema es la integración del Diseño de Experimento (DOE) en el software. Esta integración permite establecer un diseño en el que se pueden variar simultáneamente varios parámetros de proceso. Los parámetros críticos del proceso y las condiciones óptimas del bioproceso se pueden analizar dentro del software. El objetivo del trabajo presentado aquí es introducir al usuario en los pasos involucrados en el diseño de procesos en el software y la incorporación del DOE dentro de la ejecución de cultivo.

En la Figura 2se presenta una visión general del cultivo realizado en este estudio.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60577/60577fig02.jpg"> Figura 2: Representación esquemática de las condiciones experimentales para probar perfiles de velocidad de pH y agitador en las estaciones de cultivo. La figura también representa el diseño correcto para colocar los buques. <a href="https://ww...

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Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

Aquí, presentamos un procedimiento detallado para ejecutar un Diseño de Experimento en un microbiorreactor automatizado seguido de cosecha celular y cuantificación de proteínas usando una columna de Proteína A.

Optimización de procesos mediante microbiorreactores automatizados de alto rendimiento en el cultivo de células de ovario de hámster chino

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

En este vídeo, los usuarios introdujeron en el software de microbiorreactor con la planificación y ejecución del diseño de experimentos o DOE. Las válvulas auxiliares de los analizadores también se han demostrado para optimizar la condición del proceso. La incorporación de modet en el software automatizado de microbiorreactor ha sido oficial para el análisis de datos.Un gran número de experimentos se pueden planificar y ejecutar simultáneamente a pequeña escala. Demostrar el procedimiento estará Tamanna Nagraik, estudiante de doctorado de mi laboratorio. Comience con el procedimiento de precultivo en el cultivo principal como se describe en el protocolo de texto.Para crear un nuevo experimento, abra el software de autocultura Amber y, en la pestaña de introducción, haga clic en crear un nuevo experimento. En la nueva pestaña del experimento, escriba el nombre del experimento junto con la fecha en la que se llevará a cabo. Activar el punto de control de la estación de cultivo en los buques que se utilizarán durante el cultivo.Las etiquetas DOE de adición automática también se activarán para una transición fácil durante la programación del experimento DOE. Haga clic en siguiente"para cambiar a la siguiente pestaña. Para establecer información sobre la adición de medios en el recipiente, junto con antiespuma, inóculo, pienso y glucosa, active la placa de medios de adición"punto de control.Defina el tipo de placa, el nombre y la ubicación de la placa que contiene el medio. Haga clic en Agregar medios a los buques. Introduzca el volumen del soporte que se añadirá a los recipientes.Definir el mapeo de la transferencia de medios de la placa a los buques. Haga clic en siguiente"para cambiar a la siguiente pestaña. Después de que la información de los medios de comunicación se haya introducido en el software, asigne las condiciones de cultivo.Haga clic en el medio de condición y rellene la temperatura, la DO objetivo, el límite de PH superior y las RPM de agitación. A continuación, haga clic en Arriba agitando"o hacia abajo revolviendo. Para establecer la adición de inóculos en los recipientes, active agregar placa celular.Defina el tipo de placa, el nombre y la ubicación de la placa que contiene el medio. Haga clic en Agregar celdas a los recipientes. Introduzca el tiempo de inoculación y el volumen de los medios que se añadirán a los buques.Defina la trayectoria recorrida por el manipulador de líquidos para transferir la celda de la placa a los recipientes. Haga clic en siguiente"para cambiar a la siguiente pestaña. Para establecer la adición de alimento, glucosa y la espuma antiespuma, active la placa de alimentación de adición y defina el tipo de placa, el nombre y la ubicación.Haga clic en añadir pienso a los buques e introduzca el volumen de la alimentación que se añadirá a los recipientes. Dependiendo del cultivo, añadir el número de adición de piensos. Para este cultivo, el reactor se alimenta después de 72 horas cada 24 horas.Agregue manualmente el retardo de tiempo entre la alimentación ingresando los datos en el retardo de las células agregadas. El primer día de alimentación es después de 72 horas de inoculación, el siguiente es después de 96 horas, y así sucesivamente. Definir el mapeo de la transferencia de la alimentación de la placa a los recipientes.Para establecer el muestreo durante el cultivo, active la placa de muestra de adición"y defina el tipo de placa, el nombre y la ubicación. Compruebe la muestra de toma de muestra de los recipientes"e introduzca el volumen de la muestra que se va a extraer de los vasos. Asegúrese de que el volumen no disminuya por debajo de 10 mililitros durante todo el curso de cultivo.Añadir el número de muestras a tomar durante el cultivo. De forma similar a la alimentación, añada el tiempo de la muestra que se retira del recipiente para cada punto de muestra de entrada. Guarde el proceso.Ahora está listo para su ejecución. Por último, defina el mapeo de la transferencia de la muestra de los recipientes a la placa. Abra el software Amber 15 DOE.Haga clic en investigación"y seleccione nuevo. Introduzca el nombre de la nueva investigación DOE en el cuadro de diálogo Crear investigación. Para asignar un experimento a la investigación DOE, abra la receta creada para estudiar los diferentes parámetros.Haga clic en Examinar y seleccione el experimento respectivo. Las etiquetas de la nave ya están alistadas en la columna. Para definir el factor DOE deseado, seleccione el parámetro y haga clic en la columna etiquetada, factor DOE.Seleccione new"y agregue las unidades, la abreviatura, así como el límite inferior y superior de los factores. En la pestaña De respuestas, defina los valores que se deben tener en cuenta para el análisis de los datos. Haga clic en editar respuestas DOE y defina el nombre de la respuesta, la abreviatura, las unidades y los límites mínimo y máximo.Una vez definidas las respuestas, seleccione la variable ámbar para cada respuesta y defina. Una respuesta se puede asociar automáticamente con una variable de biorreactor de microbios. Elija la variable necesaria en la lista desplegable.Cambie la ecuación para cada respuesta en función del requisito. Las opciones entre los datos mínimo, máximo, primero, último y promedio. Para crear un diseño, utilice el Asistente para iniciar diseño para seleccionar el tipo de diseño experimental y para agregar o quitar el número de réplicas y puntos centrales.Seleccione el objetivo, que determina la elección de diseños y modelos. Finalice y cree paquetes de trabajo que se puedan importar en el software de autocultura Amber como se describe en el protocolo de texto. En la pestaña del experimento, haga clic en crear el experimento DOE, y busque el paquete de trabajo creado usando el software DOE.Inicialice el proceso haciendo clic en Inicio. Una vez ejecutado el experimento, exporte los datos utilizando los resultados de la exportación del DOE. Se abre la ventana de resultados del DOE de exportación y las filas que indican el buque de referencia cultural y la estación se enumeran en la tabla.Seleccione las filas deseadas y haga clic en exportar filas seleccionadas"o exportar datos experimentales"para almacenar todos los resultados y guardar el archivo para su posterior análisis. Importe los datos en el módulo Amber DOE cambiando a la pestaña results y seleccionando los resultados de importación. Busque el archivo de datos deseado y haga clic en Analizar resultados.El crecimiento celular en los biorreactores automatizados de microbios es comparable con los biorreactores multiusos. Al comparar la concentración celular de tres escalas diferentes, se observa que el biorreactor automatizado de microbios de 15 mililitros imita el biorreactor de vidrio de dos litros. Los resultados del matraz de agitación también se comparan para exhibir el beneficio de Amber.La influencia de la velocidad de agitación y PH se estudia en los biorreactores automatizados de microbios. Aquí se muestra una comparación de la concentración celular viable, o VCC, y la concentración de anticuerpos monoclonales en los diferentes biorreactores de microbios. Se puede observar la influencia negativa de PH 6.9 en el VCC.Además, el crecimiento de las células mejoró significativamente bajo el cultivo en PH 7.3 en comparación con PH 7.1. Aquí se muestran las gráficas de contorno de respuesta de VCC y la concentración de anticuerpos monoclonales. Los valores son comparables en los recipientes con el mismo PH y diferente velocidad del agitador, lo que indica que la velocidad del agitador recogida para este proceso no tiene ninguna influencia significativa en la salida del proceso.Cada instrucción dada a la máquina debe escribirse cuidadosamente para evitar errores durante la ejecución del experimento. El software es flexible y puede ejecutar una serie de experimentos a la vez, reduciendo así la cantidad de tiempo necesario para optimizar un proceso. El diseño del experimento es útil en el campo del bioproceso, ya que los resultados proporcionan una comprensión del proceso basada en el conocimiento, que puede extenderse a otros organismos hasta cierto punto.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Desarrollar ovario de hámster chino anfitrión-ensayos con células de proteínas utilizando la tecnología de membrana acústica de micropartículas

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Investigación

Bioingeniería

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De alto rendimiento de una sola célula y múltiple las células de micro-encapsulación

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