Name: a revised method for inducing secondary lymphedema in the hindlimb of mice
Uploaded: 2019-11-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Revised Method for Inducing Secondary Lymphedema in the Hindlimb of Mice at JoVE.com

Les auteurs remercient Peter Bollen, chef du Laboratoire biomédical, d'avoir prêté l'équipement nécessaire pour enregistrer les images vues à travers les microscopes.

Les animaux étaient hébergés dans l'établissement de soins aux animaux de l'Université du Danemark méridional, conformément aux lignes directrices de l'établissement. Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par l'Inspection des expériences animales, ministère de l'Environnement et de l'Alimentation du Danemark.
1. Irradiation pré-chirurgicale
REMARQUE : L'irradiation préchirurgicale a lieu 7 jours avant la chirurgie.
...

<ol>
	<li>Lawenda, B. D., Mondry, T. E., Johnstone, P. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphedema:+a+primer+on+the+identification+and+management+of+a+chronic+condition+in+oncologic+treatment.">Lymphedema: a primer on the identification and management of a chronic condition in oncologic treatment.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 59 (1), 8-24 (2009).</li><li>Greene, A. K., Greene, A. K., Slavin, S. A., Brorson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+morbidity+of+lymphedema.">Epidemiology and morbidity of lymphedema.</a> Lymphedema: Presentation, Diagnosis, and Treatment. , 33-44 (2015).</li><li>Hespe, G. E., Nores, G. G., Huang, J. J., Mehrara, B. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+transfer+and+perinodal+lymphatic+growth+factor+treatment+for+lymphedema.">Lymph node transfer and perinodal lymphatic growth factor treatment for lymphedema.</a> Annals of Surgery. 257 (5), 961-967 (2013).</li><li>Wang, G. Y., Zhong, S. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+surgical+lymphedema+research--a+systematic+review.">Animal models in surgical lymphedema research--a systematic review.</a> Journal of Surgical Research. 200 (1), 208-220 (2016).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Chronic+Lymphedema+in+a+Revised+Mouse+Model.">Quantification of Chronic Lymphedema in a Revised Mouse Model.</a> Annals of Plastic Surgery. 81 (5), 594-603 (2018).</li><li>Frueh, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+volumetry+versus+conventional+measuring+techniques+for+the+assessment+of+experimental+lymphedema+in+the+mouse+hindlimb.">High-resolution 3D volumetry versus conventional measuring techniques for the assessment of experimental lymphedema in the mouse hindlimb.</a> Scientific Reports. 6, 34673 (2016).</li><li>Biau, D. J., Kerneis, S., Porcher, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistics+in+brief:+the+importance+of+sample+size+in+the+planning+and+interpretation+of+medical+research.">Statistics in brief: the importance of sample size in the planning and interpretation of medical research.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (9), 2282-2288 (2008).</li><li>Korula, P., Varma, S. K., Sunderrao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+wound+contraction+by+point-to-point+adherent+splintage.">Inhibition of wound contraction by point-to-point adherent splintage.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 95 (4), 725-730 (1995).</li><li>Komatsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Drainage+During+Wound+Healing+in+a+Hindlimb+Lymphedema+Mouse+Model.">Lymph Drainage During Wound Healing in a Hindlimb Lymphedema Mouse Model.</a> Lymphatic Research and Biology. 15 (1), 32-38 (2017).</li></ol>

Il y a quelques étapes critiques dans ce protocole. Tout d'abord, il est important que les chercheurs prennent des précautions de sécurité lorsqu'ils travaillent avec la radioactivité. Deuxièmement, pendant la partie chirurgicale de ce protocole, il est important de commencer la procédure une fois que la souris a été anesthésié et le terminer sans pauses inutiles. Ceci est important pour éviter une période chirurgicale excessivement longue pour l'animal et pour éviter que l'anesthésie perde l'effet pendant...

Le lymphœdème est caractérisé par une accumulation de liquide lymphatique qui conduit à un gonflement des tissus localisés, qui se produit principalement en raison d'une altération ou perturbé le flux lymphatique dans les vaisseaux lymphatiques1. Le flux lymphatique peut être altéré ou perturbé par une infection, une obstruction, une blessure ou des malformations congénitales dans le système lymphatique2. Ces étiologies ont comme conséquence l'accumulation du fluide lymphatique, qui mène à un état chronique d'inflammation, ayant pour résultat la fibrose suivante, aussi bien que le dépôt du tissu adipeux3. Le lymphœdème peut être classé comme lymphoedème primaire ou secondaire. Le lymphœdème primaire est causé par des anomalies du développement ou une mutation génétique2,4. Le lymphœdème secondaire se produit en raison d'une maladie systémique sous-jacente, d'une chirurgie oud'untraumatisme2,4. Le lymphœdème secondaire est la forme la plus commune de lymphœdème dans le monde2. Dans les pays développés, la cause la plus fréquente de lymphœdème secondaire est la thérapie oncologique comme la radiothérapie adjuvante et la dissection des ganglions lymphatiques5. Le lymphœdème est plus fréquent chez les patientes atteintes d'un cancer du sein, mais peut également se développer chez les patients atteints de cancer gynécologique, mélanome, génito-urinaire ou cervical6. Il a été suggéré que de toutes les femmes diagnostiquées avec le cancer du sein, 21% développeront le lymphœdème7.
Le lymphœdème peut être stressant pour le patient à la fois physiquement et psychologiquement. Les patients atteints de lymphœdème ont un risque accru d'infection5,8,9, mauvaise qualité de vie et peut développer une anxiété sociale et des symptômes de dépression10. Les complications du lymphœdème chronique conduisent au coût élevé des soins et à une charge accrue de la maladie9,11. Les résultats ont également suggéré que le lymphœdème pourrait être associé à un risque accru de décès après le traitement du cancer du sein12. La gestion conservatrice telle que la compression de la zone affectée, le drainage lymphatique manuel et les soins de la peau généraux demeurent l'approche de première ligne. Il n'existe actuellement aucun traitement curatif6. Bien que des progrès aient été réalisés dans le domaine de la thérapie chirurgicale et médicale, il y a encore place à l'amélioration. Plus de recherche, fournissant la perspicacité dans la pathophysiologie et la progression de la maladie, est nécessaire pour permettre aux cliniciens de fournir de meilleures options de traitement pour les patients5.
Des modèles animaux sont utilisés dans la recherche préclinique pour comprendre la physiopathologie des maladies et développer des options de traitement potentielles. Plusieurs modèles animaux de lymphœdème différents ont été établis chez les canines13,14, lapins15, moutons16, porcs17,18 et les rongeurs19,20, 21,22,23,24. Le modèle de rongeur semble être le modèle le plus rentable, lors de l'étude de la reconstruction de la fonction lymphatique, en raison des rongeurs étant facilement accessibles et relativement peu coûteux25. La majorité des modèles de souris se sont concentrés sur induire le lymphœdème dans la queue des souris21,22,23. Le modèle de queue est très fiable mais la technique chirurgicale exacte pour induire le lymphœdème varie considérablement dans le matériel publié précédemment. Ceci a comme conséquence des fluctuations dans la durée et la robustesse du lymphœdème développé présenté dans la litière connue25. Différentes techniques sont également utilisées pour induire le lymphœdème dans le modèle de l'arrière-pays et elles donnent également des résultats variables, mais le modèle de membre postérieur pourrait être plus facile à comprendre d'un point de vue translationnel. Les modèles précédents de lymphœdème ont été entravés par la résolution spontanée de lymphœdème et donc un modèle reproductible et permanent de lymphœdème est nécessaire25. Les chercheurs ont déjà essayé d'augmenter la dose de rayonnement, pour empêcher la résolution spontanée de lymphœdème, mais ceci a souvent mené à la morbidité grave suivante25.
Ce modèle a comme conséquence le lymphœdème statistiquement significatif, sans causer la morbidité grave, en combinant la microchirurgie avec la radiothérapie. Le modèle a été révisé à partir d'un modèle chirurgical précédent en ajoutant une dose d'irradiation qui induit le lymphœdème, sans causer de morbidité sévère26. Il offre également une excellente occasion pour la formation en microchirurgie. L'accès à l'équipement microchirurgical et au microscope est nécessaire, en raison des petites structures anatomiques des souris. L'intervention chirurgicale peut être effectuée lorsque l'utilisateur a appris des techniques microchirurgicales de base, telles que la suture avec des instruments microchirurgicaux. Les opérateurs qui ont effectué cette procédure ont tous regardé des vidéos didacticiels d'Acland sur les conditions préalables des compétences microchirurgicales (1981) et de la technique de base de la microsuture (1985). Nous recommandons de pratiquer l'intervention chirurgicale 8 à 10 fois avant de l'utiliser dans la recherche. La pratique de la procédure garantit que moins d'erreurs sont commises et que la procédure peut être effectuée plus efficacement. Une fois maîtrisée, l'intervention chirurgicale peut être effectuée en 45 minutes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-0 Nylon suture</td>
			<td>S&#38;T</td>
			<td>12051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Nylon suture - Dafilon</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>C0933112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coagulator - ICC 50</td>
			<td>ERBE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicators</td>
			<td>Yibon medical co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>09-0190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic retractors</td>
			<td>Odense University Hospital</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical clipper</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0,315 mg/ml</td>
			<td>Matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad - PhysioSuite</td>
			<td>Kent Scientific Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1000mg Attane</td>
			<td>Scan Vet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer - PPV</td>
			<td>Penlon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro jewler forceps</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>1405-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>25679-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>10128-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tying forceps</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>43953-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfine U-40 syringe 0,5ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>328821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance syringe 25g</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance syringe 27g</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam 5 mg/ml (hameln)</td>
			<td>Matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder - Circle wood</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>08-0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non woven swabs</td>
			<td>Selefa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opmi pico microscope F170</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patent blue V - 25 mg/ml</td>
			<td>Guerbet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors - Joseph</td>
			<td>BD</td>
			<td>RH1630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner</td>
			<td>Siemens pre-clinical solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source of radiation - D3100</td>
			<td>Gulmay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stata Statistical Software: Release 15</td>
			<td>StataCorp LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic - 0,2 mg</td>
			<td>Indivior</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet eye ointment - viscotears</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a revised method for inducing secondary lymphedema in the hindlimb of mice

Les modèles animaux sont d'une importance primordiale dans la recherche sur le lymphœdème afin de comprendre la physiopathologie de la maladie, mais aussi d'explorer les options de traitement potentielles. Ce modèle de souris permet aux chercheurs d'induire un lymphœdème significatif d'une durée d'au moins 8 semaines. Le lymphœdème est induit à l'aide d'une combinaison de radiothérapie fractionnée et d'ablation chirurgicale des lymphatiques. Ce modèle exige que les souris reçoivent une dose de 10 rayonnements gris (Gy) avant et après la chirurgie. La partie chirurgicale du modèle implique la ligature de trois vaisseaux lymphatiques et l'extraction de deux ganglions lymphatiques de l'arrière-pays de la souris. Avoir accès à des outils microchirurgicaux et un microscope est essentiel, en raison des petites structures anatomiques des souris. L'avantage de ce modèle est qu'il se traduit par un lymphœdème statistiquement significatif, qui fournit une bonne base pour évaluer différentes options de traitement. C'est également une option grande et facilement disponible pour la formation microchirurgicale. La limitation de ce modèle est que la procédure peut prendre du temps, surtout si elle n'est pas pratiquée à l'avance. Le modèle donne lieu à un lymphœdème quantifiable objectif chez la souris, sans causer de morbidité sévère et a été testé dans trois projets distincts.

Cette procédure a déjà été utilisée dans trois expériences distinctes. Toutes les expériences ont été faites par différents chercheurs principaux qui sont tous co-auteurs de cet article. Dans les trois expériences, un grand soin a été pris pour adhérer à la même procédure que décrite dans ce protocole. Dans chacun des trois expériences, le lymphœdème secondaire a été induit dans un membre postérieur tandis que l'autre membre postérieur a servi de contrôle. Les v...

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A Revised Method for Inducing Secondary Lymphedema in the Hindlimb of Mice

Ce modèle animal permet aux chercheurs d'induire un lymphœdème secondaire statistiquement significatif dans le membre postérieur des souris, d'une durée d'au moins 8 semaines. Le modèle peut être utilisé pour étudier la physiopathologie du lymphœdème et pour étudier de nouvelles options de traitement.

Une méthode révisée pour induire le lymphœdème secondaire dans le Hindlimb des souris

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore ...

Le but global de cette méthode est d’induire le lymphœdème secondaire cohérent dans l’arrière-point des souris sans causer la morbidité grave. Cette méthode peut être utilisée pour induire un lymphœdème secondaire chez l’arrière-point des souris. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle résout le lymphœdème insignifiant durant au moins huit semaines sans causer de morbidité grave.Quelqu’un de nouveau à la procédure peut lutter avec les techniques microchirurgical. Nous recommandons donc une formation microchirurgicale et plusieurs procédures de pratique pour assurer un résultat positif, mais aussi pour préparer le chercheur afin qu’il puisse effectuer la procédure plus efficacement. Configurer la source de rayonnement et anesthésier la souris telle que décrite dans le protocole.Placez un tampon de plomb de 1,5 millimètre d’épaisseur pour vous assurer que seule la zone qui subit une intervention chirurgicale est irradié. L’exemple montré est celui d’une souris post-chirurgicale pour clarifier la zone. Administrer une dose de 10 irradiation grise.Les chercheurs doivent prendre des précautions lorsqu’ils travaillent avec les radiations. Au cours de cette expérience, toute irradiation a été effectuée dans une pièce isolée par rayonnement. Et la source des radiations n’a été activée que lorsque tout le personnel a quitté la pièce.Pesez la souris avant la chirurgie. Examiner la profondeur anesthésique par test de pincement de patte ou de queue. Raser la jambe choisie pour la procédure.Réglez l’écoulement de l’oxygène à 0,8 litres par minute. Connectez-le avec un cône de nez. Appliquer de l’onguent ophtalmique.Injecter 0,5 millilitres de solution saline sous-cutanée, de préférence dans le scruff de la souris pour prévenir l’hypovolémie pendant la chirurgie. Placez la souris sur le tissu chirurgical en position supine. Placez le cône avant sur le museau.Fixez doucement l’extrémité des limites postérieures avec du ruban adhésif, pour empêcher la souris de se déplacer pendant la chirurgie. Soulevez la peau avec des forceps lisses et coupez une petite ouverture d’environ cinq millimètres proximale à la fossa popliteal. Glissez des ciseaux pointus dans l’ouverture et coupez vers le genou, de sorte que l’incision se termine juste au-dessus du genou.Assurez-vous de ne pas percer les vaisseaux sous-jacents, en soulevant la peau avec des pinces lors de la coupure. Déplacez la souris en position couchée et complétez l’incision circonférentielle. Disséquer la peau à quelques millimètres au-dessus de l’angle.N’oubliez pas de garder le tissu humide avec de la solution saline stérile pendant toute la procédure. Rétractez la peau de la plaie proximale avec un rétracteur élastique. Et assurez-vous que la veine sciatique est visible comme indiqué.Injectez 0,01 millilitres Patent Blue V sous-cutanément entre le deuxième et le troisième toe. Appuyez doucement sur la patte à quelques reprises pour distribuer le Brevet Bleu V.La distribution du Patent Blue V peut être vu à travers le microscope. Les structures nécessaires pour être visualisées sont, le vaisseau lymphatique proximal, PLV, le ganglion lymphatique popliteal, PLN, le premier vaisseau lymphatique distal, DLV1, et le deuxième vaisseau lymphatique distal, DLV2.Grossir pour visualiser le PLV et le ligate à l’aide d’une suture en nylon 10-0. Appuyez sur la patte pour vous assurer qu’aucun Bleu Brevet ne passe proximal à la ligature. Ligate les deux vaisseaux lymphatiques distal comme indiqué.Appuyez plusieurs fois à nouveau sur la patte pour vous assurer qu’aucun Brevet Bleu V ne passe proximal à la ligature. Dans cet exemple, on peut voir que l’un des vaisseaux lymphatiques éclate en raison de la ligature qui entrave le flux lymphatique. Enlevez le ganglion lymphatique popliteal, le ganglion lymphatique a une surface perlière lisse et est coloré par le V bleu brevet en contraste avec le tissu adipeux environnant.Avant d’enlever la garniture inguinale de graisse, cautériser ce navire comme indiqué. Ensuite, retirez le tampon de graisse en un seul morceau. Assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement actif.Il s’agit d’un exemple d’un ganglion lymphatique inguinal situé. Le ganglion lymphatique situé dans la garniture inguinale de graisse est rarement coloré par le V bleu de brevet et peut être difficile à différencier de la graisse. Enlever la graisse en un seul morceau est la meilleure façon de s’assurer que le ganglion lymphatique a été enlevé.Suture les bords de la peau vers le bas pour le fascia musculaire, avec une suture en nylon 6-0 à l’aide de forceps et porte-aiguille, laissant un écart de deux à trois millimètres, pour limiter le flux lymphatique superficiel. Il s’agit d’un exemple des sutures finies, dans la fossa popliteal, le côté latéral de l’arrière-bord, au-dessus du genou, et le côté médial de la limite arrière. Administrer l’analgésie et peser la souris après la chirurgie, puis la placer dans une armoire chauffée pour la récupération.Répétez la procédure d’irradiation pré-chirurgicale. Ce graphique montre le volume moyen combiné de l’arrière-point de trois études distinctes dans les huit semaines suivant la chirurgie. 31 souris ont été incluses au total.L’axe x représente des semaines après la chirurgie. L’axe y représente le volume de la limite postérieur en millimètres cubes. Les barres fléchées représentent l’écart type.Il faut s’attendre à ce que l’enflure de la chirurgie et le lymphœdème induit diminue au cours des quatre premières semaines. Après les quatre premières semaines, nous voyons un état relativement stable de lymphœdème. Le volume de l’arrière-point de contrôle augmente pendant les huit semaines, disant ainsi strictement la différence de volume entre l’arrière-point de lymphœdème et l’a hindlimb de contrôle, ceci était inattendu.La cause est spéculée pour être que les souris ont employé leur limite postérieur non actionnée plus que l’arrière-point actionné dans les semaines suivant la chirurgie. Cela pourrait conduire à l’hypertrophie de l’arrière-train de contrôle et peut-être expliquer l’augmentation du volume. Pour les chiffres individuels sur les trois études incluses, veuillez lire le protocole.Ce tableau montre le test de comparaison multiple de Sidak pour les mesures combinées du volume des trois études incluses. La valeur P calculée montre qu’il y a une différence statistiquement significative entre les limites postérieures avec lymphœdème induit et les limites postérieures de contrôle, pendant les huit semaines de suivi. Pour une analyse statistique individuelle sur les trois projets inclus, veuillez lire le protocole.Cette méthode induit un lymphœdème statistiquement significatif, d’une durée d’au moins huit semaines. La procédure peut être utilisée pour étudier la pétrificialité du lymphœdème et pour rechercher de nouvelles options de traitement. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir acquis une compréhension de la façon d’induire un lymphœdème secondaire dans l’arrière-point des souris, en utilisant une combinaison de microchirurgie et d’irradiation avant et après la chirurgie.Une fois maîtrisée, l’intervention chirurgicale peut être effectuée en 45 minutes.

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