Name: a revised method for inducing secondary lymphedema in the hindlimb of mice
Uploaded: 2019-11-02T14:00:00
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Gli autori ringraziano Peter Bollen, capo del Laboratorio Biomedico per aver prestato le attrezzature necessarie per registrare le riprese viste attraverso i microscopi.

Gli animali erano ospitati presso l'University of Southern Denmark Animal Care Facility secondo le linee guida istituzionali. Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Ispettorato per gli esperimenti sugli animali, dal Ministero dell'Ambiente e degli alimenti della Danimarca.
1. Irradiazione pre-operatoria
NOTA: L'irradiazione pre-chirurgica avviene 7 giorni prima dell'intervento chirurgico.
<ol><li>Indurre l'anestesia.<ol>
<li>...

<ol>
	<li>Lawenda, B. D., Mondry, T. E., Johnstone, P. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphedema:+a+primer+on+the+identification+and+management+of+a+chronic+condition+in+oncologic+treatment.">Lymphedema: a primer on the identification and management of a chronic condition in oncologic treatment.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 59 (1), 8-24 (2009).</li><li>Greene, A. K., Greene, A. K., Slavin, S. A., Brorson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+morbidity+of+lymphedema.">Epidemiology and morbidity of lymphedema.</a> Lymphedema: Presentation, Diagnosis, and Treatment. , 33-44 (2015).</li><li>Hespe, G. E., Nores, G. G., Huang, J. J., Mehrara, B. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+Review+of+the+Surgical+Treatment+of+Extremity+Lymphedema.">Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema.</a> Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).</li><li>DiSipio, T., Rye, S., Newman, B., Hayes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+unilateral+arm+lymphoedema+after+breast+cancer:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Incidence of unilateral arm lymphoedema after breast cancer: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Oncology. 14 (6), 500-515 (2013).</li><li>Douglass, J., Graves, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Care+for+Management+of+Secondary+Lymphedema:+A+Systematic+Review.">Self-Care for Management of Secondary Lymphedema: A Systematic Review.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (6), e0004740 (2016).</li><li>Shih, Y. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+for+lymphedema+in+rabbit+ear.">An experimental model for lymphedema in rabbit ear.</a> Microsurgery. 4 (4), 236-242 (1983).</li><li>Tobbia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphedema+development+and+lymphatic+function+following+lymph+node+excision+in+sheep.">Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep.</a> Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).</li><li>Lahteenvuo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+factor+therapy+and+autologous+lymph+node+transfer+in+lymphedema.">Growth factor therapy and autologous lymph node transfer in lymphedema.</a> Circulation. 123 (6), 613-620 (2011).</li><li>Honkonen, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+transfer+and+perinodal+lymphatic+growth+factor+treatment+for+lymphedema.">Lymph node transfer and perinodal lymphatic growth factor treatment for lymphedema.</a> Annals of Surgery. 257 (5), 961-967 (2013).</li><li>Wang, G. Y., Zhong, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+experimental+lymphedema+in+rats'+limbs.">A model of experimental lymphedema in rats' limbs.</a> Microsurgery. 6 (4), 204-210 (1985).</li><li>Oashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+acquired+lymphedema+in+the+mouse+hind+limb:+a+preliminary+report.">A new model of acquired lymphedema in the mouse hind limb: a preliminary report.</a> Annals of Plastic Surgery. 69 (5), 565-568 (2012).</li><li>Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Return+of+lymphatic+function+after+flap+transfer+for+acute+lymphedema.">Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema.</a> Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).</li><li>Cheung, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimental+model+for+the+study+of+lymphedema+and+its+response+to+therapeutic+lymphangiogenesis.">An experimental model for the study of lymphedema and its response to therapeutic lymphangiogenesis.</a> BioDrugs : Clinical Immunotherapeutics, Biopharmaceuticals and Gene Therapy. 20 (6), 363-370 (2006).</li><li>Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+surgical+lymphedema+research--a+systematic+review.">Animal models in surgical lymphedema research--a systematic review.</a> Journal of Surgical Research. 200 (1), 208-220 (2016).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Chronic+Lymphedema+in+a+Revised+Mouse+Model.">Quantification of Chronic Lymphedema in a Revised Mouse Model.</a> Annals of Plastic Surgery. 81 (5), 594-603 (2018).</li><li>Frueh, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+volumetry+versus+conventional+measuring+techniques+for+the+assessment+of+experimental+lymphedema+in+the+mouse+hindlimb.">High-resolution 3D volumetry versus conventional measuring techniques for the assessment of experimental lymphedema in the mouse hindlimb.</a> Scientific Reports. 6, 34673 (2016).</li><li>Biau, D. J., Kerneis, S., Porcher, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistics+in+brief:+the+importance+of+sample+size+in+the+planning+and+interpretation+of+medical+research.">Statistics in brief: the importance of sample size in the planning and interpretation of medical research.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (9), 2282-2288 (2008).</li><li>Korula, P., Varma, S. K., Sunderrao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+wound+contraction+by+point-to-point+adherent+splintage.">Inhibition of wound contraction by point-to-point adherent splintage.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 95 (4), 725-730 (1995).</li><li>Komatsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Drainage+During+Wound+Healing+in+a+Hindlimb+Lymphedema+Mouse+Model.">Lymph Drainage During Wound Healing in a Hindlimb Lymphedema Mouse Model.</a> Lymphatic Research and Biology. 15 (1), 32-38 (2017).</li></ol>

Ci sono alcuni passaggi critici in questo protocollo. In primo luogo, è importante che i ricercatori prendano precauzioni di sicurezza quando lavorano con la radioattività. In secondo luogo, durante la parte chirurgica di questo protocollo, è importante iniziare la procedura una volta che il mouse è stato anetizzato e finirlo senza interruzioni inutili. Questo è importante per evitare un periodo chirurgico eccessivamente lungo per l'animale e per evitare che l'anestesia perda effetto durante l'intervento chirurgico....

Il linfedema è caratterizzato da un accumulo di fluido linfatico che porta al gonfiore del tessuto localizzato, che si verifica principalmente a causa di un flusso alterato o interrotto del fluido linfatico nei vasi linfatici1. Il flusso linfatico può essere alterato o interrotto da infezione, ostruzione, lesioni o difetti congeniti nel sistema linfatico2. Queste eziologie provocano l'accumulo di liquido linfatico, che porta ad uno stato cronico di infiammazione, con conseguente successiva fibrosi, così come la deposizione del tessuto adiposo3. Il linfedema può essere classificato come linfedema primario o secondario. Il linfedema primario è causato da anomalie dello sviluppo omutazionegenetica 2,4. Linfedema secondario si verifica a causa della malattia sistemica sottostante, chirurgia o trauma2,4. Il linfedema secondario è la forma più comune di linfedema nel mondo2. Nei paesi sviluppati, la causa più comune del linfedema secondario è la terapia oncologica come la radioterapia adiuvante e la dissezione dei linfonodi5. Il linfedema è più frequente tra i pazienti affetti da cancro al seno, ma può anche svilupparsi in pazienti con ginecologia, melanoma, cancro genitourinario o al collo6. È stato suggerito che su tutte le donne diagnosticate con cancro al seno, il 21% svilupperà il linfedema7.
Il linfodema può essere stressante per il paziente sia fisicamente che psicologicamente. I pazienti con linfedema hanno un aumentato rischio di infezione5,8,9, scarsa qualità della vita e possono sviluppare ansia sociale e sintomi di depressione10. Le complicazioni del linfedema cronico portano ad un alto costo delle cure e ad un aumento del carico di malattia9,11. I risultati hanno anche suggerito che il linfedema potrebbe essere associato ad un aumento del rischio di morte dopo il trattamento del cancro al seno12. La gestione conservativa come la compressione dell'area interessata, il drenaggio manuale della linfa e la cura generale della pelle rimangono il primo approccio di linea. Attualmente non esiste un trattamento curativo6. Anche se sono stati fatti progressi nel campo della terapia chirurgica e medica, c'è ancora spazio per migliorare. Sono necessarie ulteriori ricerche, che forniscono informazioni sulla fisiopatologia e la progressione della malattia, per consentire ai medici di fornire migliori opzioni di trattamento per i pazienti5.
I modelli animali vengono utilizzati nella ricerca preclinica per comprendere la fisiopatologia delle malattie e sviluppare potenziali opzioni di trattamento. Diversi modelli animali di linfedema sono stati stabiliti in canini13,14, conigli15, pecore16, maiali17,18 e roditori19,20, 21,22,23,24. Il modello dei roditori sembra essere il modello più conveniente, quando si studia la ricostruzione della funzione linfatica, a causa della facilità accessibili dei roditori e relativamente a basso prezzo25. La maggior parte dei modelli di topi si sono concentrati sull'indurre linfedema nella coda dei topi21,22,23. Il modello di coda è molto affidabile, ma l'esatta tecnica chirurgica per indurre il linfedema varia in modo significativo nel materiale pubblicato in precedenza. Ciò si traduce in fluttuazioni di durata e robustezza del linfedema sviluppato presentato in litterature noto25. Diverse tecniche vengono utilizzate anche per indurre linfedema nel modello dell'arto posteriore e producono anche risultati variabili, ma il modello dell'arto posteriore potrebbe essere più facile da capire da una prospettiva traslazionale. Precedenti modelli di linfedema sono stati ostacolati dalla risoluzione spontanea del linfedema e quindi è necessario un modello di linfedema riproducibile e permanente25. I ricercatori hanno già cercato di aumentare la dose di radiazioni, per prevenire la risoluzione spontanea del linfedema, ma questo ha spesso portato a successiva grave morbilità25.
Questo modello si traduce in linfedema statisticamente significativo, senza causare grave morbilità, combinando microchirurgia con radiazioni. Il modello è stato rivisto da un precedente modello chirurgico aggiungendo una dose di irradiazione che induce il linfedema, senza causare grave morbilità26. Offre anche una grande opportunità per l'allenamento microchirurgico. Avere accesso a apparecchiature microchirurgiche e un microscopio è necessario, a causa delle piccole strutture anatomiche dei topi. La procedura chirurgica può essere eseguita quando all'utente sono state insegnate tecniche microchirurgiche di base, come la sutura con strumenti microchirurgici. Gli operatori che hanno eseguito questa procedura tutti guardato video tutorial da Acland sui presupposti di abilità microchirurgiche (1981) e tecnica di microsutura di base (1985). Si consiglia di praticare la procedura chirurgica 8-10 volte prima di utilizzarlo nella ricerca. La pratica della procedura garantisce che vengano commessi meno errori e che la procedura possa essere eseguita in modo più efficiente. Quando masterizzato, la procedura chirurgica può essere eseguita in 45 minuti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-0 Nylon suture</td>
			<td>S&#38;T</td>
			<td>12051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Nylon suture - Dafilon</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>C0933112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coagulator - ICC 50</td>
			<td>ERBE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicators</td>
			<td>Yibon medical co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>09-0190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic retractors</td>
			<td>Odense University Hospital</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical clipper</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0,315 mg/ml</td>
			<td>Matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad - PhysioSuite</td>
			<td>Kent Scientific Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1000mg Attane</td>
			<td>Scan Vet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer - PPV</td>
			<td>Penlon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro jewler forceps</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>1405-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>25679-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>10128-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tying forceps</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>43953-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfine U-40 syringe 0,5ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>328821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance syringe 25g</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance syringe 27g</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam 5 mg/ml (hameln)</td>
			<td>Matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder - Circle wood</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>08-0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non woven swabs</td>
			<td>Selefa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opmi pico microscope F170</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patent blue V - 25 mg/ml</td>
			<td>Guerbet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors - Joseph</td>
			<td>BD</td>
			<td>RH1630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner</td>
			<td>Siemens pre-clinical solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source of radiation - D3100</td>
			<td>Gulmay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stata Statistical Software: Release 15</td>
			<td>StataCorp LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic - 0,2 mg</td>
			<td>Indivior</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet eye ointment - viscotears</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a revised method for inducing secondary lymphedema in the hindlimb of mice

I modelli animali sono di fondamentale importanza nella ricerca del linfedema per comprendere la fisiopatologia della malattia, ma anche per esplorare le potenziali opzioni di trattamento. Questo modello murino consente ai ricercatori di indurre linfedema significativo della durata di almeno 8 settimane. Il linfodatama viene indotto utilizzando una combinazione di radioterapia frazionata e ablazione chirurgica dei linfatici. Questo modello richiede che i topi ottono una dose di radiazioni da 10 Gray (Gy) prima e dopo l'intervento chirurgico. La parte chirurgica del modello prevede la legatura di tre linfatici e l'estrazione di due linfonodi dall'arto posteriore del topo. Avere accesso a strumenti microchirurgici e un microscopio è essenziale, a causa delle piccole strutture anatomiche dei topi. Il vantaggio di questo modello è che si traduce in linfedema statisticamente significativo, che fornisce una buona base per valutare diverse opzioni di trattamento. È anche una grande e facilmente disponibile opzione per l'allenamento microchirurgico. La limitazione di questo modello è che la procedura può richiedere molto tempo, soprattutto se non praticata in anticipo. Il modello si traduce in linfedema oggettivamente quantificabile nei topi, senza causare grave morbilità ed è stato testato in tre progetti separati.

Questa procedura è stata precedentemente utilizzata in tre esperimenti separati. Tutti gli esperimenti sono stati fatti da diversi ricercatori principali che sono tutti co-autori di questo articolo. In tutti e tre gli esperimenti, è stata prestata molta attenzione ad aderire alla stessa procedura descritta in questo protocollo. In tutti e tre gli esperimenti, il linfedema secondario è stato indotto in un arto posteriore, mentre l'altro limbh posteriore fungeva da controllo. I volumi de...

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A Revised Method for Inducing Secondary Lymphedema in the Hindlimb of Mice

Questo modello animale consente ai ricercatori di indurre linfedema secondario statisticamente significativo nell'arto posteriore dei topi, della durata di almeno 8 settimane. Il modello può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia del linfedema e per studiare nuove opzioni di trattamento.

Un metodo rivisto per indurre il linfomal secondario nell'Hindlimb dei topi

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore ...

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di indurre un linfedema secondario coerente nell'arto posteriore dei topi senza causare grave morbilità. Questo metodo può essere utilizzato per indurre un linfedema secondario nell'arto posteriore dei topi. Il vantaggio principale di questo metodo è che risolve un linfedema insignificante della durata di almeno otto settimane senza causare grave morbilità.Qualcuno nuovo alla procedura può lottare con le tecniche microchirurgiche. Raccomandiamo quindi la formazione microchirurgica e diverse procedure pratiche per garantire un risultato positivo, ma anche per preparare il ricercatore in modo che possa eseguire la procedura in modo più efficiente. Impostare la sorgente di radiazioni e anestetizzare il mouse come descritto nel protocollo.Posizionare un cuscinetto di piombo spesso 1,5 millimetri per assicurarsi che solo l'area sottoposta a intervento chirurgico venga irradiata. L'esempio mostrato è di un topo post-operatorio per chiarire l'area. Somministrare una dose di 10 irradiazioni grigie.I ricercatori devono prendere precauzioni quando lavorano con le radiazioni. Durante questo esperimento tutta l'irradiazione è stata eseguita in una stanza isolata dalle radiazioni. E la sorgente di radiazioni è stata accesa solo quando tutto il personale aveva lasciato la stanza.Pesare la pre-operazione del topo. Esaminare la profondità anestetica mediante test di avvicinamento delle zampe o della coda. Radere la gamba scelta per la procedura.Impostare il flusso di ossigeno su 0,8 litri al minuto. Collegalo con un cono del naso. Applicare unguento oftalmico.Iniettare 0,5 millilitri di soluzione salina per via sottocutanea, preferibilmente nello scruff del topo per prevenire l'ipovolemia durante l'intervento chirurgico. Posizionare il mouse sul panno chirurgico in posizione supina. Posizionare il cono del naso sopra il muso.Fissare delicatamente l'estremità degli arti posteriori con il nastro adesivo, per evitare che il mouse si sposti durante l'intervento chirurgico. Sollevare la pelle con forcep lisce e ritagliare una piccola apertura di circa cinque millimetri prossimale alla fossa poplitea. Fai scorrere le forbici affilate nell'apertura e aggancia verso il ginocchio, in modo che l'incisione finisca appena sopra il ginocchio.Assicurarsi di non forare i vasi sottostanti, sollevando la pelle con pini durante il ritaglio. Spostare il mouse in posizione prona e completare l'incisione circonferenziale. Sezionare la pelle a un paio di millimetri sopra l'angolo.Ricorda di mantenere il tessuto umido con soluzione salina sterile durante l'intera procedura. Ritrarre la pelle del ferito prossimale con un retrattile elastico. E assicurati che la vena sciatica sia visibile come mostrato.Iniettare 0,01 millilitri Patent Blue V per via sottocutanea tra il secondo e il terzo dito. Premere delicatamente la zampa un paio di volte per distribuire il Patent Blue V.La distribuzione del Patent Blue V può essere vista attraverso il microscopio. Le strutture da visualizzare sono, il vaso linfatico prossimale, PLV, il linfonodo popliteo, PLN, il primo vaso linfatico distale, DLV1, e il secondo vaso linfatico distale, DLV2.Ingrandire per visualizzare il PLV e ligarlo utilizzando una sutura in nylon 10-0. Premere la zampa per assicurarsi che nessun patent blue passi prossimale alla legatura. Ligate i due vasi linfatici distale come mostrato.Premere di nuovo la zampa più volte per assicurarsi che nessun Patent Blue V passi prossimale alla legatura. In questo esempio, si può vedere che uno dei vasi linfatici esplode a causa della legatura che ostacola il flusso linfatico. Rimuovere il linfonodo popliteo, il linfonodo ha una superficie liscia simile a una perla ed è colorato dal Patent Blue V in contrasto con il tessuto adiposo circostante.Prima di rimuovere il cuscinetto di grasso inguinale, cauterizzare questo vaso come mostrato. Quindi rimuovere il fat pad in un unico pezzo. Assicurati che non ci sia sanguinamento attivo.Questo è un esempio di linfonodo inguinale localizzato. Il linfonodo situato nel cuscinetto grasso inguinale è raramente colorato dal Patent Blue V e può essere difficile da differenziare dal grasso. Rimuovere il cuscinetto grasso in un unico pezzo è il modo migliore per garantire che il linfonodo sia stato rimosso.Suturare i bordi della pelle fino alla fascia muscolare, con una sutura di nylon 6-0 usando pinza e porta ago, lasciando uno spazio da due a tre millimetri, per limitare il flusso linfatico superficiale. Questo è un esempio delle suture finite, nella fossa poplitea, nel lato laterale dell'arto posteriore, sopra il ginocchio e nel lato mediale dell'arto posteriore. Somministrare l'analgesia e pesare il topo dopo l'intervento chirurgico, quindi posizionare in un armadio riscaldato per il recupero.Ripetere la procedura per l'irradiazione pre-chirurgica. Questo grafico mostra il volume medio combinato dell'arto posteriore di tre studi separati nelle otto settimane successive all'intervento chirurgico. 31 topi sono stati inclusi in totale.L'asse x rappresenta settimane dopo l'intervento chirurgico. L'asse y rappresenta il volume dell'arto posteriore in millimetri cubi. Le barre freccia rappresentano la deviazione standard.È da aspettarsi che il gonfiore dell'intervento chirurgico e il linfedema indotto diminuiscano durante le prime quattro settimane. Dopo le prime quattro settimane vediamo uno stato relativo stabile di linfedema. Il volume dell'arto posteriore di controllo aumenta durante le otto settimane, dicendo così rigorosamente la differenza di volume tra l'arto posteriore del linfedema e l'arto posteriore di controllo, questo è stato inaspettato.Si ipotizza che i topi usino il loro ostacolo non operato più dell'arto posteriore operato nelle settimane successive all'intervento chirurgico. Questo potrebbe portare all'ipertrofia dell'ostacolo di controllo e forse spiegare l'aumento di volume. Per le singole cifre sui tre studi inclusi si prega di leggere il protocollo.Questa tabella mostra il test di confronto multiplo di Sidak per le misurazioni combinate del volume dei tre studi inclusi. Il valore P calcolato mostra che esiste una differenza statisticamente significativa tra gli arti posteriori con linfedema indotto e gli arti posteriori di controllo, durante tutte e otto le settimane di follow-up. Per l'analisi statistica individuale sui tre progetti inclusi si prega di leggere il protocollo.Questo metodo induce un linfedema statisticamente significativo, della durata di almeno otto settimane. La procedura può essere utilizzata per studiare la petrificialità del linfedema e per ricercare nuove opzioni di trattamento. Dopo aver visto questo video, dovresti aver acquisito una comprensione di come indurre il linfedema secondario nell'arto posteriore dei topi, usando una combinazione di microchirurgia e irradiazione pre e post-chirurgica.Una volta padroneggiata, la procedura chirurgica può essere eseguita in 45 minuti.

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