Name: a revised method for inducing secondary lymphedema in the hindlimb of mice
Uploaded: 2019-11-02T14:00:00
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著者らは、顕微鏡を通して見た映像を記録するために必要な機器を貸し出してくれたバイオメディカル研究所のピーター・ボレン所長に感謝する。

動物は、機関のガイドラインに従って、南デンマーク大学動物介護施設に収容されました.動物の被験者に関するすべての手順は、デンマーク環境・食品省動物実験検査所によって承認されています。
1. 手術前照射
注:手術前照射は手術の7日前に行われます。
<ol><li>麻酔を誘発する。<ol>
<li>誘導ボックスにマウスを入れ、気化器を酸素流量0.8−1.2 L/m...

<ol>
	<li>Lawenda, B. D., Mondry, T. E., Johnstone, P. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphedema:+a+primer+on+the+identification+and+management+of+a+chronic+condition+in+oncologic+treatment.">Lymphedema: a primer on the identification and management of a chronic condition in oncologic treatment.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 59 (1), 8-24 (2009).</li><li>Greene, A. K., Greene, A. K., Slavin, S. A., Brorson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+morbidity+of+lymphedema.">Epidemiology and morbidity of lymphedema.</a> Lymphedema: Presentation, Diagnosis, and Treatment. , 33-44 (2015).</li><li>Hespe, G. E., Nores, G. G., Huang, J. J., Mehrara, B. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+node+transfer+and+perinodal+lymphatic+growth+factor+treatment+for+lymphedema.">Lymph node transfer and perinodal lymphatic growth factor treatment for lymphedema.</a> Annals of Surgery. 257 (5), 961-967 (2013).</li><li>Wang, G. Y., Zhong, S. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+experimental+lymphedema+in+rats'+limbs.">A model of experimental lymphedema in rats' limbs.</a> Microsurgery. 6 (4), 204-210 (1985).</li><li>Oashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+acquired+lymphedema+in+the+mouse+hind+limb:+a+preliminary+report.">A new model of acquired lymphedema in the mouse hind limb: a preliminary report.</a> Annals of Plastic Surgery. 69 (5), 565-568 (2012).</li><li>Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+surgical+lymphedema+research--a+systematic+review.">Animal models in surgical lymphedema research--a systematic review.</a> Journal of Surgical Research. 200 (1), 208-220 (2016).</li><li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Chronic+Lymphedema+in+a+Revised+Mouse+Model.">Quantification of Chronic Lymphedema in a Revised Mouse Model.</a> Annals of Plastic Surgery. 81 (5), 594-603 (2018).</li><li>Frueh, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+volumetry+versus+conventional+measuring+techniques+for+the+assessment+of+experimental+lymphedema+in+the+mouse+hindlimb.">High-resolution 3D volumetry versus conventional measuring techniques for the assessment of experimental lymphedema in the mouse hindlimb.</a> Scientific Reports. 6, 34673 (2016).</li><li>Biau, D. J., Kerneis, S., Porcher, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistics+in+brief:+the+importance+of+sample+size+in+the+planning+and+interpretation+of+medical+research.">Statistics in brief: the importance of sample size in the planning and interpretation of medical research.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (9), 2282-2288 (2008).</li><li>Korula, P., Varma, S. K., Sunderrao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+wound+contraction+by+point-to-point+adherent+splintage.">Inhibition of wound contraction by point-to-point adherent splintage.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 95 (4), 725-730 (1995).</li><li>Komatsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+Drainage+During+Wound+Healing+in+a+Hindlimb+Lymphedema+Mouse+Model.">Lymph Drainage During Wound Healing in a Hindlimb Lymphedema Mouse Model.</a> Lymphatic Research and Biology. 15 (1), 32-38 (2017).</li></ol>

このプロトコルには、いくつかの重要な手順があります。第一に、放射能を扱う際には安全対策を講じることが重要です。第二に、このプロトコルの外科的部分の間に、マウスが麻酔された後に処置を開始し、不必要な休憩なしでそれを終わらせることが重要である。これは、動物の過度に長い手術期間を避け、麻酔が手術中に効果を失うことを防ぐために重要です。麻酔薬の1つのボーラス...

リンパ浮腫は、局所的な組織腫脹につながるリンパ液の蓄積を特徴とし、これは主にリンパ管1におけるリンパ液の流れの障害または破壊によって生じる。リンパ系2における感染、閉塞、傷害または先天性欠陥によってリンパ流が損なわれたり、破壊されたりする。これらの病因は、炎症の慢性状態につながるリンパ液の蓄積をもたらし、その後の線維化、ならびに脂肪組織3の沈着をもたらす。リンパ浮腫は、原発性または二次リンパ浮腫として分類することができる。原発性リンパ浮腫は、発達異常または遺伝子変異によって引き起こされる2、4。二次リンパ浮腫は、基礎的な全身性疾患、手術または外傷2、4のために生じる。二次リンパ浮腫は、世界で最も一般的なリンパ浮腫の形態である 2.先進国では、二次リンパ浮腫の最も一般的な原因は、アジュバント放射線療法やリンパ節解離5などのオンコロジー療法である。リンパ浮腫は乳癌患者の間で最も頻繁であるが、婦人科、黒色腫、泌尿生殖器または頸部癌6の患者においても発症し得る。乳がんと診断されたすべての女性のうち、21%がリンパ浮腫7を発症することが示唆されている。
リンパ浮腫は、身体的にも心理的にも患者にストレスを与える可能性があります。リンパ浮腫の患者は、感染のリスクが高い5,8,9, 生活の質が悪く、社会不安やうつ病 10 の症状を発症する可能性があります。慢性リンパ浮腫の合併症は、高いケアコストと増加した疾患負担9、11につながります。所見はまた、リンパ浮腫が乳癌治療12後の死亡リスクの増加に関連している可能性を示唆している。患部の圧縮、手動リンパドレナージ、一般的なスキンケアなどの保守的な管理は、最初のラインアプローチのままです。現在、治癒治療はありません6.外科・医療の分野では進歩を遂げていますが、まだ改善の余地があります。より多くの研究は、疾患の病態生理学および進行に関する洞察を提供し、臨床医が患者に対してより良い治療オプションを提供することを可能にするために必要である5。
動物モデルは、疾患の病態生理学を理解し、潜在的な治療オプションを開発するために、前臨床研究で使用されています。いくつかの異なるリンパ浮腫動物モデルは、イヌ13、14、ウサギ15、羊16、豚17、18とげっ歯類19、20で確立されています。 21、22、23、24.げっ歯類モデルは、リンパ機能の再構築を調査する際に、げっ歯類が容易にアクセスでき、比較的低価格の25に起因する、最も費用対効果の高いモデルのようです。マウスモデルの大半は、マウス21、22、23の尾部にリンパ浮腫を誘導することに焦点を当てている。尾部モデルは非常に信頼できるが、リンパ浮腫を誘発するための正確な外科技術は以前に出版された材料で有意に異なる。これは、既知のゴミ捨て場25に提示される発達リンパ浮腫の持続時間および堅牢性の変動をもたらす。後肢モデルでリンパ浮腫を誘導するために異なる技術が使用されており、それらはまた様々な結果をもたらすが、後肢モデルは翻訳の観点から理解しやすいかもしれない。以前のリンパ浮腫モデルは自発的リンパ浮腫分解能によって妨げられているので、再現性と永久的なリンパ浮腫モデルが必要です25.研究者は以前、自発的なリンパ浮腫の分解能を防ぐために放射線の線量を増やそうとしましたが、これはしばしばその後の重度の罹患率25につながっています。
このモデルは、微小手術と放射線を組み合わせることにより、重度の罹患率を引き起こすことなく、統計的に有意なリンパ浮腫をもたらす。モデルは、重篤な罹患率26を引き起こすことなく、リンパ浮腫を誘発する照射の用量を追加することによって、以前の外科モデルから改訂された。また、マイクロサージカルトレーニングの絶好の機会です。マウスの小さな解剖学的構造のために、マイクロサージカル装置と顕微鏡へのアクセスが必要です。外科的処置は、ユーザーがマイクロ手術器具で縫合するなど、基本的な微小外科技術を教えられたときに行うことができる。この手順を実行したオペレータは、すべてマイクロサージカルスキル(1981)と基本的なマイクロ縫合技術(1985)の前提条件に関するAclandによるチュートリアルビデオを見ました。研究に使用する前に、8-10回の手術を行うお勧めします。手順を練習すると、ミスが少なくなり、手順をより効率的に実行できます。マスターすると、外科的処置は45分で行うことができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10-0 Nylon suture</td>
			<td>S&#38;T</td>
			<td>12051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Nylon suture - Dafilon</td>
			<td>B Braun</td>
			<td>C0933112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coagulator - ICC 50</td>
			<td>ERBE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped applicators</td>
			<td>Yibon medical co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>09-0190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastic retractors</td>
			<td>Odense University Hospital</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical clipper</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0,315 mg/ml</td>
			<td>Matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad - PhysioSuite</td>
			<td>Kent Scientific Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1000mg Attane</td>
			<td>Scan Vet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer - PPV</td>
			<td>Penlon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro jewler forceps</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>1405-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Needle holder</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>25679-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>10128-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tying forceps</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>43953-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfine U-40 syringe 0,5ml</td>
			<td>BD</td>
			<td>328821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance syringe 25g</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance syringe 27g</td>
			<td>BD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam 5 mg/ml (hameln)</td>
			<td>Matrix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder - Circle wood</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>08-0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non woven swabs</td>
			<td>Selefa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opmi pico microscope F170</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patent blue V - 25 mg/ml</td>
			<td>Guerbet</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors - Joseph</td>
			<td>BD</td>
			<td>RH1630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner</td>
			<td>Siemens pre-clinical solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Source of radiation - D3100</td>
			<td>Gulmay</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stata Statistical Software: Release 15</td>
			<td>StataCorp LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic - 0,2 mg</td>
			<td>Indivior</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vet eye ointment - viscotears</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a revised method for inducing secondary lymphedema in the hindlimb of mice

動物モデルは、病気の病態生理学を理解するだけでなく、潜在的な治療オプションを探求するためにリンパ浮腫の研究において最も重要である。このマウスモデルは、研究者が少なくとも8週間持続する有意なリンパ浮腫を誘発することを可能にする。リンパ浮腫は、分画放射線療法とリンパ薬の外科的アブレーションの組み合わせを使用して誘導される。このモデルは、マウスが手術の前後に10グレー(Gy)放射線の用量を得ることを必要とします。モデルの外科的部分は、3つのリンパ管の結び合合とマウス後肢からの2つのリンパ節の抽出を含む。マウスの小さな解剖学的構造のために、マイクロ外科ツールと顕微鏡へのアクセスが不可欠です。このモデルの利点は、統計的に有意なリンパ浮腫をもたらし、異なる治療オプションを評価するための良好な基礎を提供することです。それはまたマイクロ外科の訓練のための大きく、容易に利用できる選択である。このモデルの制限は、特に事前に練習していない場合、手順に時間がかかる可能性が高いということです。このモデルは、重篤な罹患率を引き起こすことなく、マウスにおいて客観的に定量可能なリンパ浮腫をもたらし、3つの別々のプロジェクトで試験されている。

この手順は、以前に 3 つの別々の実験で使用されています。すべての実験は、すべてこの記事の共同執筆者である異なるリード研究者によって行われました。3つの実験すべてにおいて、このプロトコルで説明したのと同じ手順に従うように細心の注意を払った。3つの実験すべてにおいて、二次リンパ浮腫は一方の後肢に誘発され、もう一方の後肢はコントロールと?...

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A Revised Method for Inducing Secondary Lymphedema in the Hindlimb of Mice

この動物モデルは、研究者がマウスの後肢で統計的に有意な二次リンパ浮腫を誘導することを可能にし、少なくとも8週間持続する。モデルはリンパ浮腫の病態生理学を研究し、新しい処置の選択を調査するために使用することができる。

マウスの後肢における二次リンパ浮腫を誘導する改訂方法

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore ...

この方法の全体的な目標は、重篤な罹患率を引き起こすことなく、マウスの後肢に一貫した二次性リンパ浮腫を誘導することです。この方法は、マウスの後肢に二次リンパ浮腫を誘導するために使用することができる。この方法の主な利点は、重度の罹患率を引き起こすことなく、少なくとも8週間持続する重要でないリンパ浮腫を解決することです。処置に新しい誰かが微小外科的技術に苦労するかもしれない。したがって、我々は、成功した結果を確保するだけでなく、彼または彼女がより効率的に手順を実行できるように研究者を準備するために、微小外科トレーニングといくつかの練習手順をお勧めします。プロトコルに記載されているように、放射線の発生源を設定し、マウスを麻酔します。1.5ミリメートルの厚さのリードパッドを置き、手術を受けた領域のみが照射されるようにします。図示の例は、領域を明確にする術後マウスの例である。10グレイ照射の用量を投与する。研究者は放射線を扱う際に予防措置を講じなければならない。この実験の間、全ての照射は、放射断熱室で行った。そして、放射線源は、すべての人員が部屋を出たときにのみオンになりました。マウスの手術前の重さを量る。足または尾のピンチテストによって麻酔の深さを調べてください。手順に選択した脚を剃ります。酸素の流れを毎分0.8リットルに設定します。ノーズコーンと接続します。眼科軟膏を適用します。0.5ミリリットルの生理食塩水を皮下に注入し、手術中の低ボル血症を予防するためにマウスの擦り傷に好ましい。手術用布の上にマウスを置きます。鼻のコーンを鼻の上に置きます。後肢の端をテープで優しく固定し、手術中にマウスがシフトするのを防ぎます。滑らかな鉗子で皮膚を持ち上げ、約5ミリメートル近くにある小さな開口部をポジタルフォッサにクリップします。鋭いはさみを開口部にスライドさせ、膝に向かってクリップし、切開が膝のすぐ上で終わるようにします。クリッピング中に鉗子で皮膚を持ち上げることによって、下の血管を穿刺しないようにしてください。マウスを動かしやすい位置に移動し、円周切開を完了します。角度の上に数ミリメートルに皮膚を解剖します。全体の手順の間に滅菌生理布地で組織を湿らせておいてください。弾性レトラクタで近位創傷の皮膚を引き込む。そして、坐骨神経静脈が示すように見えるように確認してください。2番目と3番目のつま先の間に0.01ミリリットルの特許Blue Vを皮下に注入する。パテントブルーVを分配するために2、3回軽く足を押すと、特許ブルーVの分布は顕微鏡を通して見ることができる。可視化が必要な構造は、近位リンパ管、PLV、大窩リンパ節、PLN、第1遠位リンパ管、DLV1、および第2遠位リンパ管DLV2である。PLVを視覚化し、10-0ナイロン縫合糸を使用してそれをリゲートするために拡大します。パテントブルーが合字に近位を渡さないことを確認するために足を押してください。図のように2つの遠位リンパ管をリゲートします。パテントブルーVが合字に近位を通過しないように、もう一度足を数回押してください。この例では、合字がリンパの流れを妨げているためにリンパ管の1つが破裂することが分かる。このポピタルリンパ節を取り除き、リンパ節は平滑な真珠様表面を有し、周囲の脂肪組織とは対照的に特許ブルーVによって着色される。イングイナル脂肪パッドを取り外す前に、図のようにこの容器を焼灼する。その後、脂肪パッドを1枚で取り出します。アクティブな出血がないことを確認してください。これは、位置するリンパ節の例です。イングイナル脂肪パッドに位置するリンパ節は、特許Blue Vによって着色されることはまれであり、脂肪と区別するのが難しい場合があります。脂肪パッドを1枚で取り除くことは、リンパ節が確実に取り除かれていることを確認する最良の方法です。皮膚の縁を筋筋膜に縫合し、鉗子と針ホルダーを使用した6-0ナイロン縫合糸を使用し、2〜3ミリメートルの隙間を残し、表面的なリンパ流を制約する。これは、完成した縫合糸の一例であり、その後肢の側側、膝の上、後肢の内側側の、大小窩の中にある。鎮痛を投与し、マウスの術後の重量を量り、回復のために加熱されたキャビネットに置きます。手術前の照射の手順を繰り返します。このグラフは、手術後8週間の3つの別々の研究の平均後肢容積を示す。合計で31匹のマウスが含まれていた。X軸は手術後数週間を表す。y 軸は、後肢の体積を立方ミリメートル単位で表します。矢印バーは標準偏差を表します。手術による腫脹と誘発リンパ浮腫は、最初の4週間で減少することが予想される。最初の4週間後、リンパ浮腫の相対的な安定した状態が見られます。コントロール後肢の体積は8週間の間に増加し、したがってリンパ浮腫後肢とコントロール後肢の体積の差を厳密に言うが、これは予想外であった。原因は、マウスが手術後数週間に手術後肢よりも非操作後肢を使用したと推測されている。これは、コントロール後肢の肥大につながる可能性があり、多分量の増加を説明.含まれる3つの研究の個々の数字については、プロトコルをお読みください。この表は、3つの組み込み研究の体積測定値を組み合わせたシダックの多重比較検定を示しています。計算されたP値は、8週間のフォローアップの間に、誘発リンパ浮腫と対照後肢を有する後肢との間に統計的に有意な差があることを示している。含まれる3つのプロジェクトの個々の統計分析については、プロトコルをお読みください。この方法は、統計的に有意なリンパ浮腫を誘導し、少なくとも8週間続く。この手順は、リンパ浮腫の石化性を研究し、新しい治療オプションを研究するために使用することができます。このビデオを見た後、マイクロサージャリーと手術前および手術後の照射の組み合わせを使用して、マウスの後肢に二次リンパ浮腫を誘発する方法を理解する必要があります。一度マスターすると、外科的処置は45分で行うことができる。

Research

JoVE Journal

Medicine

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