Name: in vivo augmentation of gut-homing regulatory t cell induction
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Bureau du sous-secrétaire à la Défense pour les affaires de santé dans le cadre du Programme de recherche médicale révisé par les pairs dans le cadre du Prix No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Les opinions, les interprétations, les conclusions et les recommandations sont celles de l'auteur et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la Défense. Ce travail a également été partiellement soutenu par des subventions pour l'innovation en recherche du Département de médecine de l'Université de Loma Linda (681207-2967 [XT et GG], 681205-2967 [XT], et 325491 [DJB]).

Tous les protocoles d'étude des animaux in vivo ont été examinés et approuvés par le Loma Linda University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ainsi que par le Bureau d'examen des soins et de l'utilisation des animaux (ACURO) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) de l'US Army Medical Research and M...

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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells,+engineered+to+overexpress+25-hydroxyvitamin+D+1alpha-hydroxylase+and+pulsed+with+a+myelin+antigen,+provide+myelin-specific+suppression+of+ongoing+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis.</a> FASEB J. , (2017).</li><li>Narula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+High-Dose+Vitamin+D3+Supplementation+in+Patients+with+Crohn's+Disease+in+Remission:+A+Pilot+Randomized+Double-Blind+Controlled+Study.">Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study.</a> Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).</li><li>Ahmad, S. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D3+Induces+Tolerance+in+Human+Dendritic+Cells+by+Activation+of+Intracellular+Metabolic+Pathways.">Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways.</a> Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).</li><li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing,+IL-10-producing+regulatory+T+cells.">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li></ol>

Dans cet article nous décrivons l'utilisation des cellules de DC-CYP-ALDH, pour augmenter l'induction des cellules de Treg d'intestin-homing dans les tissus lymphoïdes périphériques. Nos données ont montré que les cellules DC-CYP-ALDH peuvent synthétiser localement des concentrations élevées de novo de 1,25 (OH)2D et RA in vitro en présence de substrats correspondants (c.-à-d. 25[OH]D et rétinol, respectivement). Puisque les concentrations suffisantes de sang de 25(OH)D et de rétinol peuvent être...

La maladie intestinale inflammatoire (MII) est une maladie chronique inflammatoire dans le tractus gastro-intestinal (GUT). Aux États-Unis, il y a environ 1,4 million de patients atteints de MII. Il est généralement admis qu'une réponse immunitaire dysrégulée aux bactéries intestinales déclenche la maladie et perturbe la barrière épithéliale muqueuse1,2. Pour cette raison, actuellement disponibles U.S. Food and Drug Administration (FDA) médicaments approuvés inhibent les fonctions des médiateurs inflammatoires ou de bloquer le homing des cellules immunitaires dans l'intestin. Cependant, les médiateurs inflammatoires et les cellules immunitaires qui sont ciblées sont également nécessaires pour les défenses immunitaires. En conséquence, les inhibiteurs inflammatoires de médiateur compromettent la défense immunitaire systémique et les bloqueurs de homing de cellules immunitaires affaiblissent la défense immunisée d'intestin, qui peuvent mener aux conséquences graves3,4. En outre, les bloqueurs de homing de cellules immunitaires peuvent également bloquer le homing des cellules t (Treg) réglementaires dans l'intestin et ainsi peuvent aggraver la tolérance immunitaire d'intestin déjà compromise dans les patients d'IBD. En outre, le blocage de la cellule Treg homing dans l'intestin peut également conduire à la suppression immunitaire systémique en raison de l'accumulation de cellules Treg dans le sang5. Enfin, les inhibiteurs et les bloqueurs fonctionnent de façon transitoire et, par conséquent, nécessitent des administrations fréquentes. L'administration fréquente de ces inhibiteurs et bloqueurs peut exacerber davantage les effets secondaires fâcheux.
Récemment, nous avons proposé une nouvelle stratégie qui peut potentiellement atténuer ou même éliminer les effets secondaires associés aux médicaments actuels pour le traitement des MII6. Cette stratégie augmente l'induction des cellules Treg intestinales dans les tissus lymphoïdes périphériques6. La raison d'être de cette stratégie est que les cellules Treg gut-homing spécifiquement à la maison à l'intestin et donc ne compromettra pas les défenses immunitaires systémiques. En outre, puisque les cellules de Treg peuvent potentiellement former la mémoire7,8, cellules de Treg gut-homing peuvent potentiellement fournir un contrôle stable de l'inflammation chronique d'intestin dans les patients d'IBD et, ainsi, le traitement ne devrait pas devoir être administré aussi fréquemment. En outre, puisque cette stratégie augmente l'induction de cellules Treg gut-homing in vivo, il n'a pas le souci de l'instabilité in vivo dans un environnement hautement proinflammatoire qui est associé au transfert adoptif des cellules Treg générées in vitro9,10. À cet égard, les cellules Treg générées in vitro sont l'une des stratégies proposées pour le traitement des maladies auto-immunes11,12,13 et le rejet de transplantation14,15. Enfin, dans cette stratégie, les cellules dendritiques (DC) sont conçues pour produire localement des concentrations élevées de deux molécules de novo : la vitamine D active (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) et la vitamine A active (acide rétinoïque ou RA). Nous avons choisi 1,25(OH)2D et RA parce que 1,25 (OH)2D peut induire l'expression de molécules régulatrices (p. ex., boîte à fourche P3 [foxp3] et interleukine-10 [IL-10])16,17 et que la RA peut stimuler l'expression des récepteurs gut-homing dans les lymphocytes T18. Parce que les deux 1,25(OH)2D et RA peut également tolériser DCs28,29, nous raison non plus que les DC machinés seront maintenus de façon stable dans un statut tolérogène in vivo et donc contourner les préoccupations d'instabilité in vivo qui sont associés à des DC tolérogènes générés in vitro (TolDCs)19,20,21. À cet égard, les TolDC sont également l'une des stratégies proposées pour l'augmentation in vivo des fonctions cellulaires Treg19,20,21. Pour soutenir notre raisonnement, nous avons montré que les DC s'est fait ingénieur, lors d'une livraison in vivo, peut augmenter l'induction des cellules Treg intestinales dans les tissus lymphoïdes périphériques6.
Un autre avantage de notre stratégie proposée est que 1,25 (OH)2D a également d'autres fonctions qui peuvent potentiellement bénéficier aux patients atteints de MII. Ces autres fonctions comprennent la capacité de 1,25 (OH)2D pour stimuler la sécrétion d'antimicrobiens22 et pour supprimer la carcinogenèse23. Les infections et les cancers sont fréquemment associés aux MII24,25.
Pour générer les DC qui peuvent produire localement des concentrations élevées de 1,25 (OH)2D et RA de novo, nous utilisons un vecteur lentiviral pour concevoir des DC pour surexprimer deux gènes. Un gène est la famille cytochrome P450 27 sous-famille B membre 1 (CYP27B1) qui code 25-hydroxyvitamine D 1-hydroxylase (1-hydroxylase), qui catalyse physiologiquement la synthèse de 1,25 (OH)2D. L'autre gène est la déhydrogénase d'aldéhyde 1 membre de la famille A2 (ALDH1a2) qui code la déhydrogénase rétinienne 2 (RALDH2), qui catalyse physiologiquement la synthèse de RA6.
Parce que l'augmentation in vivo de l'induction des cellules Treg intestinale est potentiellement importante dans le traitement des MII, dans le protocole suivant, nous détaillerons les procédures de production des DC de 1-hydroxylase-RALDH2-overexpressing (dC-CYP-ALDH) qui peut être utilisé pour l'étude future des cellules de Treg gut-homing in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 03-377-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 20 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# H4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>Cat# 01700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CYP27B1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab95047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-10-D cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-10-R cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-4-D cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab205718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Cat# 391340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-CYP-ALDH</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5&#39; KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine GM-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14-841-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11140076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMVR8.74</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid# 22036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMD2G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid# 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 15 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 50 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# AM12502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polycloncal IgG isotype control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab171870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement</td>
			<td>Heartland Assays</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 21870076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell strainers, 40 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-201-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile storage bottles, 500 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# CLS431432</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo augmentation of gut-homing regulatory t cell induction

La maladie intestinale inflammatoire (MII) est une maladie chronique inflammatoire dans le tractus gastro-intestinal (GUT). Aux États-Unis, il y a environ 1,4 million de patients atteints de MII. Il est généralement admis qu'une réponse immunitaire dysrégulée aux bactéries intestinales déclenche la maladie et perturbe la barrière épithéliale muqueuse. Nous avons récemment montré que les cellules T (Treg) réglementaires gut-homing sont une thérapie prometteuse pour IBD. En conséquence, cet article présente un protocole pour l'augmentation in vivo de l'induction de cellules de Treg gut-homing. Dans ce protocole, les cellules dendritiques sont conçues pour produire localement des concentrations élevées de deux molécules de novo, la vitamine Active D (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) et la vitamine A active (acide rétinoïque ou RA). Nous avons choisi 1,25 (OH)2D et RA basé sur des résultats précédents montrant que 1,25 (OH)2D peut induire l'expression de molécules régulatrices (par exemple, boîte de tête de fourchette P3 et interleukine-10) et que la RA peut stimuler l'expression des récepteurs gut-homing dans les cellules T. Pour générer de telles cellules dendritiques machinées, nous utilisons un vecteur lentiviral pour transduire les cellules dendritiques pour surexprimer deux gènes. Un gène est la famille cytochrome P450 27 membre de la sous-famille B 1 qui code 25-hydroxyvitamine D 1-hydroxylase, qui catalyse physiologiquement la synthèse de 1,25 (OH)2D. L'autre gène est le déshydrogénase aldéhyde 1 membre de la famille A2 qui code la déshydrogénase rétinienne 2, qui catalyse physiologiquement la synthèse de la PR. Ce protocole peut être utilisé pour l'étude future des cellules de Treg gut-homing in vivo.

Les cellules de DC-CYP-ALDH ont exprimé la quantité sensiblement accrue de 1-hydroxylase. Pour déterminer si les cellules DC-CYP-ALDH générées à partir de BMDCs ont exprimé une quantité significativement accrue de cellules de 1-hydroxylase, les BMDC ont été transduisés avec le virus lenti-CYP-ALDH pour produire des cellules DC-CYP-ALDH dérivées de la moelle osseuse (cellules BMDC-CYP-ALDH). Par la suite, les cellules bMDC-CYP-ALDH ont été examinées pour l'expression de 1-hydroxylase par ...

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In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Ici nous présentons un protocole pour l'augmentation in vivo de l'induction réglementaire de cellule T d'intestin-homing. Dans ce protocole, les cellules dendritiques sont conçues pour produire localement des concentrations élevées de la vitamine Active D (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) et de la vitamine A active (acide rétinoïque ou RA) de novo.

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

Ce protocole décrit une stratégie thérapeutique potentiellement nouvelle qui peut être facilement modifiée pour des applications humaines. Cette technique améliore directement l’induction des lymphocytes T régulation gut-homing dans les tissus lymphoïdes périphériques et peut être habilement mis en œuvre, même dans des environnements hautement pro-inflammatoires. Ces techniques peuvent également être utilisées pour étudier le rôle de la vitamine D active et de la vitamine A dans le système immunitaire périphérique.Cette démonstration visuelle fournira des instructions étape par étape pour la génération de cellules dendritiques d’ingénierie de haute qualité qui sont essentielles au succès de cette technique. Commencez par ensemencer une fois 10 aux sept cellules 293T dans 20 millilitres de milieu de culture cellulaire CM-10-D en 150 par 25 plaques de culture millimétriques pour une incubation de 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, ajoutez 1,62 millilitres de solution HBS fraîchement préparée à deux concentrés, 9,5 microgrammes de plasmide d’enveloppe, 17,5 microgrammes de plasmide d’emballage et 27 microgrammes du plasmide LENTI-CYP-ALDH à un tube conique de 50 millilitres.Porter le volume final du contenu du tube jusqu’à 3,0375 millilitres avec de l’eau, suivi de l’ajout de 202,5 microlitres de deux molaires de chlorure de calcium dans le sens de la goutte. Laissez le mélange de précipitations d’ADN à température ambiante pendant 20 minutes avec un mélange occasionnel avant d’ajouter 3,24 millilitres de la solution dropwise par culture 293T tout en tourbillonnant doucement le plat. Placez les assiettes dans l’incubateur pendant 24 heures avant de laver doucement chaque assiette avec du PBS et de nourrir les cellules avec un milieu de culture CM-4-D.Après encore 24 heures de culture, récolter les supernatants dans des bouteilles stériles pour le stockage à quatre à huit degrés Celsius et nourrir les cellules avec cm-4-D moyen frais pendant encore 24 heures. Le quatrième jour, récolter à nouveau les supernatants et filtrer les supernatants des trois jours et quatre à un filtre de 0,45 micromètre. Ensuite, concentrez le virus pseudotypé VSV-G par centrifugation pendant 24 heures.Le lendemain décanter les supernatants. Laissez les tubes s’écouler sur une serviette en papier dans une armoire stérile de bio-sécurité pendant plusieurs minutes, puis résuspendez les granulés dans 33,3 microlitres de PBS stérile contenant 5% de glycérol par plat de culture. Pour la génération de cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse, placez les tibias et les fémurs, récoltés à partir de souris BALB/c, dans un plat de culture de 100 x 20 millimètres contenant un milieu de culture frais.Utilisez des ciseaux et des forceps disséquants pour enlever les tissus des os. Lorsque tous les os ont été nettoyés, utilisez les ciseaux pour couper les deux extrémités de chaque os pour exposer les cavités de la moelle osseuse. Utilisez une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 30 pour rincer chaque os avec 10 millilitres de milieu de culture frais, en recueillant la moelle osseuse dans un tube de 15 millilitres.Lorsque toute la moelle osseuse a été recueillie, sédimenter la moelle osseuse par centrifugation et resuspendre la pastille en deux millilitres de tampon de lyse des globules rouges. Après quatre à cinq minutes à température ambiante avec des secousses occasionnelles, arrêter la réaction avec 10 millilitres de milieu de culture cellulaire et de recueillir les cellules par centrifugation. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de milieu de culture CM-10-R pour compter et ajuster les cellules pendant une fois 10 aux six cellules par millilitre de concentration moyenne de culture CM-10-R.Ensuite, ajoutez 100 unités par millilitre de murine recombinante GM-CSF et 10 unités par millilitre d’IL-4 aux cellules. Plaque quatre millilitres de cellules dans les puits individuels d’une plaque de culture de six puits pour leur incubation à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 48 heures. À la fin de l’incubation, aspirer doucement les cellules non adhérentes.Ajouter un milieu frais complété par GM-CSF et IL-4 aux cultures avant de retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pour un supplément de 48 heures. À la fin de la deuxième incubation, récolter les cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse non adhérentes en tube conique de 50 millilitres pour leur centrifugation. Pour générer des cellules BMDC-CYP-ALDH, résuspendez les cultures à une fois dix à la sixième cellule dendritique par 500 microlitres de CM-10-R moyen par concentration de puits, et plaquez 500 microlitres de cellules dans chaque puits d’une nouvelle plaque de culture de six puits.Ajouter 50 microlitres de virus LENTI-CYP-ALDH et 8 microgrammes par millilitre de protamine à chaque puits, puis placer la plaque dans l’incubateur pendant 24 heures. Le lendemain, remplacez les supernatants par un milieu de culture frais et retournez les assiettes à l’incubateur de culture cellulaire pendant encore 24 heures. À la fin de la deuxième incubation, les cellules peuvent être activées avec 100 nanogrammes par millilitre de lipopolysaccharide par puits pendant 24 heures avant la récolte pour des analyses fonctionnelles.Comparées aux cellules dendritiques dérivées de moelle parentale, les cellules de BMDC-CYP-ALDH affichent une expression améliorée de 1-alpha-hydroxylase. Les concentrations de la forme active de vitamine D dans les supernatants de culture des cellules BMDC-CYP et BMDC-CYP-ALDH sont environ 20 fois plus élevées que celles observées dans les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse parentale et les cultures cellulaires BMDC-ALDH. Les intensités fluorescentes moyennes des cellules BMDC-CYP-ALDH traitées avec le substrat sont environ six fois plus élevées que celles des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse parentale traitées avec le substrat.Ceci suggère que les cellules BMDC-CYP-ALDH expriment l’activité enzymatique rétinienne sensiblement améliorée dehydehydrogenase-2. Les cellules DC2.4 traitées avec de la vitamine D 25 hydroxy et rétiniennes n’induisent pas un changement significatif dans l’abondance des lymphocytes T positifs CCR9 positifs CCR9 foxp3. En revanche, dc2.4 cellules CYP-ALDH traitées avec la vitamine D 25 hydroxy et rétinienne induisent des nombres sensiblement plus élevés de cellules T régulation gut-homing d’une manière dépendante de concentration.En outre, comparées aux cellules de contrôle intraperitoneally injectées, les cellules CYP-ALDH de DC induisent également une augmentation significative du nombre de cellules T positives positives de CD4 de CCR9 de foxp3 après injection intraperitoneal dans les animaux destinataires de BALB/c. Le succès de la procédure dépend de la préparation de cellules T saines et d’un mélange d’ADN correctement préparé.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

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