Name: in vivo augmentation of gut-homing regulatory t cell induction
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Office of the Assistant Secretary of Defense for Health Affairs durch das Peer Reviewed Medical Research Program unter Auszeichnung Nr. W81XWH-15-1-0240 (XT). Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die des Autors und werden nicht unbedingt vom Verteidigungsministerium gebilligt. Diese Arbeit wurde teilweise auch durch Research Innovation Grants vom Department of Medicine der Loma Linda University (681207-2967 [XT und GG], 681205-2967 [XT] und 325491 [DJB]) unterstützt.

Alle In-vivo-Tierstudienprotokolle wurden vom Loma Linda University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) sowie dem Animal Care and Use Review Office (ACURO) der US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC) des Verteidigungsministerium.
1. Herstellung des Lentivirus, das sowohl 1-Hydroxylase als auch RALDH2 (Lenti-CYP-ALDH-Virus) ausdrückt
<ol><li>Tag 0: Am frühen Morgen 5 x 105 Zellen/ml von 293T Zellen im CM-10-D-Zellkulturmedium vorbereiten.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Abraham, C., Cho, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease.">Inflammatory bowel disease.</a> New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).</li><li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease.">Inflammatory bowel disease.</a> Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).</li><li>Clifford, D. 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C., Gaitan, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effects+of+Vitamin+D+in+multiple+sclerosis.">Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis.</a> Brain. 132, 1146-1160 (2009).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).</li><li>Steinman, R. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+dendritic+cell+migration+into+lymph+nodes+using+molecular+imaging+with+sodium+iodide+symporter+and+enhanced+firefly+luciferase+genes.">Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes.</a> Science Reports. 5, 9865 (2015).</li><li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells,+engineered+to+overexpress+25-hydroxyvitamin+D+1alpha-hydroxylase+and+pulsed+with+a+myelin+antigen,+provide+myelin-specific+suppression+of+ongoing+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis.</a> FASEB J. , (2017).</li><li>Narula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+High-Dose+Vitamin+D3+Supplementation+in+Patients+with+Crohn's+Disease+in+Remission:+A+Pilot+Randomized+Double-Blind+Controlled+Study.">Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study.</a> Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).</li><li>Ahmad, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+A+Supplementation+during+Pregnancy+Enhances+Pandemic+H1N1+Vaccine+Response+in+Mothers,+but+Enhancement+of+Transplacental+Antibody+Transfer+May+Depend+on+When+Mothers+Are+Vaccinated+during+Pregnancy.">Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy.</a> Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).</li><li>Noronha, S. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldefluor+protocol+to+sort+keratinocytes+stem+cells+from+skin.">Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).</li><li>Ferreira, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D3+Induces+Tolerance+in+Human+Dendritic+Cells+by+Activation+of+Intracellular+Metabolic+Pathways.">Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways.</a> Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).</li><li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing,+IL-10-producing+regulatory+T+cells.">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li></ol>

In diesem Artikel beschreiben wir die Verwendung von DC-CYP-ALDH-Zellen zur Erweiterung der Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in peripheren lymphoiden Geweben. Unsere Daten haben gezeigt, dass die DC-CYP-ALDH-Zellen lokal hohe Konzentrationen de novo von 1,25(OH)2D und RA in vitro in Gegenwart entsprechender Substrate (d.h. 25[OH]D bzw. Retinol) synthetisieren können. Da ausreichende Blutkonzentrationen von 25(OH)D und Retinol leicht durch Vitamin D- und A-Supplementierungen bei Patienten mit Defiziten<su...

Die entzündliche Darmerkrankung (IBD) ist eine entzündliche chronische Erkrankung im Magen-Darm-Trakt (GUT). In den Vereinigten Staaten gibt es etwa 1,4 Millionen IBD-Patienten. Es ist allgemein anerkannt, dass eine dysregulierte Immunantwort auf Darmbakterien die Krankheit auslöst und die Schleimhautepithelbarriere1,2stört. Aus diesem Grund hemmen derzeit verfügbare, von der US Food and Drug Administration (FDA) zugelassene Medikamente die Funktionen von Entzündungsmediatoren oder blockieren die Homing von Immunzellen in den Darm. Die entzündungshemmenden Mediatoren und Immunzellen, die gezielt sind, sind jedoch auch für die Immunabwehr notwendig. Infolgedessen gefährden die Entzündungsmediatoren die systemische Immunabwehr und die Immunzellen-Homing-Blocker schwächen die Darmimmunabwehr, die beide zu schwerwiegenden Folgen führen können3,4. Darüber hinaus können die Immunzellen-Homing-Blocker auch das Homing von regulatorischen T (Treg)-Zellen in den Darm blockieren und damit die bereits beeinträchtigte Darmimmuntoleranz bei IBD-Patienten verschlechtern. Darüber hinaus kann die Blockierung der Treg-Zelle, die in den Darm einfließt, auch zu einer systemischen Immunsuppression aufgrund der Ansammlung von Treg-Zellen im Blut führen5. Schließlich funktionieren Inhibitoren und Blocker vorübergehend und erfordern daher häufige Verabreichungen. Häufige Verabreichung dieser Inhibitoren und Blocker können die unerwünschten Nebenwirkungen weiter verschlimmern.
Kürzlich haben wir eine neue Strategie vorgeschlagen, die potenziell die Nebenwirkungen imZusammenhang mit aktuellen Medikamenten für die IBD-Behandlung 6 mildern oder sogar beseitigen kann. Diese Strategie verstärkt die Induktion von Darm-Homing-Treg-Zellen in peripheren Lymphgeweben6. Die Begründung dieser Strategie ist, dass Darm-Homing Treg Zellen speziell Heimat des Darms und wird daher nicht die systemische Immunabwehr gefährden. Da Treg-Zellen potenziell Gedächtnisbildenkönnen 7,8, Darm-Homing-Treg-Zellen können potenziell eine stabile Kontrolle der chronischen Darmentzündung bei IBD-Patienten bieten und damit sollte die Behandlung nicht so häufig verabreicht werden müssen. Da diese Strategie die Induktion von Darmhoming-Treg-Zellen in vivo verstärkt, hat sie nicht die Sorge der In-vivo-Instabilität in einer hochgradig proinflammatorischen Umgebung, die mit dem Adoptivtransfer von in vitro erzeugten Treg-Zellen9,10verbunden ist. In dieser Hinsicht sind in vitro erzeugte Treg-Zellen eine der vorgeschlagenen Strategien zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen11,12,13 und Transplantatabstoßung14,15. Schließlich werden in dieser Strategie dendritische Zellen (DCs) entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen von zwei Molekülen de novo zu produzieren: aktives Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und aktives Vitamin A (Retinoinsäure oder RA). Wir haben uns für 1,25(OH)2D und RA entschieden, weil 1,25(OH)2D die Expression von regulatorischen Molekülen induzieren kann (z.B. Gabelstapler p3 [foxp3] und Interleukin-10 [IL-10])16,17 und dass RA die Expression von Darmhoming-Rezeptoren in T-Zellen stimulieren kann18. Da sowohl 1,25(OH)2D als auch RA auch DCs28,29tolerisieren können, gehen wir davon aus, dass die konstruierten DCs stabil in einem tolerogenen Status in vivo gehalten werden und damit die In-vivo-Instabilitätsbedenken umgehen, die mit in vitro erzeugten tolerogenen DCs (TolDCs)19,20,21verbunden sind. In dieser Hinsicht sind TolDCs auch eine der vorgeschlagenen Strategien für die In-vivo-Augmentation der Treg-Zellfunktionen19,20,21. Um unsere Argumentation zu unterstützen, haben wir gezeigt, dass die entwickelten DCs, nach in vivo Lieferung, die Induktion von Darm-homing Treg-Zellen in peripherenlymphoidenGeweben 6 erhöhen können.
Ein weiterer Vorteil unserer vorgeschlagenen Strategie ist, dass 1,25(OH)2D auch andere Funktionen hat, die IBD-Patienten potenziell zugute kommen können. Zu diesen anderen Funktionen gehört die Fähigkeit von 1,25(OH)2D, die Sekretion antimikrobieller Mittel zu stimulieren22 und die Karzinogenese23zu unterdrücken. Infektionen und Krebserkrankungen werden häufig mit IBD24,25assoziiert.
Um die DCs zu erzeugen, die lokal hohe Konzentrationen von 1,25(OH)2D und RA de novo erzeugen können, verwenden wir einen lentiviralen Vektor, um DCs zu entwickeln, um zwei Gene zu überexprimieren. Ein Gen ist das Cytochrom P450-Unterfamilie 27-Unterfamilie B-Mitglied 1 (CYP27B1), das 25-Hydroxyvitamin D 1-Hydroxylase (1-Hydroxylase) kodiert, das physiologisch die Synthese von 1,25(OH)2D katalysiert. Das andere Gen ist die Aldehyddehydrogenase 1 Familienmitglied A2 (ALDH1a2), die Retinaldehyddehydrogenase 2 (RALDH2) kodiert, die physiologisch die Synthese von RA6katalysiert.
Da die In-vivo-Augmentation der Darmhoming-Treg-Zellinduktion für die Behandlung von IBD potenziell wichtig ist, werden wir im folgenden Protokoll die Verfahren zur Erzeugung der 1-Hydroxylase-RALDH2-overexzierenden DCs (DC-CYP-ALDH-Zellen) kann für die zukünftige Untersuchung von Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo verwendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 03-377-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 20 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# H4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>Cat# 01700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CYP27B1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab95047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-10-D cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-10-R cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-4-D cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab205718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Cat# 391340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-CYP-ALDH</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5&#39; KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine GM-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14-841-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11140076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMVR8.74</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid# 22036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMD2G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid# 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 15 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 50 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# AM12502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polycloncal IgG isotype control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab171870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement</td>
			<td>Heartland Assays</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 21870076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell strainers, 40 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-201-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile storage bottles, 500 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# CLS431432</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo augmentation of gut-homing regulatory t cell induction

Die entzündliche Darmerkrankung (IBD) ist eine entzündliche chronische Erkrankung im Magen-Darm-Trakt (GUT). In den Vereinigten Staaten gibt es etwa 1,4 Millionen IBD-Patienten. Es ist allgemein anerkannt, dass eine dysregulierte Immunantwort auf Darmbakterien die Krankheit auslöst und die Schleimhautepithelbarriere stört. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Darmhoming-regulatorische T (Treg)-Zellen eine vielversprechende Therapie für IBD sind. Dementsprechend stellt dieser Artikel ein Protokoll zur In-vivo-Augmentation der Darmhoming Treg-Zellinduktion dar. In diesem Protokoll werden dendritische Zellen entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen von zwei Molekülen de novo, aktivem Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und aktivem Vitamin A (Retinsäure oder RA) zu produzieren. Wir wählten 1,25(OH)2D und RA auf der Grundlage früherer Erkenntnisse, die zeigten, dass 1,25(OH)2D die Expression von regulatorischen Molekülen induzieren kann (z. B. Gabelstapler-Box P3 und Interleukin-10) und dass RA die Expression von Darm-Homing-Rezeptoren in T-Zellen stimulieren kann. Um solche technisch entwickelten dendritischen Zellen zu erzeugen, verwenden wir einen lentiviralen Vektor, um dendritische Zellen zu transduzieren, um zwei Gene zu überexprimieren. Ein Gen ist das Cytochrom P450-Unterfamilie 27-Unterfamilie B-Mitglied 1, das 25-Hydroxyvitamin D 1-Hydroxylase kodiert, das physiologisch die Synthese von 1,25(OH)2D katalysiert. Das andere Gen ist die Aldehyddehydrogenase 1 Familienmitglied A2, die Retinaldehyddehydrogenase 2 kodiert, die physiologisch die Synthese von RA katalysiert. Dieses Protokoll kann für die zukünftige Untersuchung von Darm-Homing-Treg-Zellen in vivo verwendet werden.

DC-CYP-ALDH-Zellen exprimiert signifikant erhöhte Menge an 1-Hydroxylase. Um festzustellen, ob DC-CYP-ALDH-Zellen, die aus BMDCs erzeugt wurden, eine signifikant erhöhte Menge an 1-Hydroxylase exprimierten, wurden BMDCs mit dem Lenti-CYP-ALDH-Virus zur Herstellung von knochen-marrow-abgeleiteten DC-CYP-ALDH-Zellen (BMDC-CYP-ALDH-Zellen) transduziert. Anschließend wurden die BMDC-CYP-ALDH-Zellen auf die Expression von 1-Hydroxylase durch FACS untersucht. Unsere Daten zeigten, dass die BMDC-CYP-ALDH-Zel...

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In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Hier stellen wir ein Protokoll zur In-vivo-Augmentation der Darmhoming-regulatorischen T-Zell-Induktion vor. In diesem Protokoll werden dendritische Zellen entwickelt, um lokal hohe Konzentrationen des aktiven Vitamin D (1,25-Dihydroxyvitamin D oder 1,25[OH]2D) und des aktiven VitaminS A (Retinoinsäure oder RA) de novo zu produzieren.

In Vivo Augmentation der Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

Dieses Protokoll beschreibt eine potenziell neuartige therapeutische Strategie, die leicht für menschliche Anwendungen modifiziert werden kann. Diese Technik verbessert direkt die Induktion von Darm-Homing-regulatorischen T-Zellen in peripheren Lymphgeweben und kann auch in hochgradig pro-inflammatorischen Umgebungen stabil umgesetzt werden. Diese Techniken können auch verwendet werden, um die Rolle von aktivem Vitamin D und Vitamin A innerhalb des peripheren Immunsystems zu untersuchen.Diese visuelle Demonstration wird Schritt für Schritt Anweisungen für die Erzeugung von hochwertigen technischen dendritischen Zellen bereitstellen, die für den Erfolg dieser Technik entscheidend sind. Beginnen Sie mit der Aussaat von 1 mal 10 zu den sieben 293T-Zellen in 20 MillilitercmCM-10-D-Zellkulturmedium in 150 mal 25 Millimeter Kulturplatten für eine 24-Stunden-Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Am nächsten Tag 1,62 Milliliter frisch zubereitete zweifach konzentrierte HBS-Lösung, 9,5 Mikrogramm Hüllwasserid, 17,5 Mikrogramm Verpackungsplasmid und 27 Mikrogramm des LENTI-CYP-ALDH-Plasmids zu einem 50 Milliliter konischen Rohr hinzufügen.Bringen Sie das Endvolumen des Rohrgehalts auf 3,0375 Milliliter mit Wasser, gefolgt von der Zugabe von 202,5 Mikrolitern von zwei Molcalciumchlorid tropfenweise. Lassen Sie die DNA-Niederschlagsmischung bei Raumtemperatur 20 Minuten bei gelegentlichem Mischen, bevor Sie 3,24 Milliliter der Lösung tropfenweise pro 293T-Kultur hinzufügen, während sie die Schale sanft wirbeln. Legen Sie die Platten 24 Stunden in den Inkubator, bevor Sie jede Platte vorsichtig mit PBS waschen und die Zellen mit CM-4-D-Kulturmedium füttern.Nach weiteren 24 Stunden Kultur ernten Sie die Überstande in sterile Flaschen zur Lagerung bei vier bis acht Grad Celsius und füttern die Zellen für weitere 24 Stunden mit frischem CM-4-D-Medium. Am vierten Tag die Überstände wieder ernten und die Überstände von beiden Tagen drei und vier bis zu einem 0,45 Mikrometer Filter belasten. Konzentrieren Sie dann das Pseudotyp-Virus VSV-G 24 Stunden lang durch Zentrifugation.Am nächsten Tag dekantieren die Überstande. Lassen Sie die Rohre auf einem Papiertuch in einem sterilen Bio-Sicherheitsschrank für mehrere Minuten abtropfen lassen, und setzen Sie dann die Pellets in 33,3 Mikroliter nsterilem PBS mit 5% Glycerin pro Kulturschale wieder auf. Für die knochenmarkabgeleitete dendritische Zellerzeugung, legen Sie die Tibias und Oberschenkelknochen, geerntet von BALB/c Mäusen, in ein 100 mal 20 Millimeter Kulturgericht mit frischem Kulturmedium.Verwenden Sie sezierende Schere und Zange, um Gewebe aus den Knochen zu entfernen. Wenn alle Knochen gereinigt wurden, verwenden Sie die Schere, um beide Enden jedes Knochens zu schneiden, um die Knochenmarkhöhlen freizulegen. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 30-Meter-Nadel, um jeden Knochen mit 10 Milliliter frischem Kulturmedium zu spülen und das Knochenmark in einem 15-Milliliter-Rohr zu sammeln.Wenn das gesamte Knochenmark gesammelt wurde, sedimentieren Sie das Knochenmark durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in zwei Milliliter roter Blutkörperchen Lysepuffer wieder auf. Nach vier bis fünf Minuten bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Schütteln, stoppen Sie die Reaktion mit 10 Milliliterzellkulturmedium und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter CM-10-R-Kulturmedium für das Zählen wieder auf und passen Sie die Zellen für ein mal 10 auf die sechs Zellen pro Milliliter CM-10-R-Kulturmediumkonzentration an.Als nächstes fügen Sie 100 Einheiten pro Milliliter rekombinantes murinen GM-CSF und 10 Einheiten pro Milliliter IL-4 zu den Zellen hinzu. Vier Milliliter Zellen für ihre Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 48 Stunden in einzelne Brunnen einer sechs Brunnenkulturplatte geben. Am Ende der Inkubation die nicht haftenden Zellen sanft ansaugen.Fügen Sie frisches Medium, das mit GM-CSF und IL-4 ergänzt wird, zu den Kulturen hinzu, bevor Sie die Zellen für eine Zusätzliche 48 Stunden in den Zellkultur-Inkubator zurückbringen. Am Ende der zweiten Inkubation ernten Sie das nicht anhaftende Knochenmark, das dendritische Zellen für ihre Zentrifugation in 50 Milliliter Konustube gewonnen hat. Um BMDC-CYP-ALDH-Zellen zu erzeugen, setzen Sie die Kulturen ein mal zehn bis sechs literarisch pro 500 Mikroliter CM-10-R-Medium pro Brunnenkonzentration wieder aus und verdichten Sie 500 Mikroliter Zellen in jeden Brunnen einer neuen sechs Brunnenkulturplatte.Fügen Sie 50 Mikroliter des LENTI-CYP-ALDH-Virus und 8 Mikrogramm pro Milliliter Protamin zu jedem Brunnen hinzu, dann legen Sie die Platte 24 Stunden lang in den Inkubator. Am nächsten Tag die Überstande durch frisches Kulturmedium ersetzen und die Platten für weitere 24 Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben. Am Ende der zweiten Inkubation können die Zellen 24 Stunden vor der Ernte für funktionelle Analysen mit 100 Nanogramm pro Milliliter Lipopolysaccharid pro Brunnen aktiviert werden.Im Vergleich zu den dendritischen Zellen des elterlichen Knochenmarks zeigen BMDC-CYP-ALDH-Zellen eine verbesserte Expression von 1-Alpha-Hydroxylase. Die Konzentrationen der aktiven Form von Vitamin D in den Kulturüberobnatten von BMDC-CYP- und BMDC-CYP-ALDH-Zellen sind etwa 20-mal höher als die konzentrationen, die in dendritischen Zellunden des elternknochenmarks und der BMDC-ALDH-Zellkulturen beobachtet wurden. Die mittleren fluoreszierenden Intensitäten von BMDC-CYP-ALDH-Zellen, die mit dem Substrat behandelt werden, sind etwa sechsmal höher als die von zahngebundenen Knochenmarkabgeleiteten dendritischen Zellen, die mit dem Substrat behandelt werden.Dies deutet darauf hin, dass die BMDC-CYP-ALDH-Zellen eine signifikant verbesserte retinale Dehydhydrogenase-2-Enzymaktivität ausdrücken. DC2.4-Zellen, die mit 25-Hydroxy-Vitamin D und Netzhaut behandelt werden, induzieren keine signifikante Veränderung in der Fülle von foxp3-positiven CCR9-positiven CD4-positiven T-Zellen. Im Gegensatz dazu induzieren DC2.4 CYP-ALDH-Zellen, die mit 25-Hydroxy-Vitamin D und Netzhaut behandelt werden, signifikant höhere Anzahl von Darmhoming-regulatorischen T-Zellen in einer konzentrationsabhängigen Weise.Darüber hinaus induzieren DC CYP-ALDH-Zellen im Vergleich zu intraperitoneal injizierten Kontrollzellen auch eine signifikante Zunahme der Anzahl der foxp3-positiven CD4-positiven CD4-positiven T-Zellen nach intraperitonealer Injektion in BALB/c-Empfängertiere. Der Erfolg des Verfahrens hängt von der Herstellung gesunder T-Zellen und einer korrekt vorbereiteten DNA-Mischung ab.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Retrovirale Transduktion von T-Zell-Rezeptoren in Maus-T-Zellen

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon-System Modifikation von primären menschlichen T-Zellen

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Neue Tools erweitern regulatorischen T-Zellen von HIV-1-infizierten Personen

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Die Verwendung von fluoreszierenden Ziel Arrays zur Beurteilung der T-Zell-Antworten<em&gt; In-vivo-</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Ein<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Modell eines Oligodendrozyten-gerichtete T-Cell Attack in akuten Hirnschnitten

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Maus Naive CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zell-Isolierung und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Differenzierung in T-Zell-Populationen

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...