Name: in vivo augmentation of gut-homing regulatory t cell induction
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00
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この作品は、第1報のピアレビュー医学研究プログラムを通じて、国防次官補事務局の支援を受けました。W81XWH-15-1-0240 (XT)意見、解釈、結論、および勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されるものではありません。この研究はまた、ロマリンダ大学医学科(681207-2967[XTとGG]、681205-2967[XT]、および325491[DJB])からの研究イノベーション助成金によって部分的にサポートされました。

生体内動物研究プロトコルはすべて、ロマリンダ大学の動物ケアと使用委員会(IACUC)と米国陸軍医学研究・マテリエルコマンド(USAMRMC)の動物ケアと使用レビューオフィス(ACURO)によってレビューされ、承認されました。国防総省
1. 1α-ヒドロキシラーゼとRALDH2(レンズCYP-ALDHウイルス)の両方を発現するレンチウイルスの調製
<ol><li>0日目:早朝、CM-10-D細胞培養培地中の...

<ol>
	<li>Abraham, C., Cho, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease.">Inflammatory bowel disease.</a> New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).</li><li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease.">Inflammatory bowel disease.</a> Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).</li><li>Clifford, D. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+ex+vivo+expanded+T+regulatory+cells+in+adults+transplanted+with+umbilical+cord+blood:+safety+profile+and+detection+kinetics.">Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics.</a> Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).</li><li>Kang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1,25-Dihyroxyvitamin+D3+promotes+FOXP3+expression+via+binding+to+vitamin+D+response+elements+in+its+conserved+noncoding+sequence+region.">1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).</li><li>Correale, J., Ysrraelit, M. 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M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+dendritic+cells+into+medicine.">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).</li><li>Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Aneuploidy+and+Flat+Dysplasia+With+Development+of+High-Grade+Dysplasia+or+Colorectal+Cancer+in+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease.">Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).</li><li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+dendritic+cell+migration+into+lymph+nodes+using+molecular+imaging+with+sodium+iodide+symporter+and+enhanced+firefly+luciferase+genes.">Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes.</a> Science Reports. 5, 9865 (2015).</li><li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+dendritic+cells+can+present+exogenous+antigens+on+both+MHC+class+I+and+class+II+molecules.">Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules.</a> Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).</li><li>Okada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+route-dependent+vaccine+efficiency+of+murine+dendritic+cells+pulsed+with+antigens.">Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens.</a> British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).</li><li>Li, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells,+engineered+to+overexpress+25-hydroxyvitamin+D+1alpha-hydroxylase+and+pulsed+with+a+myelin+antigen,+provide+myelin-specific+suppression+of+ongoing+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis.</a> FASEB J. , (2017).</li><li>Narula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+High-Dose+Vitamin+D3+Supplementation+in+Patients+with+Crohn's+Disease+in+Remission:+A+Pilot+Randomized+Double-Blind+Controlled+Study.">Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study.</a> Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).</li><li>Ahmad, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+A+Supplementation+during+Pregnancy+Enhances+Pandemic+H1N1+Vaccine+Response+in+Mothers,+but+Enhancement+of+Transplacental+Antibody+Transfer+May+Depend+on+When+Mothers+Are+Vaccinated+during+Pregnancy.">Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy.</a> Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).</li><li>Noronha, S. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldefluor+protocol+to+sort+keratinocytes+stem+cells+from+skin.">Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).</li><li>Ferreira, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D3+Induces+Tolerance+in+Human+Dendritic+Cells+by+Activation+of+Intracellular+Metabolic+Pathways.">Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways.</a> Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).</li><li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing,+IL-10-producing+regulatory+T+cells.">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li></ol>

この記事では、末梢リンパ組織における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強するためのDC-CYP-ALDH細胞の使用について説明する。我々のデータは、DC-CYP-ALDH細胞が対応する基質(すなわち、25[OH]Dおよびレチノール)の存在下でインビトロで1,25(OH)2DおよびRAの両方の局所的に高濃度のde novoを合成できることを示している。25(OH)Dとレチノールの十分な血中濃度は、欠乏症30、31...

炎症性腸疾患(IBD)は、消化管(GUT)における炎症性慢性疾患である。米国では、約140万人のIBD患者がいます。腸内細菌に対する調節不全の免疫応答が疾患を開始し、粘膜上皮バリア1、2を破壊することが一般的に受け入れられている。このため、現在利用可能な米国食品医薬品局(FDA)承認薬物は、炎症メディエーターの機能を阻害するか、腸内の免疫細胞のホーミングをブロックする。しかし、標的とされる炎症性メディエーターや免疫細胞も免疫防御に必要です。その結果、炎症性メディエーター阻害剤は全身免疫防御を損ない、免疫細胞ホーミング遮断薬は腸内免疫防御を弱め、いずれも重篤な結果につながる可能性がある3、4。さらに、免疫細胞ホーミングブロッカーはまた、腸内の調節T(Treg)細胞のホーミングをブロックすることができ、したがって、IBD患者における既に侵害された腸内免疫寛容を悪化させることができる。さらに、腸内へのTreg細胞ホーミングの遮断は、血液5中のTreg細胞の蓄積による全身免疫抑制にもつながる可能性がある。最後に、阻害剤およびブロッカーは一過性に機能し、それによって頻繁な投与を必要とする。これらの阻害剤およびブロッカーの頻繁な投与は、さらに不利な副作用を悪化させる可能性があります。
最近、我々は潜在的に軽減またはIBD治療のための現在の薬物に関連する副作用を排除することができる新しい戦略を提案しました6.この戦略は、末梢リンパ組織6における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強する。この戦略の根拠は、腸のホーミングTreg細胞が腸に特異的に家であり、したがって、全身性免疫防御を損なわないということです.さらに、Treg細胞は記憶7、8を形成する可能性があるため、腸内ホーミングTreg細胞はIBD患者における慢性腸炎の安定した制御を提供する可能性があり、それによって、治療を頻繁に投与する必要はない。さらに、この戦略は、生体内における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強するので、インビトロ発生Treg細胞9、10の養子移入に関連する高炎症性環境における生体内不安定性の懸念を有しない。この点に関して、in vitro生成Treg細胞は、自己免疫疾患11、12、13および移植拒絶反応14、15の治療のための提案された戦略の1つである。最後に、この戦略では、樹状細胞(DC)は、活性ビタミンD(1,25-ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)の2つの分子の局所的に高濃度を生成するように設計されています。1,25(OH)2DとRAを選んだのは、1,25(OH)2Dが調節分子(例えば、フォークヘッドボックスP3[foxp3]およびインターロイキン-10[IL-10])16、17、RAがT細胞18における腸ホーミング受容体の発現を刺激することができるからである。1,25(OH)2D と RA の両方が DC28,29を許容できるため、設計された DC が生体内の対レフォゲン状態で安定的に維持され、したがって、インビトロ生成トレロゲン DC (TolDCs)19,20,21に関連する生体内不安定性の懸念を回避する理由 .この点で、TolDCはまた、Treg細胞機能19、20、21の生体内増強のための提案された戦略の一つである。我々の推論を支持するために、我々は、設計されたDCが生体内送達時に、末梢リンパ組織6における腸ホーミングTreg細胞の誘導を増強できることを示した。
私たちの提案された戦略のもう一つの利点は、1,25(OH)2 Dはまた、潜在的にIBD患者に利益をもたらす可能性のある他の機能を持っているということです。これらの他の機能は、抗菌剤22の分泌を刺激し、発癌を抑制する1,25(OH)2Dの能力を含む。感染症や癌は、しばしばIBD24、25に関連付けられています。
1,25(OH)2DとRA de novoの両方の局所的に高濃度を生成できるDCを生成するために、2つの遺伝子を過剰発現するためにDCを設計するためにレンチウイルスベクターを使用しています。1つの遺伝子は、25−ヒドロキシビタミンD1α−ヒドロキシラーゼ(1α-ヒドロキシラーゼ)をコードするシトクロムP450ファミリー27サブファミリーBメンバー1(CYP27B1)であり、これは1,25(OH)2Dの合成を生理学的に触媒する。他の遺伝子は、レチンアルデヒドデヒドロゲナーゼ2(RALDH2)をコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリーメンバーA2(ALDH1a2)であり、RA6の合成を生理学的に触媒する。
生体内での腸内ホーミングTreg細胞誘導はIBDの治療において潜在的に重要であるため、以下のプロトコルでは、1α-ヒドロキシラーゼ-RALDH2-過剰発現DC(DC-CYP-ALDH細胞)の生成手順を詳述します。生体内の腸ホーミングTreg細胞の将来の調査に使用することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 03-377-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 20 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# H4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>Cat# 01700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CYP27B1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab95047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-10-D cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-10-R cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-4-D cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab205718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Cat# 391340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-CYP-ALDH</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5&#39; KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine GM-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14-841-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11140076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMVR8.74</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid# 22036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMD2G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid# 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 15 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 50 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# AM12502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polycloncal IgG isotype control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab171870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement</td>
			<td>Heartland Assays</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 21870076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell strainers, 40 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-201-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile storage bottles, 500 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# CLS431432</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo augmentation of gut-homing regulatory t cell induction

炎症性腸疾患(IBD)は、消化管(GUT)における炎症性慢性疾患である。米国では、約140万人のIBD患者がいます。腸内細菌に対する調節不全の免疫応答が疾患を開始し、粘膜上皮障壁を破壊することは一般に受け入れられている。我々は最近、腸内調節T(Treg)細胞がIBDに対する有望な治療法であることを示した。したがって、この記事では、腸内ホーミングTreg細胞誘導の生体内増強のためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、樹状細胞は、2つの分子deノボ、活性ビタミンD(1,25−ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)の局所的に高濃度を産生するように設計される。我々は、1,25(OH)2Dが調節分子(例えば、フォークヘッドボックスP3およびインターロイキン-10)の発現を誘導し、RAがT細胞における腸内受容体の発現を刺激できることを示す以前の知見に基づいて1,25(OH)2DおよびRAを選択した。このような工学的樹状細胞を生成するために、レンチウイルスベクターを使用して樹状細胞を伝調し、2つの遺伝子を過剰発現させます。1つの遺伝子は、25−ヒドロキシビタミンD1α−ヒドロキシラーゼをコードするシトクロムP450ファミリー27サブファミリーBメンバー1であり、これは1,25(OH)2Dの合成を生理学的に触媒する。他の遺伝子は、レチナルアルデヒドデヒドロゲナーゼ2をコードするアルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリーメンバーA2であり、RAの合成を生理学的に触媒する。このプロトコルは、生体内の腸ホーミングTreg細胞の将来の調査に使用することができます。

DC-CYP-ALDH細胞は、1α-ヒドロキシラーゼの有意に増加量を発現した。BMdCsから生成されたDC-CYP-ALDH細胞が1α-ヒドロキシラーゼの有意な増加量を発現したかどうかを判断するために、BMCCをレンズCYP-ALDHウイルスで形質転換し、骨髄由来DC-CYP-ALDH細胞(BMDC-CYP-ALDH細胞)を産生した。続いて、BMDC-CYP-ALDH細胞をFACSによる1α-ヒドロキシラーゼの発現について調べた。我々のデータは、BMDC-CYP-ALDH...

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In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

ここでは、腸内ホーミング調節T細胞誘導の生体内増強のためのプロトコルを提示する。このプロトコルでは、樹状細胞は、活性ビタミンD(1,25−ジヒドロキシビタミンDまたは1,25[OH]2D)および活性ビタミンA(レチノイン酸またはRA)de novoの高濃度を局所的に産生するように設計される。

腸内調節制御T細胞誘導の生体内増強

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

このプロトコルは、ヒト用途に対して容易に修飾できる潜在的に新しい治療戦略を記述する。この技術は、末梢リンパ組織における腸ホーミング調節T細胞の誘導を直接増強し、高炎症性環境においても安定的に実施することができる。これらの技術は、末梢免疫系における活性ビタミンDおよびビタミンAの役割を調べるためにも使用することができる。この視覚的なデモンストレーションでは、この技術の成功に不可欠な高品質の設計樹状細胞の生成のためのステップバイステップの手順を提供します。CM-10-D細胞培養培地中の7個の293T細胞を摂氏37度と5%の二酸化炭素で24時間培養する25ミリメートル培養プレートで1回10〜7回播種することから始めます。翌日、調製したての2倍の濃縮HBS溶液1.62ミリリットル、エンベローププラスミド9.5マイクログラム、包装プラスミド17.5マイクログラム、LENTI-CYP-ALDHプラスミド27マイクログラムを50ミリリットルの円錐チューブに加えます。チューブ内容物の最終容積は、水で最大3.0375ミリリットル、続いて202.5マイクロリットルの塩化モル酸モル酸モルカルシウムを添加します。DNA沈殿混合物を室温で20分間放置し、時折混合してから、293T培養ごとに3.24ミリリットルの溶液を滴下し、皿を穏やかに渦巻きます。各プレートをPBSで静かに洗浄し、CM-4-D培養培地で細胞を供給する前に、プレートをインキュベーターに24時間置きます。さらに24時間培養した後、上澄み物を摂氏4〜8度で貯蔵するために滅菌ボトルに収穫し、さらに24時間新鮮なCM-4-D培地で細胞を供給する。4日目に、再び上清を収穫し、3日と4日目の両方から上清を0.45マイクロメートルフィルターにひずみます。次いで、VSV-G擬似型ウイルスを遠心分離により24時間濃縮する。翌日、上清をデカントします。チューブを無菌バイオセーフティキャビネットのペーパータオルで数分間排出させ、培養皿あたり5%グリセロールを含む滅菌PBSの33.3マイクロリットルでペレットを再懸濁させます。骨髄由来樹状細胞生成のために、BALB/cマウスから採取したチビアスおよび大腿骨を、新鮮な培養培地を含む100x20ミリメートルの培養皿に入れる。骨から組織を取り除くためにはさみや鉗子を解剖してください。すべての骨が洗浄されたら、はさみを使用して各骨の両端を切断して骨髄腔を露出します。30ゲージの針を装備した10ミリリットルの注射器を使用して、各骨を10ミリリットルの新鮮な培養培地で洗い流し、骨髄を15ミリリットルのチューブに集めます。骨髄の全てが採取されると、遠心分離によって骨髄を沈下し、2ミリリットルの赤血球リシスバッファーでペレットを再懸濁する。時折揺れで室温で4〜5分後、10ミリリットルの細胞培養培地で反応を停止し、遠心分離によって細胞を収集する。カウント用の10ミリリットルのCM-10-R培地中のペレットを再懸濁し、CM-10-R培地濃度のミリリットル当たり6個の細胞に10回調整した。次に、組換えマウスGM-CSFの1ミリリットル当たり100単位、IL-4のミリリットル当たり10単位を細胞に加える。4ミリリットルの細胞を6つのウェル培養プレートの個々の井戸にプレートし、摂氏37度でインキュベーションし、5%の二酸化炭素を48時間加熱します。インキュベーションの終わりに、非接着性細胞を穏やかに吸引する。細胞を細胞培養インキュベーターに48時間戻す前に、GM-CSFおよびIL-4を添加した新鮮な培地を培養物に加える。第2インキュベーションの終わりに、非粘着性骨髄由来樹状細胞を50ミリリットル円錐形のチューブに収穫して遠心分離を行う。BMDC-CYP-ALDH細胞を生成するには、CM-10-R培地1ウェル濃度当たり500マイクロリットル当たり10倍から6番目の樹状細胞の10倍の培養を再中断し、500マイクロリットルの細胞を新しい6つのウェル培養プレートの各ウェルウェルにプレートします。LENTI-CYP-ALDHウイルスの50マイクロリットルとプロタミンのミリリットルあたり8マイクログラムを各ウェルに加え、24時間インキュベーターにプレートを置きます。翌日、上清を新鮮な培養培地に置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターにさらに24時間戻します。第2インキュベーションの終わりに、細胞は機能分析のために収穫前に24時間、1ウェルあたり1ミリリットル当たり100ナノグラムで活性化することができる。親の骨髄由来樹状細胞と比較して、BMDC-CYP-ALDH細胞は1-α-ヒドロキシラーゼの増強された発現を示す。BMDC-CYPおよびBMDC-CYP-ALDH細胞の培養上清におけるビタミンDの活性型の濃度は、親骨髄由来樹状細胞およびBMDC-ALDH細胞培養において観察されたものよりも約20倍高い。基質で処理されたBMDC-CYP-ALDH細胞の平均蛍光強度は、基質で処理された親の骨髄由来樹状細胞の約6倍高い。これは、BMDC-CYP-ALDH細胞が著しく増強されたレチナルデヒデヒドロゲナーゼ-2酵素活性を発現することを示唆している。25-ヒドロキシビタミンDおよびレチナルで処理されたDC2.4細胞は、foxp3陽性CCR9陽性CD4陽性T細胞の存在量に有意な変化を誘発しない。対照的に、25-ヒドロキシビタミンDおよびレチナルで処理されたDC2.4 CYP-ALDH細胞は、濃度依存的な方法で有意に高い数の腸ホーミング調節T細胞を誘導する。また、腹腔内に注入された対照細胞と比較して、DC CYP-ALDH細胞はまた、BALB/cレシピエント動物への腹腔内注射後にfoxp3陽性CCR9陽性CD4陽性T細胞の数の有意な増加を誘導する。手順の成功は、健康なT細胞および正しく調製されたDNA混合物の調製に依存する。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

初代ヒトナイーブおよびメモリーT細胞から誘導した調節性T細胞の生成

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用<em&gt;インビボ</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

アン<em&gt;エクスビボ</em急性脳スライスにおけるオリゴデンドロサイト指向T細胞攻撃の&gt;モデル

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...