Name: in vivo augmentation of gut-homing regulatory t cell induction
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Escritório do Secretário Adjunto de Defesa para Assuntos de Saúde através do Peer Reviewed Medical Research Program no âmbito do Prêmio No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são as do autor e não são necessariamente endossadas pelo Departamento de Defesa. Este trabalho também foi parcialmente apoiado por Bolsas de Inovação em Pesquisa do Departamento de Medicina da Universidade de Loma Linda (681207-2967 [XT e GG], 681205-2967 [XT], e 325491 [DJB]).

Todos os protocolos in vivo de estudo animal foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Loma Linda (IACUC), bem como pelo Animal Care and Use Review Office (ACURO) do Comando de Pesquisa médica e Material do Exército dos EUA (USAMRMC) do Departamento de Defesa.
1. Preparação do Lentivirus que expressa 1α-hydroxylase e RALDH2 (vírus lenti-CYP-ALDH)
<ol><li>Dia 0: No início da manhã, prepare 5 x 105 células/mL de c...

<ol>
	<li>Abraham, C., Cho, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease.">Inflammatory bowel disease.</a> New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).</li><li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease.">Inflammatory bowel disease.</a> Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).</li><li>Clifford, D. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+ex+vivo+expanded+T+regulatory+cells+in+adults+transplanted+with+umbilical+cord+blood:+safety+profile+and+detection+kinetics.">Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics.</a> Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).</li><li>Kang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1,25-Dihyroxyvitamin+D3+promotes+FOXP3+expression+via+binding+to+vitamin+D+response+elements+in+its+conserved+noncoding+sequence+region.">1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).</li><li>Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effects+of+Vitamin+D+in+multiple+sclerosis.">Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis.</a> Brain. 132, 1146-1160 (2009).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).</li><li>Steinman, R. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Aneuploidy+and+Flat+Dysplasia+With+Development+of+High-Grade+Dysplasia+or+Colorectal+Cancer+in+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease.">Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).</li><li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+dendritic+cell+migration+into+lymph+nodes+using+molecular+imaging+with+sodium+iodide+symporter+and+enhanced+firefly+luciferase+genes.">Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes.</a> Science Reports. 5, 9865 (2015).</li><li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+dendritic+cells+can+present+exogenous+antigens+on+both+MHC+class+I+and+class+II+molecules.">Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules.</a> Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).</li><li>Okada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+route-dependent+vaccine+efficiency+of+murine+dendritic+cells+pulsed+with+antigens.">Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens.</a> British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).</li><li>Li, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells,+engineered+to+overexpress+25-hydroxyvitamin+D+1alpha-hydroxylase+and+pulsed+with+a+myelin+antigen,+provide+myelin-specific+suppression+of+ongoing+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis.</a> FASEB J. , (2017).</li><li>Narula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+High-Dose+Vitamin+D3+Supplementation+in+Patients+with+Crohn's+Disease+in+Remission:+A+Pilot+Randomized+Double-Blind+Controlled+Study.">Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study.</a> Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).</li><li>Ahmad, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+A+Supplementation+during+Pregnancy+Enhances+Pandemic+H1N1+Vaccine+Response+in+Mothers,+but+Enhancement+of+Transplacental+Antibody+Transfer+May+Depend+on+When+Mothers+Are+Vaccinated+during+Pregnancy.">Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy.</a> Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).</li><li>Noronha, S. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldefluor+protocol+to+sort+keratinocytes+stem+cells+from+skin.">Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).</li><li>Ferreira, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D3+Induces+Tolerance+in+Human+Dendritic+Cells+by+Activation+of+Intracellular+Metabolic+Pathways.">Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways.</a> Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).</li><li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing,+IL-10-producing+regulatory+T+cells.">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li></ol>

Neste artigo descrevemos o uso de células DC-CYP-ALDH, para aumentar a indução de células Treg de calagem intestinal em tecidos linfóides periféricos. Nossos dados mostraram que as células DC-CYP-ALDH podem sintetizar concentrações localmente altas de novo de 1,25 (OH)2D e AR in vitro na presença de substratos correspondentes (ou seja, 25[OH]D e retinol, respectivamente). Porque concentrações sanguíneas suficientes de 25 (OH) D e retinol podem ser facilmente alcançadas através de suplementaçõe...

A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica inflamatória no trato gastrointestinal (INTESTINO). Nos Estados Unidos, há aproximadamente 1,4 milhão de pacientes com DII. É geralmente aceito que uma resposta imune desregulada às bactérias do intestino inicia a doença e interrompe a barreira epiteliais mucosa1,2. Por esta razão, atualmente disponíveis E.U. Food and Drug Administration (FDA) medicamentos aprovados inibem as funções dos mediadores inflamatórios ou bloquear o homing de células imunes no intestino. No entanto, os mediadores inflamatórios e células imunes que são alvo também são necessários para defesas imunológicas. Como resultado, os inibidores do mediador inflamatório comprometem a defesa imunológica sistêmica e os bloqueadores de homing de células imunes enfraquecem a defesa imunológica do intestino, ambos os quais podem levar a graves conseqüências3,4. Além disso, os bloqueadores de homing de células imunes também podem bloquear o homing de células reguladoras T (Treg) no intestino e, portanto, pode piorar a tolerância imune do intestino já comprometida em pacientes com DII. Além disso, o bloqueio de células Treg homing no intestino também pode levar à supressão imunológica sistêmica devido ao acúmulo de células Treg no sangue5. Finalmente, inibidores e bloqueadores funcionam de forma transitória e, assim, exigem administrações frequentes. A administração freqüente desses inibidores e bloqueadores pode exacerbar ainda mais os efeitos colaterais desagradáveis.
Recentemente, propusemos uma nova estratégia que pode potencialmente mitigar ou até mesmo eliminar os efeitos colaterais associados com medicamentos atuais para o tratamento de DII6. Esta estratégia aumenta a indução de células Treg gut-homing em tecidos linfóides periféricos6. A lógica desta estratégia é que as células Treg gut-homing especificamente lar do intestino e, portanto, não irá comprometer as defesas imunológicas sistêmicas. Além disso, uma vez que as células Treg podem potencialmente formar memória7,8,células Treg gut-homing pode potencialmente fornecer um controle estável da inflamação crônica do intestino em pacientes com DII e, assim, o tratamento não deve precisar ser administrado com tanta freqüência. Além disso, uma vez que esta estratégia aumenta a indução de células Treg gut-homing in vivo, não tem a preocupação de instabilidade in vivo em um ambiente altamente pró-inflamatório que está associado com a transferência adotiva de células Treg geradas in vitro9,10. A este respeito, as células Treg in vitro geradas são uma das estratégias propostas para o tratamento de doenças autoimunes11,12,13 e rejeição de transplante14,15. Finalmente, nesta estratégia, as células dendríticas (DCs) são projetadas para produzir concentrações localmente altas de duas moléculas de novo: vitamina D ativa (1,25-dihydroxyvitamin D ou 1,25[OH]2D) e vitamina ativa A (ácido retinoico ou RA). Escolhemos 1,25 (OH)2D e RA porque 1,25 (OH)2D pode induzir a expressão de moléculas reguladoras (por exemplo, caixa de cabeceira P3 [foxp3] e interleucina-10 [IL-10])16,17 e que a RA pode estimular a expressão de receptores de homing intestinal em células T18. Porque ambos 1,25 (OH)2D e RA também podem tolerizar DCs28,29, razão que os DCs projetados serão mantidos de forma evigorada em um status tolerogênico in vivo e,portanto,contornar as preocupações de instabilidade in vivo que estão associados com DCs tolerogenic in vitro gerados (TolDCs)19,20,21. A este respeito, toldcs também são uma das estratégias propostas para in vivo aumento das funções celulares Treg19,20,21. Para apoiar o nosso raciocínio, mostramos que os DCs projetados, após a entrega in vivo, podem aumentar a indução de células Treg de calagem intestinal em tecidos linfóides periféricos6.
Uma vantagem adicional de nossa estratégia proposta é que 1,25 (OH)2D também tem outras funções que podem beneficiar potencialmente pacientes com DII. Essas outras funções incluem a capacidade de 1,25 (OH)2D para estimular a secreção de antimicrobianos22 e suprimir a carcinogênese23. Infecções e cânceres são freqüentemente associados à DII24,25.
Para gerar os DCs que podem produzir concentrações localmente altas de 1,25 (OH)2D e RA de novo, usamos um vetor lentiviral para projetar DCs para expressar demais dois genes. Um gene é a família Cytochrome P450 27 membro da subfamília B 1 (CYP27B1) que codifica 25-hidroxivitamina D 1α-hidroxilase (1α-hidroxilase), que catalisa fisiologicamente a síntese de 1,25 (OH)2D. O outro gene é o aldeído dehidrogenase 1 membro da família A2 (ALDH1a2) que codifica retinaldeído dehidrogenase 2 (RALDH2), que fisiologicamente catalisa a síntese de RA6.
Como o aumento in vivo da inin vivo de indução de células Treg de homing intestinal é potencialmente importante no tratamento da DII, no seguinte protocolo, detalharemos os procedimentos para a geração das DCs de 1α-hidroxilase-RALDH2 (células DC-CYP-ALDH) que pode ser usado para a investigação futura de células Treg gut-homing in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 03-377-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 20 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# H4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>Cat# 01700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CYP27B1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab95047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-10-D cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-10-R cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-4-D cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab205718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Cat# 391340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-CYP-ALDH</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5&#39; KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine GM-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14-841-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11140076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMVR8.74</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid# 22036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMD2G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid# 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 15 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 50 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# AM12502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polycloncal IgG isotype control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab171870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement</td>
			<td>Heartland Assays</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 21870076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell strainers, 40 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-201-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile storage bottles, 500 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# CLS431432</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo augmentation of gut-homing regulatory t cell induction

A doença inflamatória intestinal (DII) é uma doença crônica inflamatória no trato gastrointestinal (INTESTINO). Nos Estados Unidos, há aproximadamente 1,4 milhão de pacientes com DII. É geralmente aceito que uma resposta imune desregulada às bactérias do intestino inicia a doença e interrompe a barreira epiteliais mucosa. Recentemente, mostramos que as células reguladoras t (Treg) são uma terapia promissora para a DII. Assim, este artigo apresenta um protocolo para o aumento in vivo da indução da pilha de Treg gut-homing. Neste protocolo, as células dendríticas são projetadas para produzir concentrações localmente altas de duas moléculas de novo, vitamina D ativa (1,25-dihidroxivitamina D ou 1,25[OH]2D) e vitamina a-ida ativa (ácido retinóico ou RA). Escolhemos 1,25 (OH)2D e AR com base em descobertas anteriores mostrando que 1,25 (OH)2D pode induzir a expressão de moléculas reguladoras (por exemplo, caixa de cabeça de garfo P3 e interleucina-10) e que a RA pode estimular a expressão de receptores de homing intestinal nas células T. Para gerar tais células dendríticas projetadas, usamos um vetor lentiviral para transduzir células dendríticas para expressar demais dois genes. Um gene é a família Cytochrome P450 27 membro da subfamília B 1 que codifica 25-hidroxivitamina D 1α-hidroxilase, que fisiologicamente catalisa a síntese de 1,25 (OH)2D. O outro gene é o aldeído dehidrogenase 1 membro da família A2 que codifica retinaldeído dehidrogenase 2, que fisiologicamente catalisa a síntese de AR. Este protocolo pode ser usado para a investigação futura de células Treg gut-homing in vivo.

As células DC-CYP-ALDH expressaram um aumento significativo na quantidade de 1α-hidroxilase. Para determinar se as células DC-CYP-ALDH geradas a partir de BMDCs expressaram um aumento significativo da quantidade de 1α-hidroxilase, os BMDCs foram transinduzidos com o vírus lenti-CYP-ALDH para produzir células DC-CYP-ALDH derivadas de medula óssea (células BMDC-CYP-ALDH). Posteriormente, as células BMDC-CYP-ALDH foram examinadas para a expressão de 1α-hidroxilase pela FACS. Nossos dados mostrara...

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In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Aqui apresentamos um protocolo para o aumento in vivo da ininvitro-homing indução de células T regulamentares. Neste protocolo, as células dendríticas são projetadas para produzir localmente altas concentrações da vitamina D ativa (1,25-dihidroxivitamina D ou 1,25[OH]2D) e a vitamina A ativa (ácido retinoico ou AR) de novo.

In Vivo Aumento da Indução de CélulaS T Reguladoras de Gut-Homing

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

Este protocolo descreve uma estratégia terapêutica potencialmente nova que pode ser facilmente modificada para aplicações humanas. Esta técnica aumenta diretamente a indução de células T reguladoras de intestino em tecidos linfoides periféricos e pode ser implementada de forma estável mesmo em ambientes altamente pró-inflamatórios. Essas técnicas também podem ser usadas para investigar o papel da vitamina D ativa e da vitamina A dentro do sistema imunológico periférico.Esta demonstração visual fornecerá instruções passo a passo para a geração de células dendríticas projetadas de alta qualidade que são fundamentais para o sucesso desta técnica. Comece semeando uma vez 10 para as sete células 293T em 20 mililitros de cm-10-D cultura celular média em 150 por 25 milímetros placas de cultura para uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono. No dia seguinte, adicione 1,62 mililitros de solução HBS recém-preparada duas vezes concentrada, 9,5 microgramas de plasmídeo envelope, 17,5 microgramas de plasmid de embalagem e 27 microgramas do plasmid LENTI-CYP-ALDH para um tubo cônico de 50 mililitros.Traga o volume final do conteúdo do tubo até 3,0375 mililitros com água seguido pela adição de 202,5 microliters de dois cloreto de cálcio molar dropwise. Deixe a mistura de precipitação de DNA à temperatura ambiente por 20 minutos com mistura ocasional antes de adicionar 3,24 mililitros da solução dropwise por cultura 293T enquanto gira suavemente o prato. Coloque as placas na incubadora por 24 horas antes de lavar suavemente cada placa com PBS e alimentar as células com meio de cultura CM-4-D.Após mais 24 horas de cultura, colde os supernantes em garrafas estéreis para armazenamento a quatro a oito graus Celsius e alimente as células com meio CM-4-D fresco por mais 24 horas. No quarto dia, colde novamente os supernantes e coe os supernantes dos dois dias três e quatro até um filtro de 0,45 micrômetros. Em seguida, concentre o vírus pseudotipado VSV-G por centrifugação por 24 horas.No dia seguinte, decantar os supernantes. Deixe os tubos drenar em uma toalha de papel em um armário de biosegurança estéril por vários minutos, em seguida, resuspenque as pelotas em 33,3 microliters de PBS estéril contendo 5%glicerol por prato de cultura. Para a geração de células dendríticas derivadas da medula óssea, coloque as tíbias e os fêmures, colhidos de camundongos BALB/c, em um prato de cultura de 100 por 20 milímetros contendo meio de cultura fresca.Use tesouras dissecando e fórceps para remover quaisquer tecidos dos ossos. Quando todos os ossos forem limpos, use a tesoura para cortar as duas extremidades de cada osso para expor as cavidades da medula óssea. Use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 30 para lavar cada osso com 10 mililitros de meio de cultura fresca, coletando a medula óssea em um tubo de 15 mililitros.Quando toda a medula óssea tiver sido coletada, sedimente a medula óssea por centrifugação e resuspense a pelota em dois mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Depois de quatro a cinco minutos em temperatura ambiente com agitação ocasional, pare a reação com 10 mililitros de cultura celular média e colete as células por centrifugação. Resuspenda a pelota em 10 mililitros de meio de cultura CM-10-R para contagem e ajuste as células por uma vez 10 para as seis células por mililitro de concentração média de cultura CM-10-R.Em seguida, adicione 100 unidades por mililitro de GM-CSF murina recombinante e 10 unidades por mililitro de IL-4 às células. Placa quatro mililitros de células em poços individuais de uma placa de seis poços para sua incubação a 37 graus Celsius e 5% dióxido de carbono por 48 horas. No final da incubação, aspire suavemente as células não aderentes.Adicione meio fresco complementado com GM-CSF e IL-4 às culturas antes de devolver as células à incubadora de cultura celular por uma adição de 48 horas. No final da segunda incubação, colmeia as células dendríticas derivadas da medula óssea não aderentes em tubo cônico de 50 mililitros para sua centrifugação. Para gerar células BMDC-CYP-ALDH, resuspenque as culturas em uma única vez dez a dez células dendríticas por 500 microliters de cm-10-R médio por concentração de poço, e placa 500 microliters de células em cada poço de uma nova placa de cultura de seis poços.Adicione 50 microliters do vírus LENTI-CYP-ALDH e 8 microgramas por mililitro de protamina a cada poço, em seguida, coloque a placa na incubadora por 24 horas. No dia seguinte, substitua os supernacantes por meio de cultura fresca e devolva as placas à incubadora de cultura celular por mais 24 horas. Ao final da segunda incubação, as células podem ser ativadas com 100 nanogramas por mililitro de lipopolisacarídeo por poço por 24 horas antes da colheita para análises funcionais.Em comparação com as células dendríticas derivadas da medula óssea dos pais, as células BMDC-CYP-ALDH apresentam uma expressão aprimorada de 1-alfa-hidroxilase. As concentrações da forma ativa de vitamina D nas supernaciantes culturais das células BMDC-CYP e BMDC-CYP-ALDH são aproximadamente 20 vezes maiores do que as observadas nas células dendríticas derivadas da medula óssea parental e nas culturas celulares BMDC-ALDH. As intensidades fluorescentes médias das células BMDC-CYP-ALDH tratadas com o substrato são aproximadamente seis vezes maiores do que as das células dendríticas derivadas da medula óssea dos pais tratadas com o substrato.Isso sugere que as células BMDC-CYP-ALDH expressam atividade enzimática de desidrogenase-2 da retina significativamente melhorada. As células DC2.4 tratadas com 25-hidroxi vitamina D e retina não induzem uma mudança significativa na abundância de células T positivas CCR9 positivas CCR9. Em contraste, as células DC2.4 CYP-ALDH tratadas com 25-hidroxia d e retina induzem um número significativamente maior de células T reguladoras de escoamento intestinal de forma dependente da concentração.Além disso, em comparação com células de controle injetadas intraperitoneal, as células DC CYP-ALDH também induzem um aumento significativo no número de células T positivas ccr9 positivas CCR9 positivas após injeção intraperitoneal em animais receptores BALB/c. O sucesso do procedimento depende da preparação de células T saudáveis e de uma mistura de DNA corretamente preparada.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Imunologia e Infecção

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac modificação do sistema Transposon de células T primárias Humanos

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Novas ferramentas para expandir as células T reguladoras de indivíduos HIV-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de um Ataque de T-Cell dirigiu-Oligodendrocyte em Agudos fatias de cérebro

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...