Name: in vivo augmentation of gut-homing regulatory t cell induction
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction at JoVE.com

Эта работа была поддержана Управлением помощника министра обороны по вопросам здравоохранения в рамках программы медицинских исследований Peer Reviewed в соответствии с премией No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Мнения, толкования, выводы и рекомендации являются мнениями автора и не обязательно одобрены министерством обороны. Эта работа также была частично поддержана научно-исследовательскими инновационными грантами от Кафедры Медицины Университета Лома Линда (681207-2967 (XT и GG), 681205-2967 «XT» и 325491 «DJB»).

Все протоколы исследования животных in vivo были рассмотрены и одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Лома Линда (IACUC), а также Управлением по уходу и использованию животных (ACURO) Командования медицинских исследований и материальных исследов...

<ol>
	<li>Abraham, C., Cho, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease.">Inflammatory bowel disease.</a> New England Journal of Medicine. 361 (21), 2066-2078 (2009).</li><li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+bowel+disease.">Inflammatory bowel disease.</a> Annual Reviews in Immunology. 28, 573-621 (2010).</li><li>Clifford, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natalizumab-associated+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+in+patients+with+multiple+sclerosis:+lessons+from+28+cases.">Natalizumab-associated progressive multifocal leukoencephalopathy in patients with multiple sclerosis: lessons from 28 cases.</a> Lancet Neurology. 9 (4), 438-446 (2010).</li><li>Linda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+multifocal+leukoencephalopathy+after+natalizumab+monotherapy.">Progressive multifocal leukoencephalopathy after natalizumab monotherapy.</a> New England Journal of Medicine. 361 (11), 1081-1087 (2009).</li><li>Fischer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+alpha4beta7+and+GPR15+on+homing+of+effector+and+regulatory+T+cells+from+patients+with+UC+to+the+inflamed+gut+in+vivo.">Differential effects of alpha4beta7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo.</a> Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).</li><li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Generation+of+Gut-Homing+Regulatory+T+Cells+for+the+Suppression+of+Colitis.">In Vivo Generation of Gut-Homing Regulatory T Cells for the Suppression of Colitis.</a> Journal of Immunology. 202 (12), 3447-3457 (2019).</li><li>Rosenblum, M. D., Way, S. S., Abbas, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+T+cell+memory.">Regulatory T cell memory.</a> Nature Reviews Immunology. 16 (2), 90-101 (2016).</li><li>Grimm, A. J., Kontos, S., Diaceri, G., Quaglia-Thermes, X., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+of+tolerance+and+induction+of+regulatory+T+cells+by+erythrocyte-targeted+antigens.">Memory of tolerance and induction of regulatory T cells by erythrocyte-targeted antigens.</a> Science Report. 5, 15907 (2015).</li><li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+inhibitory+activity+of+regulatory+T+cells+requires+the+transcription+factor+Helios.">Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios.</a> Science. 350 (6258), 334-339 (2015).</li><li>Bhela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Plasticity+and+Stability+of+Regulatory+T+Cells+during+Viral-Induced+Inflammatory+Lesions.">The Plasticity and Stability of Regulatory T Cells during Viral-Induced Inflammatory Lesions.</a> Journal of Immunology. 199 (4), 1342-1352 (2017).</li><li>Bluestone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes+immunotherapy+using+polyclonal+regulatory+T+cells.">Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells.</a> Science Translational Medicine. 7 (315), (2015).</li><li>Marek-Trzonkowska, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapy+of+type+1+diabetes+with+CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory+T+cells+prolongs+survival+of+pancreatic+islets+-+results+of+one+year+follow-up.">Therapy of type 1 diabetes with CD4(+)CD25(high)CD127-regulatory T cells prolongs survival of pancreatic islets - results of one year follow-up.</a> Clinical Immunology. 153 (1), 23-30 (2014).</li><li>Desreumaux, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+antigen-specific+regulatory+T-cell+therapy+for+patients+with+refractory+Crohn's+disease.">Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease.</a> Gastroenterology. 143 (5), 1201-1202 (2012).</li><li>Di Ianni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tregs+prevent+GVHD+and+promote+immune+reconstitution+in+HLA-haploidentical+transplantation.">Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation.</a> Blood. 117 (14), 3921-3928 (2011).</li><li>Brunstein, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infusion+of+ex+vivo+expanded+T+regulatory+cells+in+adults+transplanted+with+umbilical+cord+blood:+safety+profile+and+detection+kinetics.">Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics.</a> Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).</li><li>Kang, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1,25-Dihyroxyvitamin+D3+promotes+FOXP3+expression+via+binding+to+vitamin+D+response+elements+in+its+conserved+noncoding+sequence+region.">1,25-Dihyroxyvitamin D3 promotes FOXP3 expression via binding to vitamin D response elements in its conserved noncoding sequence region.</a> Journal of Immunology. 188 (11), 5276-5282 (2012).</li><li>Correale, J., Ysrraelit, M. C., Gaitan, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effects+of+Vitamin+D+in+multiple+sclerosis.">Immunomodulatory effects of Vitamin D in multiple sclerosis.</a> Brain. 132, 1146-1160 (2009).</li><li>Iwata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+imprints+gut-homing+specificity+on+T+cells.">Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells.</a> Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).</li><li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+dendritic+cells+into+medicine.">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).</li><li>Vicente-Suarez, I., Brayer, J., Villagra, A., Cheng, F., Sotomayor, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLR5+ligation+by+flagellin+converts+tolerogenic+dendritic+cells+into+activating+antigen-presenting+cells+that+preferentially+induce+T-helper+1+responses.">TLR5 ligation by flagellin converts tolerogenic dendritic cells into activating antigen-presenting cells that preferentially induce T-helper 1 responses.</a> Immunology Letters. 125 (2), 114-118 (2009).</li><li>Danova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NF-kappaB,+p38+MAPK,+ERK1/2,+mTOR,+STAT3+and+increased+glycolysis+regulate+stability+of+paricalcitol/dexamethasone-generated+tolerogenic+dendritic+cells+in+the+inflammatory+environment.">NF-kappaB, p38 MAPK, ERK1/2, mTOR, STAT3 and increased glycolysis regulate stability of paricalcitol/dexamethasone-generated tolerogenic dendritic cells in the inflammatory environment.</a> Oncotarget. 6 (16), 14123-14138 (2015).</li><li>Liu, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+triggering+of+a+vitamin+D-mediated+human+antimicrobial+response.">Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response.</a> Science. 311 (5768), 1770-1773 (2006).</li><li>Cao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+vitamin+D+and+vitamin+D+analogs+in+acute+myelogenous+leukemia.">Application of vitamin D and vitamin D analogs in acute myelogenous leukemia.</a> Experimental Hematology. 50, 1-12 (2017).</li><li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lasting+Impact+of+Clostridium+difficile+Infection+in+Inflammatory+Bowel+Disease:+A+Propensity+Score+Matched+Analysis.">Lasting Impact of Clostridium difficile Infection in Inflammatory Bowel Disease: A Propensity Score Matched Analysis.</a> Inflammatory Bowel Disease. 23 (12), 2180-2188 (2017).</li><li>Tsai, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+Aneuploidy+and+Flat+Dysplasia+With+Development+of+High-Grade+Dysplasia+or+Colorectal+Cancer+in+Patients+With+Inflammatory+Bowel+Disease.">Association of Aneuploidy and Flat Dysplasia With Development of High-Grade Dysplasia or Colorectal Cancer in Patients With Inflammatory Bowel Disease.</a> Gastroenterology. 153 (6), 1492-1495 (2017).</li><li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+dendritic+cell+migration+into+lymph+nodes+using+molecular+imaging+with+sodium+iodide+symporter+and+enhanced+firefly+luciferase+genes.">Tracking of dendritic cell migration into lymph nodes using molecular imaging with sodium iodide symporter and enhanced firefly luciferase genes.</a> Science Reports. 5, 9865 (2015).</li><li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+dendritic+cells+can+present+exogenous+antigens+on+both+MHC+class+I+and+class+II+molecules.">Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules.</a> Journal of Immunology. 158 (6), 2723-2730 (1997).</li><li>Okada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Administration+route-dependent+vaccine+efficiency+of+murine+dendritic+cells+pulsed+with+antigens.">Administration route-dependent vaccine efficiency of murine dendritic cells pulsed with antigens.</a> British Journal of Cancer. 84 (11), 1564-1570 (2001).</li><li>Li, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells,+engineered+to+overexpress+25-hydroxyvitamin+D+1alpha-hydroxylase+and+pulsed+with+a+myelin+antigen,+provide+myelin-specific+suppression+of+ongoing+experimental+allergic+encephalomyelitis.">Dendritic cells, engineered to overexpress 25-hydroxyvitamin D 1alpha-hydroxylase and pulsed with a myelin antigen, provide myelin-specific suppression of ongoing experimental allergic encephalomyelitis.</a> FASEB J. , (2017).</li><li>Narula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+High-Dose+Vitamin+D3+Supplementation+in+Patients+with+Crohn's+Disease+in+Remission:+A+Pilot+Randomized+Double-Blind+Controlled+Study.">Impact of High-Dose Vitamin D3 Supplementation in Patients with Crohn's Disease in Remission: A Pilot Randomized Double-Blind Controlled Study.</a> Digestive Disease Science. 62 (2), 448-455 (2017).</li><li>Ahmad, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+A+Supplementation+during+Pregnancy+Enhances+Pandemic+H1N1+Vaccine+Response+in+Mothers,+but+Enhancement+of+Transplacental+Antibody+Transfer+May+Depend+on+When+Mothers+Are+Vaccinated+during+Pregnancy.">Vitamin A Supplementation during Pregnancy Enhances Pandemic H1N1 Vaccine Response in Mothers, but Enhancement of Transplacental Antibody Transfer May Depend on When Mothers Are Vaccinated during Pregnancy.</a> Journal of Nutrition. 148 (12), 1968-1975 (2018).</li><li>Noronha, S. M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldefluor+protocol+to+sort+keratinocytes+stem+cells+from+skin.">Aldefluor protocol to sort keratinocytes stem cells from skin.</a> Acta Cirurgica Brasileira. 32 (11), 984-994 (2017).</li><li>Ferreira, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+D3+Induces+Tolerance+in+Human+Dendritic+Cells+by+Activation+of+Intracellular+Metabolic+Pathways.">Vitamin D3 Induces Tolerance in Human Dendritic Cells by Activation of Intracellular Metabolic Pathways.</a> Cell Reports. 10 (5), 711-725 (2015).</li><li>Bakdash, G., Vogelpoel, L. T., van Capel, T. M., Kapsenberg, M. L., de Jong, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+primes+human+dendritic+cells+to+induce+gut-homing,+IL-10-producing+regulatory+T+cells.">Retinoic acid primes human dendritic cells to induce gut-homing, IL-10-producing regulatory T cells.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 265-278 (2015).</li></ol>

В этой статье мы описываем использование dc-CYP-ALDH клеток, для увеличения индукции кишки homing Treg клеток в периферических лимфоидных тканей. Наши данные показали, что клетки DC-CYP-ALDH могут синтезировать локально высокие концентрации de novo как 1,25(OH)2D и RA in vitro в присутствии соответствующих ...

Воспалительные заболевания кишечника (IBD) является воспалительным хроническим заболеванием в желудочно-кишечном тракте (GUT). В Соединенных Штатах, Есть около 1,4 миллиона пациентов IBD. Принято считать, что дисрегулируемый иммунный ответ на кишечные бактерии инициирует болезнь и нарушает слизистую оболочку эпителиального барьера1,2. По этой причине, в настоящее время доступны США пищевых продуктов и медикаментов (FDA) утвержденных препаратов подавляют функции воспалительных посредников или блокировать самонаведения иммунных клеток в кишечнике. Тем не менее, воспалительные посредники и иммунные клетки, которые являются мишенью также необходимы для иммунной защиты. В результате, ингибиторы воспалительного посредника компрометируют системную иммунную защиту, а блокаторы самонаводящихся иммунных клеток ослабляют иммунную защиту кишечника, оба из которых могут привести к тяжелым последствиям3,4. Кроме того, блокаторы самонаведения иммунных клеток могут также блокировать самонаводящиеся регулятивные Клетки T (Treg) в кишечник и, следовательно, могут ухудшить уже скомпрометированную иммунную толерантность кишечника у пациентов IBD. Кроме того, блокирование Treg ячейки самонаведения в кишечнике может также привести к системному подавлению иммунной системы из-за накопления клеток Treg в крови5. Наконец, ингибиторы и блокаторы функционируют временно и, таким образом, требуют частых вводом. Частое введение этих ингибиторов и блокаторов может еще больше усугубить неблагоприятные побочные эффекты.
Недавно мы предложили новую стратегию, которая потенциально может смягчить или даже устранить побочные эффекты, связанные с текущими препаратами для лечения IBD6. Эта стратегия дополняет индукцию клеток Treg, наводящих кишки в периферических лимфоидных тканях6. Обоснование этой стратегии является то, что кишки самонаведения Treg клетки специально дома в кишечнике и, следовательно, не будет идти на компромисс системной иммунной защиты. Кроме того, так как клетки Treg потенциально могут формировать память7,8, кишки-homing Treg клетки потенциально могут обеспечить стабильный контроль хронического воспаления кишечника у пациентов IBD и, таким образом, лечение не должно быть введено так часто. Кроме того, так как эта стратегия увеличивает индукции кишки hom-homing Treg клеток in vivo, она не имеет озабоченность in vivo нестабильности в высокопровистской среде, которая связана с приемной передачи in vitro генерируемых Treg клеток9,10. В связи с этим, в пробирке генерируемых Treg клетки являются одной из предложенных стратегий для лечения аутоиммунных заболеваний11,12,13 и трансплантации отказ14,15. Наконец, в этой стратегии, дендритные клетки (DCs) разработаны для производства локально высоких концентраций двух молекул de novo: активного витамина D (1,25-dihydroxyvitamin D или 1,25-ОГ)2D) и активного витамина А (ретиноиновая кислота или РА). Мы выбрали 1,25 (OH)2D и РА, потому что 1,25 (OH)2D может вызвать экспрессию регуляторных молекул (например, вилочная коробка P3 «foxp3» и интерлейкин-10 «IL-10»)16,17 и что РА может стимулировать выражение рецепторов кишки в Т-клетках18. Потому что оба 1,25 (OH)2D и РА может также tolerize DCs28,29, мы считаем, что инженерии DCs будет стабильно поддерживается в толерогенном статусе in vivo и, следовательно, обойти in vivo нестабильности проблем, которые связаны с in vitro генерируемых DCs (TolDCs)19,20,21. В этом отношении, TolDCs также являются одной из предлагаемых стратегий для in vivo увеличения Treg функции клеток19,20,21. Для поддержки наших рассуждений, мы показали, что инженерии DCs, после доставки in vivo, может увеличить индукцию кишечника hom-homing Treg клеток в периферических лимфоидныхтканей 6.
Дополнительным преимуществом нашей предлагаемой стратегии является то, что 1,25 (OH)2D также имеет другие функции, которые потенциально могут принести пользу пациентам IBD. Эти другие функции включают в себя способность 1,25 (OH)2D, чтобы стимулировать секрецию противомикробных препаратов22 и подавляет канцерогенез23. Инфекции и раковые заболевания часто связаны с IBD24,25.
Для генерации ЦС, которые могут производить локально высокие концентрации как 1,25 (OH)2D и RA de novo, мы используем ленцивирусный вектор для инженера DCs для переэкспресса двух генов. Одним из генов является цитохром P450 семейства 27 подсемейства B член 1 (CYP27B1), который кодирует 25-гидроксивитамин D 1 "гидроксилаза" (1"-гидроксилаза), который физиологически катализает синтез 1,25 (OH)2D. Другой ген альдегид дегидрогеназы 1 член семьи A2 (ALDH1a2), который кодирует дегидрогеназы ретинальдегида 2 (RALDH2), который физиологически катализа синтеза РА6.
Потому что in vivo увеличение кишки-homing Treg клеточной индукции потенциально важно в обработке IBD, в следующем протоколе мы подробно процедуры для генерации 1 "-гидроксилаза-RALDH2-переэкспрессии DCs (DC-CYP-ALDH клеток), что может быть использован для будущего исследования кишки самонаведения Treg клеток in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 03-377-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 20 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# H4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>Cat# 01700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CYP27B1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab95047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-10-D cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-10-R cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-4-D cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab205718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Cat# 391340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-CYP-ALDH</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5&#39; KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine GM-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14-841-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11140076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMVR8.74</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid# 22036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMD2G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid# 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 15 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 50 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# AM12502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polycloncal IgG isotype control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab171870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement</td>
			<td>Heartland Assays</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 21870076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell strainers, 40 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-201-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile storage bottles, 500 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# CLS431432</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo augmentation of gut-homing regulatory t cell induction

Воспалительные заболевания кишечника (IBD) является воспалительным хроническим заболеванием в желудочно-кишечном тракте (GUT). В Соединенных Штатах, Есть около 1,4 миллиона пациентов IBD. Общепризнано, что дисрегулируемый иммунный ответ на кишечные бактерии инициирует болезнь и нарушает слизистую оболочку эпителиального барьера. Недавно мы показываем, что кишки homing нормативных T (Treg) клетки являются перспективными терапии для IBD. Соответственно, эта статья представляет протокол для in vivo увеличения кишки-homing Treg клетки индукции. В этом протоколе, дендритные клетки разработаны для производства локально высоких концентраций двух молекул de novo, активного витамина D (1,25-dihydroxyvitamin D или 1,25-OH2D) и активного витамина А (ретиноиновая кислота или РА). Мы выбрали 1,25 (OH)2D и RA на основе предыдущих выводов, показывающих, что 1,25 (OH)2D может вызвать выражение регуляторных молекул (например, вилочная коробка P3 и интерлейкин-10) и что РА может стимулировать экспрессию рецепторов самонаведения кишечника в Т-клетках. Для генерации таких инженерных дендритных клеток мы используем лентивирусный вектор для преобразить дендритные клетки, чтобы переэкспрессировать два гена. Одним из генов является цитохром P450 семейства 27 подсемейства B член 1, который кодирует 25-гидроксивитамин D 1 "гидроксилаза, которая физиологически катализа синтеза 1,25 (OH)2D. Другой ген альдегид дегидрогеназы 1 член семьи A2, который кодирует ретинальдегид дегидрогеназы 2, который физиологически катализа синтеза РА. Этот протокол может быть использован для будущего исследования кишки самонаведения Treg клеток in vivo.

Клетки DC-CYP-ALDH выразили значительное увеличение количества 1"-гидроксилаза. Чтобы определить, были ли клетки DC-CYP-ALDH, генерируемые из BMDCs, значительно увеличенным количеством 1"-гидроксилаза, БМДК были трансдуцированы с помощью вируса ленти-CYP-ALDH для производства клеток DC-CYP-ALDH с к?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction at JoVE.com

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Здесь мы представляем протокол для in vivo увеличения кишки-самонаведения регулятивной индукции Т-клеток. В этом протоколе дендритные клетки разработаны для локального производства высоких концентраций активного витамина D (1,25-дигидроксивитамин D или 1,25-ОХ)2D) и активного витамина А (ретиноевая кислота или РА) де-ново.

В Vivo Augmentation Гут-Homing регулятивной T-клеточной индукции

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

Этот протокол описывает потенциально новую терапевтическую стратегию, которая может быть легко изменена для применения человеком. Этот метод непосредственно усиливает индукцию кишечника самонаведения регуляторных Т-клеток в периферических лимфоидных тканях и может быть стабилико реализован даже в весьма провоспалительных средах. Эти методы также могут быть использованы для исследования роли активного витамина D и витамина А в периферической иммунной системе.Эта визуальная демонстрация будет предоставлять шаг за шагом инструкции для генерации высококачественных инженерных дендритных клеток, которые имеют решающее значение для успеха этой техники. Начните с посева один раз от 10 до семи 293T клеток в 20 миллилитров CM-10-D клеточной культуры среды в 150 на 25 миллиметров пластин культуры в течение 24 часов инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. На следующий день добавьте 1,62 миллилитров свежеприготовленного двухкратного концентрированного раствора HBS, 9,5 микрограмма плазмидной оболочки, 17,5 микрограмма упаковочной плазмиды и 27 микрограммов плазминной плазмиды LENTI-CYP-ALDH до 50 миллилитров конической трубки.Довнесите конечный объем содержимого трубки до 3,0375 миллилитров с водой с последующим добавлением 202,5 микролитров двух мларных хлорид кальция dropwise. Оставьте смесь осадков ДНК при комнатной температуре в течение 20 минут с редким смешиванием, прежде чем добавить 3,24 миллилитров раствора dropwise на 293T культуры, а осторожно закрученного блюдо. Поместите пластины в инкубатор в течение 24 часов, прежде чем аккуратно мыть каждую тарелку с PBS и кормления клеток с CM-4-D культуры среды.После еще 24 часов культуры, урожай supernatants в стерильные бутылки для хранения при четырех до восьми градусов по Цельсию и кормить клетки со свежими CM-4-D среды в течение еще 24 часов. На четвертый день, урожай supernatants снова и процедить supernatants от обоих дней три и четыре до 0,45 микрометрового фильтра. Затем в течение 24 часов концентрируют псевдотипированный вирус VSV-G путем центрифугации.На следующий день декант супернатантов. Разрешить трубки для слива на бумажное полотенце в стерильной био-безопасности кабинета в течение нескольких минут, а затем повторно гранулы в 33,3 микролитров стерильных PBS, содержащих 5%глицерол на культуру блюдо. Для костного мозга, полученных дендритных клеток поколения, место голени и бедренной кости, собранные из BALB / C мышей, в 100 на 20 миллиметров культуры блюдо, содержащее свежие среды культуры.Используйте рассечение ножниц и типсов, чтобы удалить любые ткани из костей. Когда все кости были очищены, используйте ножницы, чтобы сократить оба конца каждой кости, чтобы разоблачить полости костного мозга. Используйте 10 миллилитров шприц оснащен 30 калибровочных иглы, чтобы промыть каждую кость с 10 миллилитров свежей среды культуры, собирая костного мозга в 15 миллилитров трубки.Когда весь костный мозг был собран, осадок костного мозга путем центрифугации и повторно гранулы в двух миллилитров буфера лиза красных кровяных телец. После четырех-пяти минут при комнатной температуре с редким встряхиванием, остановить реакцию с 10 миллилитров клеточной культуры среды и собирать клетки центрифугации. Переусердуйте гранулы в 10 миллилитров среды культуры CM-10-R для подсчета и корректировки клеток на один раз от 10 до шести клеток на миллилитр средней концентрации культуры CM-10-R.Затем добавьте к клеткам 100 единиц на миллилитр рекомбинантного мурина GM-CSF и 10 единиц на миллилитр ИЛ-4. Плита четыре миллилитров клеток в отдельных скважин из шести пластины культуры скважины для их инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 48 часов. В конце инкубации осторожно аспирируют неприемленные клетки.Добавьте свежую среду, дополненную GM-CSF и IL-4, к культурам, прежде чем возвращать клетки в инкубатор клеточной культуры для добавления 48 часов. В конце второй инкубации, урожай непритята костного мозга производных дендритных клеток в 50 миллилитров конической трубки для их центрифугации. Для генерации клеток BMDC-CYP-ALDH, перерасход культур в один раз десять-шестой дендритных клеток на 500 микролитров CM-10-R среды на концентрацию хорошо, и пластины 500 микролитров клеток в каждый колодец из новых шести хорошо культуры пластины.Добавьте 50 микролитров вируса LENTI-CYP-ALDH и 8 микрограмм на миллилитр протамина в каждую колодец, затем поместите пластину в инкубатор на 24 часа. На следующий день замените супернатанты свежей культурной средой и верните пластины в инкубатор клеточной культуры еще на 24 часа. В конце второй инкубации клетки могут быть активированы со 100 нанограммами на миллилитр липополисахарид на колодец в течение 24 часов до сбора урожая для функционального анализа.По сравнению с родительскими клетками костного мозга, полученными дендритными клетками, клетки BMDC-CYP-ALDH демонстрируют повышенную экспрессию 1-альфа-гидроксилазы. Концентрации активной формы витамина D в культурных супернатантах клеток BMDC-CYP и BMDC-CYP-ALDH примерно в 20 раз выше, чем в родительских культурах костного мозга, полученных дендритными клетками и клеточными культурами BMDC-ALDH. Средняя флуоресцентная интенсивности клеток BMDC-CYP-ALDH, обработанных субстратом, примерно в шесть раз выше, чем у родительских клеток костного мозга, полученных дендритными клетками, обработанными субстратом.Это говорит о том, что клетки BMDC-CYP-ALDH выражают значительно усиленную дегидегидрогеназу сетчатки-2. Клетки DC2.4, обработанные 25-гидрокси витамином D и сетчаткой, не вызывают существенных изменений в обилии foxp3 положительных положительных Т-клеток CCR9. В отличие от этого, DC2.4 CYP-ALDH клетки, обработанные 25-гидрокси витамина D и сетчатки вызывают значительно большее количество кишечника самонаведения нормативных Т-клеток в концентрации зависимым образом.Кроме того, по сравнению с интраперитонально вводили контрольные клетки, DC CYP-ALDH клетки также вызывают значительное увеличение числа Foxp3 положительные CCR9 положительные Т-клетки CD4 после внутриперитонеальной инъекции в BALB / C реципиент животных. Успех процедуры зависит от подготовки здоровых Т-клеток и правильно подготовленной смеси ДНК.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Ретровирусные трансдукция Т-клеточных рецепторов в мышь Т-клеток

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Индукционная трансплантат против хозяина и<em&gt; В Vivo</em&gt; Т-клеток Мониторинг Использование MHC соответствием мышиной модели

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

Генерация индуцированного регуляторных Т клеток из первичной человека наивного и Т-клеток памяти

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

PiggyBac транспозонов модификации системы первичной Т-клетках человека

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Новые методы для расширения регуляторных Т-клеток от ВИЧ-1-инфицированных

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

Использование флуоресцентных целевых массивов для оценки Т-клеточные ответы<em&gt; В естественных условиях</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

<em&gt; Экс естественных</em&gt; Модель олигодендроцит-направленного Т-клеток Атака в острых мозга Ломтики

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Индукционная мышиных воспаление кишечника с помощью приемных передачи эффекторных CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Высокая</sup&gt; Т-клеток в иммунодефицитных мышей

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Мышь наивного CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток Выделение и<em&gt; В пробирке</em&gt; Дифференциация в Т-клеточных подмножеств

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...