Name: in vivo augmentation of gut-homing regulatory t cell induction
Uploaded: 2020-01-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Oficina del Subsecretario de Defensa para Asuntos de Salud a través del Programa de Investigación Médica Revisado por Pares bajo el Premio No. W81XWH-15-1-0240 (XT). Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las del autor y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de Defensa. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por las Becas de Innovación en Investigación del Departamento de Medicina de la Universidad Loma Linda (681207-2967 [XT y GG], 681205-2967 [XT] y 325491 [DJB]).

Todos los protocolos de estudio animal in vivo fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad lomána (IACUC), así como por la Oficina de Revisión de Cuidado y Uso de Animales (ACURO) del Comando de Investigación Médica y Materiales del Ejército de los Estados Unidos (USAMRMC) del Comando de Investigación Médica y Materiales del Ejército de los Estados Unidos (USAMRMC) del Comando de Investigación Médica y Materiales del Ejército de los Estados Unidos (...

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En este artículo describimos el uso de células DC-CYP-ALDH, para aumentar la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos. Nuestros datos han demostrado que las células DC-CYP-ALDH pueden sintetizar concentraciones localmente altas de novo de 1,25(OH)2D y RA in vitro en presencia de sustratos correspondientes (es decir, 25[OH]D y retinol, respectivamente). Debido a que las concentraciones sanguíneas suficientes de 25(OH)D y retinol se pueden lograr fácilmente a través de sup...

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica inflamatoria en el tracto gastrointestinal (GUT). En los Estados Unidos, hay aproximadamente 1,4 millones de pacientes con EII. Generalmente se acepta que una respuesta inmune desregulada a las bacterias intestinales inicia la enfermedad y interrumpe la barrera epitelial mucosa1,2. Por esta razón, actualmente disponibles medicamentos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus sitios) inhiben las funciones de los mediadores inflamatorios o bloquean la localización de células inmunitarias en el intestino. Sin embargo, los mediadores inflamatorios y las células inmunitarias que están dirigidas también son necesarios para las defensas inmunitarias. Como resultado, los inhibidores del mediador inflamatorio comprometen la defensa inmune sistémica y los bloqueadores de homing de células inmunitarias debilitan la defensa inmune intestinal, lo que puede conducir a consecuencias graves3,4. Además, los bloqueadores de homing de células inmunitarias también pueden bloquear la homing de células T reguladoras (Treg) en el intestino y por lo tanto pueden empeorar la tolerancia inmunitaria intestinal ya comprometida en pacientes con EII. Además, el bloqueo de la célula de Treg homing en el intestino también puede conducir a la supresión inmune sistémica debido a la acumulación de células Treg en la sangre5. Por último, los inhibidores y bloqueadores funcionan de forma transitoria y, por lo que, requieren administraciones frecuentes. La administración frecuente de estos inhibidores y bloqueadores puede exacerbar aún más los efectos secundarios adversos.
Recientemente, propusimos una estrategia novedosa que potencialmente puede mitigar o incluso eliminar los efectos secundarios asociados con los fármacos actuales para el tratamiento de la EII6. Esta estrategia aumenta la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos6. La razón de esta estrategia es que las células Treg intestinales específicamente hogar del intestino y por lo tanto no comprometerá las defensas inmunitarias sistémicas. Además, dado que las células Treg pueden potencialmente formar memoria7,8, las células Treg intestinales pueden potencialmente proporcionar un control estable de la inflamación intestinal crónica en pacientes con EII y, por lo tanto, el tratamiento no debe ser necesario administrar con tanta frecuencia. Además, dado que esta estrategia aumenta la inducción de células Treg intestinales in vivo, no tiene la preocupación de la inestabilidad in vivo en un entorno altamente proinflamatorio que se asocia con la transferencia adoptiva de células Treg generadas in vitro9,10. En este sentido, las células Treg generadas in vitro son una de las estrategias propuestas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes11,12,13 y rechazo de trasplante14,15. Finalmente, en esta estrategia, las células dendríticas (CC) están diseñadas para producir localmente altas concentraciones de dos moléculas de novo: vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y vitamina A activa (ácido retinoico o RA). Elegimos 1,25(OH)2D y RA porque 1,25(OH)2D puede inducir la expresión de moléculas reguladoras (por ejemplo, la caja de cabezal de horquilla P3 [foxp3] e interleucina-10 [IL-10])16,17 y que RA puede estimular la expresión de receptores de homing intestinal en las células T18. Debido a que tanto 1,25(OH)2D como RA también pueden tolerizar los CC28,29,raquemos por ello que los CC de ingeniería se mantendrán establemente en un estado tolerogénico in vivo y, por lo tanto, eludan las preocupaciones de inestabilidad in vivo asociadas con los CC tolerogénicos generados in vitro (TolDCs)19,20,21. En este sentido, los TolDC son también una de las estrategias propuestas para el aumento in vivo de las funciones celulares treg19,20,21. Para apoyar nuestro razonamiento, hemos demostrado que los controladores de tecnología de desarrollo, tras la entrega in vivo, pueden aumentar la inducción de células Treg intestinales en tejidos linfoides periféricos6.
Una ventaja adicional de nuestra estrategia propuesta es que 1,25(OH)2D también tiene otras funciones que potencialmente pueden beneficiar a los pacientes con EII. Estas otras funciones incluyen la capacidad de 1,25(OH)2D para estimular la secreción de antimicrobianos22 y para suprimir la carcinogénesis23. Las infecciones y los cánceres se asocian con frecuencia con la EII24,25.
Para generar los CC que pueden producir concentraciones localmente altas de 1,25(OH)2D y RA de novo, utilizamos un vector lentiviral para diseñar dCs para sobreexpresar dos genes. Un gen es el citocromo P450 familia 27 subfamilia B miembro 1 (CYP27B1) que codifica 25-hidroxivitamina D-hidroxilasa (1o-hidroxilasa), que cataliza fisiológicamente la síntesis de 1,25(OH)2D. El otro gen es el aldehído deshidrogenasa 1 miembro de la familia A2 (ALDH1a2) que codifica la retinaldehíde deshidrogenasa 2 (RALDH2), que cataliza fisiológicamente la síntesis de RA6.
Debido a que el aumento in vivo de la inducción de la célula Treg intestinal es potencialmente importante en el tratamiento de la EII, en el siguiente protocolo detallaremos los procedimientos para la generación de los DC subexpresantes 1--hidroxilasa-RALDH2 (células DC-CYP-ALDH) que se puede utilizar para la futura investigación de células Treg intestinales in vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 03-377-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm x 20 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-200-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm x 25 mm culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-hydroxycholecalciferol (25[OH]D)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# H4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>293T cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well culture plates</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-200-83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>Cat# 01700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CYP27B1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab95047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# C1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-10-D cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-10-R cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RPMI 1640 medium (no glutamine) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-4-D cell culture medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DMEM medium containing 4% fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin/streptomycin, 0.055 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM nonessential amino acid, and 2 mM L-glutamine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters, 0.22 mM, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters, 0.45 mM, 500 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# CLS430514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 08-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11960044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 22-327379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco ACK lysing buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# A1049201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab205718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Cat# 391340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lenti-CYP-ALDH</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td>1.6-kb mouse CYP27B1 and ALDH1a2 cDNAs were amplified by PCR using a plasmid containing the CYP27B1 cDNA and a plasmid containing the ALDH1a2 cDNA respectively (GeneCopoeia). The amplified CYP27B1 cDNA fragment with a 5&#39; KOZAK ribosome entry sequence was cloned into the pRRL-SIN.cPPt.PGKGFP.WPRE lentiviral vector (Addgene). The resulting construct was designated as lenti-CYP-GFP. The amplified ALDH1a2 cDNA fragment was cloned into the lenti-CYP-GFP to replace the GFP and was designated as lenti-CYP-ALDH. This bicistronic plasmid expresses CYP27B1 controlled by SFFV promoter and ALDH1a2 controlled by PGK promoter.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# L3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine GM-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 315-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IL-4</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>Cat# 214-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# NIST2186II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 14-841-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonessential Amino Acids</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11140076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCMVR8.74</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid# 22036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phoshate Balanced Solution (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 20012027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMD2G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>Plasmid# 12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 15 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# AM12500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene tube, 50 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# AM12502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protamine sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat# P3369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polycloncal IgG isotype control</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Cat# ab171870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioimmunoassay for 1,25(OH)2D measurement</td>
			<td>Heartland Assays</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium, no glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 21870076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvat</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat#: 11360070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell strainers, 40 mm</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 07-201-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile storage bottles, 500 mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# CLS431432</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo augmentation of gut-homing regulatory t cell induction

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una enfermedad crónica inflamatoria en el tracto gastrointestinal (GUT). En los Estados Unidos, hay aproximadamente 1,4 millones de pacientes con EII. Generalmente se acepta que una respuesta inmune desregulada a las bacterias intestinales inicia la enfermedad y interrumpe la barrera epitelial de la mucosa. Recientemente demostramos que las células T reguladoras intestinales (Treg) son una terapia prometedora para la EII. En consecuencia, este artículo presenta un protocolo para el aumento in vivo de la inducción de la célula Treg intestinal. En este protocolo, las células dendríticas están diseñadas para producir concentraciones localmente altas de dos moléculas de novo, vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y vitamina A activa (ácido retinoico o RA). Elegimos 1,25(OH)2D y RA basándose en hallazgos anteriores que muestran que 1,25(OH)2D puede inducir la expresión de moléculas reguladoras (por ejemplo, la caja de cabecera P3 e interleucina-10) y que la AR puede estimular la expresión de receptores intestinales en células T. Para generar estas células dendríticas diseñadas, utilizamos un vector lentiviral para transducir las células dendríticas para sobreexpresar dos genes. Un gen es el citocromo P450 familia 27 subfamilia B miembro 1 que codifica 25-hidroxivitamina D 1o-hidroxilasa, que cataliza fisiológicamente la síntesis de 1,25(OH)2D. El otro gen es el aldehído deshidrogenasa 1 miembro de la familia A2 que codifica la retinaldehíde deshidrogenasa 2, que cataliza fisiológicamente la síntesis de RA. Este protocolo se puede utilizar para la investigación futura de células Treg intestinales in vivo.

Las células DC-CYP-ALDH expresaron un aumento significativo de la cantidad de 1o-hidroxilasa. Para determinar si las células DC-CYP-ALDH generadas a partir de BMDC expresaron una cantidad significativamente mayor de 1o-hidroxilasa, los BMDC fueron transducidos con el virus lenti-CYP-ALDH para producir células DC-CYP-ALDH derivadas de médula ósea (células BMDC-CYP-ALDH). Posteriormente, las células BMDC-CYP-ALDH fueron examinadas para la expresión de 1-hidroxilasa por FACS. Nuestros datos mostraro...

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In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Aquí presentamos un protocolo para el aumento in vivo de la inducción de células T reguladoras intestinales. En este protocolo, las células dendríticas están diseñadas para producir localmente altas concentraciones de la vitamina D activa (1,25-dihidroxivitamina D o 1,25[OH]2D) y la vitamina A activa (ácido retinoico o RA) de novo.

En Vivo Aumento de la Inducción de Células T Regulatorias Gut-Homing

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

Este protocolo describe una estrategia terapéutica potencialmente novedosa que se puede modificar fácilmente para aplicaciones humanas. Esta técnica mejora directamente la inducción de las células T reguladoras de la dirección intestinal en los tejidos linfoides periféricos y se puede implementar de forma estable incluso en entornos altamente proinflamatorios. Estas técnicas también se pueden utilizar para investigar el papel de la vitamina D activa y la vitamina A dentro del sistema inmunitario periférico.Esta demostración visual proporcionará instrucciones paso a paso para la generación de células dendríticas de ingeniería de alta calidad que son fundamentales para el éxito de esta técnica. Comience por sembrar una vez 10 a las siete células 293T en 20 mililitros de medio de cultivo celular CM-10-D en placas de cultivo de 150 por 25 milímetros para una incubación de 24 horas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono. Al día siguiente, añadir 1,62 mililitros de solución de HBS recién preparada, 9,5 microgramos de plásmido de envolvente, 17,5 microgramos de plásmido de envasado y 27 microgramos del plásmido LENTI-CYP-ALDH a un tubo cónico de 50 mililitros.Lleve el volumen final del contenido del tubo hasta 3.0375 mililitros con agua seguido de la adición de 202,5 microlitros de dos molares de cloruro de calcio por gotas. Deje la mezcla de precipitación de ADN a temperatura ambiente durante 20 minutos con una mezcla ocasional antes de añadir 3,24 mililitros de la solución por gotas según el cultivo 293T mientras gira suavemente el plato. Coloque las placas en la incubadora durante 24 horas antes de lavar suavemente cada plato con PBS y alimentar las células con un medio de cultivo CM-4-D.Después de otras 24 horas de cultivo, cosecha los sobrenadantes en botellas estériles para su almacenamiento a cuatro a ocho grados centígrados y alimenta las células con un medio CM-4-D fresco durante otras 24 horas. En el cuarto día, cosecha los sobrenadantes de nuevo y colar los sobrenadantes de ambos días tres y cuatro a un filtro de 0,45 micrómetros. Luego, concentra el virus pseudotipo VSV-G por centrifugación durante 24 horas.Al día siguiente decantar a los sobrenadantes. Deje que los tubos drene sobre una toalla de papel en un gabinete de biosecuerpo estéril durante varios minutos, luego resuspender los pellets en 33.3 microlitros de PBS estéril que contiene 5% de glicerol por plato de cultivo. Para la generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea, coloque las tibias y fémures, cosechados de ratones BALB/c, en un plato de cultivo de 100 por 20 milímetros que contenga un medio de cultivo fresco.Usa tijeras y fórceps diseccionados para eliminar cualquier tejido de los huesos. Cuando se hayan limpiado todos los huesos, utilice las tijeras para cortar ambos extremos de cada hueso para exponer las cavidades de la médula ósea. Utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 30 para lavar cada hueso con 10 mililitros de medio de cultivo fresco, recogiendo la médula ósea en un tubo de 15 mililitros.Cuando se ha recogido toda la médula ósea, sedimentar la médula ósea por centrifugación y resuspend el pellet en dos mililitros de tólizar de lysis de glóbulos rojos. Después de cuatro a cinco minutos a temperatura ambiente con temblores ocasionales, detenga la reacción con 10 mililitros de medio de cultivo celular y recoja las células por centrifugación. Resuspender el pellet en 10 mililitros de medio de cultivo CM-10-R para el recuento y ajustar las células por una por 10 a las seis células por mililitro de concentración media de cultivo CM-10-R.A continuación, agregue 100 unidades por mililitro de GM-CSF murino recombinante y 10 unidades por mililitro de IL-4 a las células. Placa de cuatro mililitros de células en pozos individuales de una placa de cultivo de seis pozos para su incubación a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante 48 horas. Al final de la incubación, aspira suavemente las células no adherentes.Añadir medio fresco complementado con GM-CSF e IL-4 a los cultivos antes de devolver las células a la incubadora de cultivo celular por un adicional de 48 horas. Al final de la segunda incubación, cosecha las células dendríticas derivadas de la médula ósea no adherente en un tubo cónico de 50 mililitros para su centrifugación. Para generar células BMDC-CYP-ALDH, resuspendir los cultivos a una vez diez a las sextas células dendríticas por cada 500 microlitros de medio CM-10-R por concentración de pozo, y placa 500 microlitros de células en cada pozo de una nueva placa de cultivo de seis pozos.Añadir 50 microlitros del virus LENTI-CYP-ALDH y 8 microgramos por mililitro de protamina a cada pozo, luego colocar la placa en la incubadora durante 24 horas. Al día siguiente, sustituya los sobrenadantes por un medio de cultivo fresco y devuelva las placas a la incubadora de cultivo celular durante otras 24 horas. Al final de la segunda incubación, las células se pueden activar con 100 nanogramos por mililitro de lipopolisacárido por pozo durante 24 horas antes de la cosecha para análisis funcionales.En comparación con las células dendríticas derivadas de la médula ósea parental, las células BMDC-CYP-ALDH muestran una expresión mejorada de 1-alfa-hidroxilasa. Las concentraciones de la forma activa de vitamina D en el cultivo de sobrenadantes de BMDC-CYP y BMDC-CYP-ALDH son aproximadamente 20 veces más altas que las observadas en la célula dendrítica derivada de la médula ósea parental y los cultivos celulares BMDC-ALDH. Las intensidades fluorescentes medias de las células BMDC-CYP-ALDH tratadas con el sustrato son aproximadamente seis veces superiores a las de las células dendríticas derivadas de la médula ósea parental tratadas con el sustrato.Esto sugiere que las células BMDC-CYP-ALDH expresan actividad enzimática de la deshirogenasa de la retina significativamente mejorada. Las células DC2.4 tratadas con vitamina D y retin retinidad 25-hidroxi no inducen un cambio significativo en la abundancia de células T positivas CD4 CD4 DE CCR9 ccR9 foxp3. Por el contrario, las células DC2.4 CYP-ALDH tratadas con vitamina D de 25-hidroxi y retina inducen un número significativamente mayor de células T reguladoras que insiguían en una manera dependiente de la concentración.Además, en comparación con las células de control inyectadas intraperitonealmente, las células DC CYP-ALDH también inducen un aumento significativo en el número de células T positivas de FOXP3 CCR9 CD4 positivas después de la inyección intraperitoneal en animales receptores BALB/c. El éxito del procedimiento depende de la preparación de células T sanas y una mezcla de ADN correctamente preparada.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

La inducción de la enfermedad de injerto contra huésped y<em&gt; En Vivo</em&gt; T Monitoreo Celular Utilizando un modelo murino MHC de concordancia

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve and Memory T Cells

La generación de células T reguladoras inducidas de células humanas primarias T vírgenes y de memoria

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

Nuevas herramientas para expandir células T reguladoras de las personas VIH-1-infected

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

El uso de fluorescentes Arrays objetivo para la evaluación de las respuestas de células T<em&gt; En vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de un ataque de células T Oligodendrocyte dirigida en Rebanadas cerebral agudo

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Mouse NaÃƒÆ’Ã‚Â¯ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...