Name: a high output method to isolate cerebral pericytes from mouse
Uploaded: 2020-01-14T15:00:00
Duration: 6 min 49 s
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LT e FG sono stati concessi da Agence Nationale de la Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) nell'ambito del programma congiunto dell'UE – Neurodegenerative Disease Research (JPND) per il progetto SNOWBALL.

Tutti gli esperimenti sono stati effettuati seguendo le linee guida dell'Istituto per l'uso e la manipolazione degli animali. In conformità con la legislazione francese, la struttura animale presso l'Università di Artois è stata approvata dalle autorità locali (riferimento: B62-498-5). In conformità con la legislazione dell'Unione europea (direttiva 2010/63/UE), tutte le procedure sono state approvate dal comitato locale per la cura e l'uso degli animali (Comité d'Ethique en Expérimentation du Nord-Pas-De-Calais, riferimento: C2EA 75) e dal Ministero della ricerca francese (riferimento: 2015090115412152).
1. Preparazione delle soluzioni
<ol><li>Preparare 500 mL di Washing Buffer A (WBA): soluzione HEPES da 10 mM nella soluzione di sale equilibrato di Hank (HBSS). Conservare a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare 500 mL di Washing Buffer B (WBB): 0.1% Bovine Serum Albumin (BSA) con soluzione HEPES da 10 mM in HBSS. Conservare a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare 300 mL di 30% di dextran soluzione in WBA mescolando la soluzione durante la notte a temperatura ambiente. Autoclave la soluzione a 110 gradi centigradi per 30 min prima dell'uso. Dopo l'autoclaving, lasciare riposare la soluzione a temperatura ambiente per 2-3 h. Conservare la soluzione a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare 100 mL di 0,1% soluzione BSA in soluzione di dextran freddo. Agitare vigorosamente per 3-4 min e conservare a 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Preparare i supporti di coltura DMEM (Modified Eagle Medium) di Dulbecco mediante la dissoluzione del 20% del siero di vitello, la glutammina da 2 mM, la minerazione di 50 g/mL di gentilcina, l'1% di vitamine, il 2% di aminoacidi Basal Medium Eagle (BME) su supporti Basal DMEM e conservarli a 4 gradi centigradi. Aggiungere 1 ng/mL Fattore di crescita fibroblasto di base (bFGF) prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare i media periciti completi con l'aggiunta di integratori periciti di crescita (forniti con i media pericyti) e 20% Siero di vitello fetale (FCS) in media basali pericyte cultura e memorizzare a 4 gradi centigradi.</li>
</ol>2. Recupero del tessuto cerebrale e rimozione delle meningi
<ol><li>Per coerenza, utilizzare topi di età simile e lo stesso sesso in ogni lotto di estrazione. Utilizzare un rifugio per animali privo di agenti patogeni e fornire l'accesso al libitum all'acqua. Per garantire l'efficienza e l'uso minimo degli animali, evitare la perdita di materiale tissutale.</li>
	<li>Eutanasia C57BL/6J, 4-6 settimane, topi maschi (laboratori Janvier, Le Genest-Saint-Isle, Francia).</li>
	<li>Ascipite rapidamente il tessuto cerebrale in condizioni sterili, evitare qualsiasi danno al tessuto. Posizionare con cura il tessuto in 40 mL di salina tamponata da fosfato freddo (PBS).</li>
	<li>Trasferire il tessuto cerebrale in PBS freddo in una parabola Petri (100 mm x 15 mm).</li>
	<li>Posizionare il tessuto cerebrale su una salvietta sterile asciutta e con pinze di punta curve, rimuovere il cervelletto, lo striato e i nervi occipitali.<ol>
<li>Rimuovere tutte le meningi visibili con un tampone di cotone. Posizionare il tessuto cerebrale a testa in giù e aprire i lobi con un tampone di cotone con colpi di luce verso l'esterno. Rimuovere tutti i vasi sanguigni visibili.</li>
		<li>Mettere il tessuto cerebrale libero dalle meningi in una tela Petri (100 mm x 15 mm) con 15 mL di WBB freddo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Omogeneizzazione
<ol><li>Trasferire il tessuto in un tubo di mortaio dounce tissue grinder e aggiungere 3-4 mL di WBB con pinze.</li>
	<li>Mitare il tessuto con un pestello 'sciolto' 55 volte. Sciacquare il pestello 'sciolto' con WBB. Ora tritare il liquame con un pestello "stretto" 25 volte.</li>
	<li>Dividere equamente i liquami in due tubi da 50 mL e aggiungere 1,5 volte di volume freddo 30% BSA-dextran, scuotendo vigorosamente i tubi per mescolare i liquami.</li>
</ol>4. Isolamento della frazione vascolare
<ol><li>Dopo aver agitato vigorosamente i tubi, centrifugare i tubi per 25 min a 3.000 x g e 4 gradi centigradi.</li>
	<li>Trasferire il supernatante (insieme allo strato di mielina superiore) a 2 nuovi tubi, e centrifugare i tubi per 25 min a 3.000 x g e 4 gradi centigradi. Conservare i pellet dalla prima centrifugazione aggiungendo 3 mL di WBB freddo (mantenere il pellet a 4 gradi centigradi).</li>
	<li>Ripetere il passaggio 4.2 e conservare con cura i pellet da 2 ndfugation.</li>
	<li>Scartare il dextran e la mielina con i detriti tissutali dai tubi dal punto 4.3. Conservare i pellet a freddo WBB.</li>
	<li>Raggruppare il contenuto del tubo 1 e del tubo 2 dal passo 4.1 e fino al volume finale di 10 mL con WBB freddo.</li>
	<li>Ripetere questo passaggio per i tubi dei tubi dei gradini 4.2 e 4.3. NOTA: Infine, ci sono 3 tubi da 3 centrifughe.</li>
	<li>Dissociare il pellet con 6 colpi su e giù utilizzando una pipetta da 10 mL, fino a quando non rimangono grumi visibili dei pellet.</li>
	<li>Con l'aiuto di un gruppo di filtri a vuoto e il filtro mesh in nylon, filtrare le sospensioni delle celle di ogni tubo. NOTA: Questa fase di filtrazione è importante per rimuovere i recipienti più lunghi/più grandi tramite il filtro mesh.</li>
	<li>Recuperare e risospendere i capillari raschiando il filtro con l'aiuto di una punta piatta pinze o un raschietto in WBB a temperatura ambiente. Filtra la sospensione con un filtro fresco per recuperare altri capillari</li>
	<li>Dividere il filtrato equamente in due tubi e centrifugare per 7 min a 1.000 x g e RT. NOTA: durante questa fase di centrifugazione, preparare la soluzione ezimatica. Determinare il volume di WBB richiesto in base al numero di animali utilizzati (cfr. Tabella dei materiali). Aggiungere 1x di DNase 1 e 1x di Tosyl-L-lysyl-chlorometanon di ccloruro (TLCK) (vedi Tabella dei materiali)in WBB e preriscaldare fino a 37 gradi centigradi.</li>
	<li>Raccogliere i pellet dalla fase 4.10 in un tubo con WBB preriscaldato con enzimi. Aggiungere il preriscaldamento 1x collagenae/dispase. Collocare il tubo nel bagno d'acqua acquosa tavolo a 37 gradi centigradi per esattamente 33 min.</li>
	<li>Fermare la reazione enzimatica aggiungendo 30 mL di WBB freddo. Centrifugare la sospensione per 7 min a 1.000 x g e RT.</li>
	<li>Scartare il supernatante con attenzione e dissociare il pellet in WBB con 6 colpi su e giù utilizzando una pipetta da 10 mL. Questo passo dovrebbe essere meno rigoroso e relativamente più veloce.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione per 7 min a 1.000 x g e RT. NOTA: Durante questa fase, scartare il rivestimento dai piatti di coltura e risciacquarli una volta con DMEM a temperatura ambiente. Piatti di coltura cellulare coat per almeno 1 h a RT.</li>
	<li>Scartare il supernatante dal tubo ottenuto al punto 4.14, e dissociare il pellet in un nuovo supporto DMEM completo, piastrare le cellule (Giorno 0, P0) in 9 pozzetti di 6 piastre (1 pozzetto di 9,6 cm2 ciascuno).</li>
</ol>5. Proliferazione di periciti cerebrali
<ol><li>Mantenere le colture cellulari a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 in un'incubatrice sterile. Sostituire i mezzi di coltura dopo 24 h (giorno 1) di placcatura delle cellule rimuovendo con attenzione i detriti. Dopo il primo giorno, cambiare i media di coltura ogni 48 h.</li>
	<li>Osservare la coltura cellulare per almeno 7-8 giorni. A questo punto, le crescite cellulari sulla cima di unilayer endoteliale dovrebbero essere osservabili.</li>
	<li>Passaggio delle cellule il giorno 8-10 (a seconda della confluenza) in proimcoltura pericita medio al passaggio 1 (P1) su piastre di coltura rivestite di gelatina. Cambia i media della cultura ogni 2 giorni. Osservare le cellule per 6-7 giorni. Le cellule sono divise consecutivamente di nuovo al passaggio 2 (P2) il giorno 17 [e il passaggio 3 (P3) il giorno 24 solo se necessario], coltivato in mezzo pericito in piastre rivestite di gelatina. NOTA: Le cellule devono essere pronte per esperimenti/osservazioni a quasi l'80-90% di confluenza.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Azevedo, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+modulate+myelination+in+the+central+nervous+system.">Pericytes modulate myelination in the central nervous system.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).</li><li>Hall, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+pericytes+regulate+cerebral+blood+flow+in+health+and+disease.">Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li><li>Gianni-Barrera, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDGF-BB+regulates+splitting+angiogenesis+in+skeletal+muscle+by+limiting+VEGF-induced+endothelial+proliferation.">PDGF-BB regulates splitting angiogenesis in skeletal muscle by limiting VEGF-induced endothelial proliferation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 883-900 (2018).</li><li>Teichert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte-expressed+Tie2+controls+angiogenesis+and+vessel+maturation.">Pericyte-expressed Tie2 controls angiogenesis and vessel maturation.</a> Nature Communications. 8, 16106 (2017).</li><li>Dave, J. 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V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD146+coordinates+brain+endothelial+cell-pericyte+communication+for+blood-brain+barrier+development.">CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).</li><li>Thomsen, M. 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E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+isolation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+mouse+brain+microregions.">FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions.</a> Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).</li><li>Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2+proteoglycan+is+expressed+exclusively+by+mural+cells+during+vascular+morphogenesis.">NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis.</a> Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).</li><li>Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2+Proteoglycan-Dependent+Contributions+of+Pericytes+and+Macrophages+to+Brain+Tumor+Vascularization+and+Progression.">NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression.</a> Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).</li><li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier.">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I periciti cerebrali sono parte integrante della NVU e svolgono un ruolo attivo nell'induzione e nella manutenzione del BBB24. Allo stesso modo, il ruolo di queste cellule nei diversi disturbi neurodegenerativi e patologie vascolari è intrigante. Di conseguenza, un efficiente modello di cellule pericite primarie ad alta uscita fornirà una piattaforma efficiente per gli studi in vitro.
Ci sono vari protocolli che sono stati proposti per l'isolamento dei periciti primari (Figura 4). Tigges et al.17 suggerito un metodo tra cui tessuto corticale con meningi. Questo approccio è la gara di gara del tessuto da 6 topi (una digestione di 37 , 70 min con enzimi papain/DNase) seguita da una fase di disintegrazione tramite 21 G e 18 G di aghi. Questo protocollo suggerisce una separazione in un solo passaggio (centrifugazione nella soluzione 22% BSA/PBS) che produce almeno 2 pozzi rivestiti di collagene I di una piastra a 6 pozzetti. Le cellule sono mantenute nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali (ECGM) fino al passaggio 3 e successivamente nel mezzo di crescita pericito (PGM) per passare le cellule per promuovere la proliferazione dei periciti. In un altro approccio simile, Chen et al.18 ha proposto la dissociazione dei tessuti dividendo il tessuto con una lama di rasoio sterilizzata e la digestione dei tessuti con collagenase/DNase per 90 min a 37 . Dopo la separazione in un solo passaggio (centrifugazione nel 22% BSA) delle cellule, lo strato di mielina viene rimosso e il pellet viene lavato due volte in ECGM. I microvasi sono placcati in 3 pozze di collagene Ho rivestito 6 piatti. Dopo aver raggiunto la confluenza, le cellule vengono passaggiate due volte e più tardi mantenute in PGM. Alla fine, se le cellule vengono passate in rapporto di 3, possiamo ottenere 27 pozze di 6 pozze solo all'uso di 10 topi all'inizio del protocollo.
In Thomsen et al., gli autori suggeriscono l'isolamento dei periciti cerebrali attraverso una digestione enzimatica in due fasi19. Le meningi e la materia bianca vengono rimosse e i campioni cerebrali vengono tagliati in piccoli pezzi. I pezzi di tessuto subiscono la prima reazione enzimatica nel collagenae/DNase I per 75 min a 37 gradi centigradi, dopo un passo di separazione nel 20% di BSA. Il pellet viene raccolto e ulteriormente digerito in collagenae/dispase/DNase I per 50 min a 37 gradi centigradi. Questo passaggio è seguito dalla separazione dei microrecipient in un gradiente Percoll del 33% e ulteriormente lavato una volta. I microvasi sono semisudati su collagene IV/fibronectin a 35 mm piatti. La proliferazione dei periciti è favorita dal 10% di FCS e solfato gentamicin in DMEM per 10 giorni. In un altro approccio di digestione enzimatica in due fasi, Yamazaki e altri suggeriscono la maciazione del tessuto eccitato nel freddo DMEM20. Nella prima reazione enzimatica, i campioni vengono trattati con collagenae/DNase I per 75 min a 37 . Dopo un passo centrifugazione, il pellet viene nuovamente lavato una volta e una seconda reazione enzimatica viene avviata in collagenana / dispase per 60 min a 37 gradi centigradi. A seguito di una separazione in un solo passaggio, il pellet viene risospeso e centrifugato in una soluzione BSA del 22%. Infine, il pellet microvascolare viene risospeso e placcato in una piastra a 6 pozzetti. Per 5 cervelli di topo, 1 pozzetto di una piastra 6-bene può essere placcato. Per ottenere i periciti, le colture endoteliali vengono passate tre volte mentre sono mantenute nel mezzo II delle cellule endoteliali cerebrali dei topi (mBEC). Crouch e Doetsch20 suggeriscono il metodo di purificazione dei pericyti da parte del FACS. I campioni di tessuti della corteccia e della zona ventricolare-subventricolare del cervello del topo sono micro-sezionati e macinati accuratamente con un bisturi. Dopo l'incubazione dell'enzima collagenae/dispasi per 30 min a 37 , il tessuto digerito viene separato dalla mielina e dai detriti centrifugati in una soluzione 22% v/v Percoll. La sospensione cellulare viene poi incubata in anticorpi coniugati a fluorescente per l'analisi e lo smistamento della FACS. Le cellule ordinate sono placcate in pozzi rivestiti di collagene di 24 pozzetto. Si suggerisce che una corteccia produca abbastanza cellule per una placcatura in 1 pozzetto di 24 pozzetti.
Anche se produttivi, questi metodi sono dotati di diverse limitazioni, dall'utilizzo di un elevato numero di animali per l'isolamento di un singolo lotto a una quantità molto limitata di output.
Durante lo sviluppo di questo protocollo proposto, siamo riusciti a ottenere un'elevata produzione: 9 pozzi di una piastra 6-well da un solo 10 topi. A tal fine, la rimozione delle meningi assicura la rimozione di un passo di grandi vasi dal tessuto. La smerigliatrice di tessuto Dounce è più appropriata per i tessuti molli come il cervello. Garantisce inoltre la riduzione del campione con il pestello sciolto, l'omogeneizzazione con il pestello stretto e previene danni cellulari inutili. Uno dei principali obiettivi nei protocolli di coltura cellulare primaria è lo spreco minimo di tessuto e il recupero esteso della vascolatura cerebrale. Nel protocollo presentato, questo si ottiene con la centrifugazione ripetitiva del tessuto infuso dextran-BSA omogeneizzato. Un approccio di centrifugazione in tre fasi aiuta a recuperare grandi quantità di vascolarizzazione dall'omogenea tissutale. Questo fornisce un recupero 3 volte migliorato di micronavi. Dopo la separazione, la filtrazione è il passo essenziale successivo, che favorisce l'esclusione delle cellule muscolari lisce associate a grandi vasi. Come accennato prima è stata proposta una combinazione di diversi enzimi per la digestione enzimatica. Mentre DNase e collagenase/dispase vengono utilizzati per ridurre i grumi di cellule e isolare le singole cellule rispettivamente, è molto importante prevenire la morte cellulare in un ambiente così invasivo e questo è impedito dal TLCK, che aumenta quindi la resa finale. Inizialmente, il primo passaggio è permesso di far crescere un monostrato endoteliale, che in seguito supporta la crescita di periciti attaccati sull'unistrato. Poiché la sopravvivenza delle cellule endoteliali primarie si riduce al passaggio, aumenta la probabilità di recupero del pericito. Inoltre, questo protocollo utilizza un altro passaggio che assicura la prevenzione della contaminazione delle cellule endoteliali. Va notato che con un maggior numero di cellule da P2, la dipendenza da ulteriori passaggi delle cellule è ridotta. Inoltre, riduce la possibilità di crescita pericita essere superato da cellule muscolari lisce, che proliferano su un tasso molto più alto.
Al fine di ottenere una maggiore uscita, ci sono diversi passaggi che sono critici e devono essere eseguiti con precisione per quanto riguarda la temperatura e il tempo. La miscelazione di tessuto omogeneo in BSA-dextran dovrebbe essere veloce. La dissociazione del pellet dopo le fasi di centrifugazione dovrebbe essere rapida per prevenire la morte delle cellule. Inoltre, 33 min di digestione ezimatica dovrebbe essere fatto con precisione e cura. Una delle limitazioni per questo protocollo è la durata di 7-8 giorni che unilayer endoteliale è permesso di crescere e facilitare ulteriormente la crescita dei periciti. Evidentemente, l'isolamento dei microvessels è btter, la crescita di unilayer è più veloce, e quindi ci sono un aumento del numero di periciti. Si raccomanda di non utilizzare meno di 10 topi in ogni estrazione per garantire un numero adeguato di frazioni microvascolari per sostenere ulteriormente la crescita dei periciti. Se i punti di cui sopra sono seguiti con attenzione, la densità cellulare desiderata per la coltura di pericyti cerebrale può essere facilmente raggiunta.
I modelli in vitro forniscono una piattaforma fattibile per lo sviluppo di modelli derivati per ottenere maggiori informazioni sulla rilevanza patofisiologica e la comunicazione tra le altre cellule della NVU durante i disturbi neurologici. I periciti isolati possono essere incorporati in una coltura bicellulare (con cellule endoteliali o gliali) e nella coltura tricellulare (cellule endoteliali e gliali). Lo sviluppo di questi modelli non è stato discusso in questa sede. Per concludere, questo protocollo fornisce un approccio per l'isolamento delle cellule primarie con una maggiore produzione e una migliore piattaforma per la ricerca in vitro relativa alla biologia dei periciti cerebrali.

I periciti cerebrali sono una componente essenziale dell'unità neurovascolare (NVU), che comprende un'unità funzionale con le cellule endoteliali cerebrali della barriera epatica (BBB), le cellule gliali, la matrice extracellulare e i neuroni. I periciti sono una parte vitale nel funzionamento regolato del sistema nervoso centrale (SNC) in quanto servono come una delle interfacce per lo scambio di informazioni molecolari e cellulari.
I periciti cerebrali sono incorporati nel lato abluminale dei microvasi cerebrali e sono essenziali per stabilire1 e mantenere2 la fisiologia BBB. Diversi lavori recenti hanno anche evidenziato il ruolo dei periciti cerebrali nell'angiogenesi3 e nella maturazione della nave4, morfogenesi endoteliale5 e sopravvivenza6, e nel controllo del metabolismo del colesterolo cerebrale7. È importante sottolineare che la disregolazione in uno di questi processi sono caratteristiche etiologiche di malattie neurodegenerative.
Infatti, i periciti sono una necessità funzionale per il normale funzionamento delle BBB e la sua protezione contro la progressione di diverse malattie neurologiche. La fisiologia degenerante e la perdita di periciti sono comuni denominatori nella progressione del morbo di Alzheimer8, perdita neuronale durante la disfunzione della materia bianca9, sclerosi multipla10, encefalopatia settica11, ictus ischemico acuto di fase12 e in altri disturbi neurologici. I periciti sono anche strumentali nella metastasi tumorale13. È interessante notare che, periciti hanno anche dimostrato di esibire un ruolo di salvataggio dopo traumi neurologici e disturbi: nella rimielinazione nel cervello1, ictus ischemico, lesione del midollo spinale14 e promuovere l'angiogenesi15. La suscettibilità dei periciti a rafforzare la manifestazione patofisiologica di traumi e disturbi neurologici li rende un potenziale bersaglio terapeutico16.
I modelli di ricerca in vitro dei periciti nella BBB sono strumenti importanti per condurre studi approfonditi. Questi modelli forniscono una piattaforma per studi più elaborati rappresentando modelli di lavoro della BBB e altro ancora. Per esempio, questi modelli possono essere utilizzati per comprendere la fisiologia cellulare all'interno dei periciti e tra gli altri tipi di cellule della NVU. Inoltre, i modelli in vitro sono strumenti di indagine di prima mano per testare l'influenza farmacologica di nuovi farmaci e molecole sui periciti. Questi modelli possono essere utilizzati anche per comprendere il ruolo patofisiologico dei periciti in relazione ai disturbi neurologici. Tuttavia, lo sviluppo di modelli in vitro richiede una maggiore produzione per consentire la libertà sperimentale. Questi modelli dovrebbero essere facili e veloci e ridurre il numero di animali sperimentali utilizzati. Inoltre, è auspicabile la capacità di sviluppare tali modelli in modelli di coltura a doppia e tripla cella.
Ci sono molti protocolli che sono stati sviluppati. I protocolli proposti da Tigges et al.17, Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20e Crouch e Doetsch21 sono approcci lodevoli che soddisfano la maggior parte delle necessità. Tutti questi metodi producono risultati efficaci, ma la dipendenza da un gran numero di animali sperimentali rimane un denominatore comune per questi protocolli. Pertanto, diventa obbligatorio sviluppare un metodo ad alta uscita in grado di isolare e purificare i periciti con la massima efficienza possibile. In questo protocollo, la purezza delle cellule ottenute dopo un secondo passaggio viene verificata con diversi marcatori periciti. Abbiamo controllato per Platelet-Derived Growth Factor Receptor-z (PDGFR- , che viene utilizzato come marcatore classico di periciti17, e per NG2 (antigene neurone-gliale 2), che è un marcatore di morfogenesi vascolare mediata pericita22 e vascolarizzazione23. Abbiamo anche controllato il cluster di differenziazione 146 (CD 146), che è stato segnalato come una delle molecole espresse nei periciti17,18.
Qui, presentiamo un protocollo per l'estrazione di periciti primari da topi (tipo selvaggio o transgenica) che soddisferà tutti i requisiti di cui sopra con alta potenza. Impieghiamo un metodo di proliferazione basato sulla selezione libera di antibiotici e immunopanning per i periciti cerebrali primari, che si dimostrerà un modello efficiente per condurre studi in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino acids BME</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6766</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal DMEM media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>316000083</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-0291</td>
			<td>Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-8412</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase dispase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 &#956;m syringe filter and store at -20 &#176;C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 &#181;L of 10x collagenase dispase is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-2500</td>
			<td>Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 &#176;C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A-2712</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I.00289</td>
			<td>Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-8264</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-0887</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biocoat</td>
			<td>354230</td>
			<td>Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 &#181;g/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyte Medium-mouse</td>
			<td>Sciencell research laboratories</td>
			<td>1231</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-7254</td>
			<td>Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamins</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6891</td>
			<td>Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment Requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration tools</td>
			<td>Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td>Swing bucket rotor centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath with agitator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood : BSL2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware (all components to be heat sterilized)</td>
			<td>Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized)</td>
			<td>Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high output method to isolate cerebral pericytes from mouse

Negli ultimi anni, i periciti cerebrali sono diventati il centro di un'ampia ricerca in biologia vascolare e patologia. L'importanza dei periciti nella formazione e nella fisiologia delle barriere cerebrali ematologiche è ora dimostrata, ma la sua base molecolare rimane in gran parte sconosciuta. Poiché il ruolo patofisiologico dei periciti cerebrali nei disturbi neurologici è intrigante e di grande importanza, i modelli in vitro non solo sono sufficientemente appropriati, ma anche in grado di incorporare tecniche diverse per questi studi. Diversi metodi sono stati proposti come modelli in vitro per l'estrazione di periciti cerebrali, anche se è auspicabile un protocollo privo di antibiotici con un'elevata produzione. Ancora più importante, un metodo che ha aumentato la produzione per estrazione riduce l'utilizzo di più animali.
Qui, proponiamo un metodo semplice ed efficiente per estrarre periciti cerebrali con una produzione sufficientemente elevata. L'omogeneizzazione del tessuto cerebrale del topo viene mescolato con una soluzione BSA-dextran per la separazione dei detriti tissutali e del pellet microvascolare. Proponiamo una separazione in tre fasi seguita dalla filtrazione per ottenere un filtrato ricco di microvessel. Con questo metodo, la quantità di frammenti microvascolari ottenuti da 10 topi è sufficiente per il seme 9 pozzi (9,6 cm2 ciascuno) di una piastra a 6 pozzetti. La cosa più interessante con questo protocollo, l'utente può ottenere 27 pozzi ricchi di pericyte (9,6 cm2 ciascuno) nel passaggio 2. La purezza delle culture periciti si conferma con l'espressione dei marcatori classici dei periciti: NG2, PDGFR- e CD146. Questo metodo dimostra uno strumento in vitro efficiente e fattibile per studi fisiologici e patofisiologici sui periciti.

Questo protocollo (Figura 1) produce in modo efficiente 9 pozzetti (di piastre a 6 pozzetti) al momento della seeding a P0(Figura 2A (P0: Giorno 1)).
Da P0 a P2, ci sono specifiche caratteristiche morfologiche con cui si possono osservare le cellule endoteliali (indicate da frecce bianche) e s aumento graduale dei periciti (indicato da frecce nere). In P0, le cellule endoteliali allungate che si sviluppano da microvessels sono in abbondanza (Figura 2A, P0: Giorno 3), mentre l'abbondanza di tali cellule allungate è ridotta in P1 e assente in P2. Al contrario, i periciti appaiono come cellule quadrilatere che sono abbondanti in P2(Figura 2A, P2: Giorno 18).
Per confermare la purezza della cultura dei pericyti in P2, abbiamo controllato l'espressione di NG2, CD146 e PDGFR-beta come marcatori periciti utilizzando la PCR quantitativa (Figura 2B), l'immunocitochimica (Figura 2C) e la macchia occidentale ( Figura3). I periciti in P2 esprimono livelli più elevati di CD146, NG2 e PDGFR-rispetto all'espressione nell'estratto totale del cervello di topo (Ms Br). Come controllo, espressione dei marcatori endoteliali Occludin e CD31, sono stati osservati assenti anche marcatori di astrociti Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) e microglia CD11b in P2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig01.jpg"> Figura 1: Riepilogo del protocollo. Questo schema rappresenta i passaggi critici per l'estrazione dei periciti che inizia con la disintegrazione dei tessuti con smerigliatrice velina seguita da una separazione in 3 fasi in dextran e filtrazione. Questo protocollo impiega un passo di digestione enzimatico di 33 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig1alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig2a.jpg"> Figura 2: morfologia delle cellule ed espressione dei marcatori. (A) Immagini a contrasto di fase dei periciti nelle fasi p, P1 e P2 di proliferazione. Le abbondanti cellule endoteliali in P0 sono indicate da frecce bianche. Il loro numero è diminuito in P1 e sono scomparsi in P2. I periciti sono indicati da frecce nere. (B) Analisi dell'espressione CD146, NG2 e PDGFR- di PCR in periciti in P2 con periciti in campioni di P1 e cervello di topo (Ms Br). (C) Immagini rappresentative dei periciti in P2 che mostrano un'immunostaining positiva di CD146, PDGFR- e NG2. Barra della scala: 50 m (20 volte l'ingrandimento) e 20 m (ingrandimento 40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig2alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig03.jpg"> Figura 3: Purezza rappresentativa delle colture cellulari. L'analisi dell'espressione di CD146, PDGFR-z, NG2, Occludin, GFAP, CD31, CD11b e Tubulin mediante oscillazione occidentale nei periciti nei campioni di P2 e cervello di topo (Ms Br). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig3alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig4a.jpg"> Figura 4: Confronto rappresentativo dei diversi metodi di disintegrazione, purificazione, arricchimento e digestione enzimatica. Ogni protocollo pubblicato è riassunto con indicazioni sul numero di animali utilizzati per ciascun protocollo. Le uscite sono indicate anche per quanto riguarda il numero di pozzi ottenuti al momento della seeding. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig4alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

Vi presentiamo un protocollo per l'estrazione di murini periciti cerebrali. Basato su un'estrazione pericito orientata all'arricchimento senza antibiotici, questo protocollo è uno strumento prezioso per gli studi in vitro che forniscono un'elevata purezza e un'alta resa, diminuendo così il numero di animali sperimentali utilizzati.

Un metodo ad alta uscita per isolare i periciti cerebrali dal mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Recentemente, il ruolo dei periciti cerebrali è diventato evidente nei disturbi neurologici e nella funzione cerebrale. Pertanto, lo sviluppo di un metodo di coltura affidabile per queste cellule è imperativo. Il nostro protocollo per l'estrazione di periciti cerebrali murini rappresenta uno strumento affidabile per gli studi in vitro e per fornire ai periciti un'elevata purezza e resa cellulare.A dimostrare la procedura con Anupriya Mehra sarà Lucie Dehouck, una tecnico del mio laboratorio. Inizia posizionando il cervello da uno specifico topo C57BL/6 maschio privo di agenti patogeni da quattro a sei settimane su una pulitura sterile e priva di pelucchi asciutti e usando forcep di punta curva per rimuovere il cervelletto, lo striato e i nervi occipitali. Usa un batuffolo di cotone per rimuovere tutte le meningi visibili e capovolgere il tessuto cerebrale.Aprire i lobi con leggeri tratti verso l'esterno e rimuovere tutti i vasi sanguigni visibili. Quindi posizionare il tessuto cerebrale privo di meningi in una piastra di Petri di 100 millimetri contenente 15 millilitri di tampone di lavaggio freddo B.To omogeneizzare il tessuto, trasferire il campione cerebrale in un tubo di malta della smerigliatrice di tessuto Dounce e aggiungere tre o quattro millilitri di tampone di lavaggio B al tubo. Utilizzare un pestello sciolto per tritare il tessuto 55 volte, quindi sciacquare il pestello con tampone di lavaggio B e tritare il liquame tissutale con un pestello stretto 25 volte.Al termine dell'omogeneizzazione, aliquotare allo stesso modo il liquame tra due tubi da 50 millilitri e aggiungere 1,5 volte il volume di albumina di siero bovino freddo al 30%. Quindi scuotere vigorosamente i tubi per mescolare il liquame. Per isolare la frazione vascolare, sedimentare le cellule mediante centrifugazione e trasferire i supernatanti in due nuovi tubi.Conservare il pellet nel tampone di lavaggio B sul ghiaccio. Resuspend i pellet in tre millilitri di tampone di lavaggio freddo B sul ghiaccio. Centrifuga i supernatanti raccolti e ripeti questo passo ancora una volta.Scartare i supernaganti e rimescolare i pellet in tre millilitri di tampone di lavaggio B.Quindi mettere in comune i pellet rimescolati e portare il volume finale della sospensione della cella raggruppata a 10 millilitri con tampone di lavaggio fresco a freddo B.Dissociare ulteriormente le celle con una pipetta di 10 millimetri sei volte fino a quando non sono visibili ciuffi rimanenti di pellet e utilizzare un gruppo filtro sottovuoto e un colino in rete di nylon per filtrare la sospensione cellulare. Posizionare il colino in una piastra di Petri e sgombare la rete con tampone di lavaggio fresco B e raschiare per recuperare eventuali capillari. Quindi eseguire una seconda filtrazione con un filtro fresco.Dividere il filtrato equamente tra due tubi e raccogliere le cellule per centrifugazione. Dopo aver scartato i supernatanti, mettere in comune i pellet in un unico tubo contenente tampone di lavaggio prebellimato B con enzimi e aggiungere collagenasi/dispasi prebellita al tubo. Posizionare il tubo in un bagno d'acqua del tavolo tremante per 33 minuti precisamente a 37 gradi Celsius prima di interrompere la reazione con 30 millilitri di tampone di lavaggio freddo B.Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e scartare con cura il supernatante.Resostigliere rapidamente ma con cura il pellet nel tampone di lavaggio B sei volte e centrifugare nuovamente la sospensione. Dopo aver scartato il supernatante, resuspend il pellet in 18 millilitri di mezzo DMEM completo e semina due millilitri di sospensione cellulare in DMEM completo in nove pozzi di tre piastre a sei pozzi rivestite di Matrigel. Posizionare le colture cellulari in un incubatore sterile di anidride carbonica di 37 gradi Celsius 5% per 24 ore prima di rimuovere accuratamente i detriti da ogni pozzo e aggiungere nuovi supporti DMEM.Dopo 48 ore, cambiare il mezzo in ogni pozzo ogni 48 ore. Il giorno da otto a 10 quando le cellule raggiungono la confluenza del 100%, passaggiamo le cellule in mezzo di coltura pericita su nuove piastre di gelatina rivestite con sei pozzi e restituiranno le cellule all'incubatore di coltura cellulare per altri sei-sette giorni con monitoraggio. Quindi dividere di nuovo le cellule il giorno 17 in mezzo pericito in nuove piastre rivestite di gelatina.Dal passaggio zero al passaggio due, ci sono specifiche caratteristiche morfologiche con cui si possono identificare le cellule endoteliali e il conseguente graduale aumento dei periciti. In una coltura di passaggio zero, le cellule endoteliali allungate che si sviluppano da microvessel sono in abbondanza. Questa abbondanza si riduce dopo il passaggio uno e assente dopo il passaggio due.Al contrario, i periciti appaiono come rare cellule quadrilatere nelle prime culture e diventano abbondanti con il passaggio due. La valutazione dell'espressione di NG2, CD146 e PDGFR beta può essere utilizzata per valutare la purezza della coltura di periciti mediante PCR quantitativa, immunocitochimica e macchia occidentale. La digestione enzimatica è un passo fondamentale per il successo del protocollo.Assicurati di monitorare rigorosamente le concentrazioni enzimatiche e il tempo di incubazione.

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