Name: a high output method to isolate cerebral pericytes from mouse
Uploaded: 2020-01-14T15:00:00
Duration: 6 min 49 s
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A LT e a FG foram concedidas pela Agence Nationale de la Recherche (ANR, ANR-15-JPWG-0010) no âmbito do Programa Conjunto da UE – Pesquisa de Doenças Neurodegenerativas (JPND) para o projeto SNOWBALL.

Todos os experimentos foram realizados seguindo as diretrizes do Instituto para o uso e manuseio de animais. De acordo com a legislação francesa, a instalação animal da Universidade de Artois foi aprovada pelas autoridades locais (referência: B62-498-5). Em conformidade com a Legislação da União Europeia (Diretiva 2010/63/UE), todos os procedimentos foram aprovados pelo comité local de cuidados com os animais e utilização (comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Nord-Pas-De-Calais, referência: C2EA 75) e pelo Ministério francês da Investigação (referência: 2015090115412152).
1. Preparação de soluções
<ol><li>Prepare 500 mL de lavagem tampão A (WBA): 10 mM hepes solução em Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Guarde a 4°C.</li>
	<li>Prepare 500 mL de Lavagem Tampão B (WBB): 0,1% De Soro Bovi Albumin (BSA) com solução HEPES de 10 mM em HBSS. Guarde a 4°C.</li>
	<li>Prepare 300 mL de 30% solução dextran em WBA, misturando a solução durante a noite à temperatura ambiente. Autoclave a solução em 110 °C para 30 min antes do uso. Após a autoclilação, deixe a solução descansar à temperatura ambiente por 2-3 h. Armazenar a solução em 4 °C.</li>
	<li>Prepare 100 mL de 0,1% solução BSA em solução dextran frio. Agite vigorosamente por 3-4 min e guarde a 4 °C.</li>
	<li>Prepare a mídia de cultura modificada de musbe de águia (DMEM) da Dulbecco dissolvendo 20% de soro de vitela, 2 mM glutamina, 50 μg/mL gentamicina, 1% vitaminas, 2% aminoácidos Basal Medium Eagle (BME) na mídia Basal DMEM e loja a 4 °C. Adicionar 1 ng/mL Fator de crescimento básico do fibroblasto (bFGF) antes do uso.</li>
	<li>Prepare a mídia pericética completa adicionando suplementos de crescimento pericético (fornecidos com a mídia pericética) e 20% de Soro de Bezerro Fetal (FCS) em pericyte cultura basal mídia e armazenar a 4 °C.</li>
</ol>2. Recuperação do tecido cerebral e remoção de meninges
<ol><li>Para consistência, use camundongos de idade semelhante e mesmo sexo em cada lote de extração. Use um abrigo de animais sem patógeno e forneça acesso a dígáspio à água. Para garantir a eficiência e o uso mínimo de animais, evite a perda de material de tecido.</li>
	<li>Eutanásia C57BL/6J, 4-6 semanas de idade, ratos machos (laboratórios Janvier, Le Genest-Saint-Isle, França).</li>
	<li>Rapidamente extirpar o tecido cerebral em condições estéreis, evitar qualquer dano ao tecido. Coloque cuidadosamente o tecido em 40 mL de soro soro para os soro azul amorteceu fosfato frio (PBS).</li>
	<li>Transfira o tecido cerebral em PBS frio para uma placa de Petri (100 mm x 15 mm).</li>
	<li>Coloque o tecido cerebral em uma limpeza estéril e seca sem fiapos e com fórceps de ponta curva, retire o cerebelo, estriado e nervos occipitais.<ol>
<li>Retire todas as meninges visíveis com um cotonete. Coloque o tecido cerebral de cabeça para baixo e abra os lobos com um cotonete usando traços de luz para fora. Retire todos os vasos sanguíneos visíveis.</li>
		<li>Coloque o tecido cerebral meninges livre em uma placa de Petri (100 mm x 15 mm) com 15 mL de WBB frio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Homogeneização
<ol><li>Transfira o tecido para um tubo de argamassa de moedor de tecido Dounce e adicione 3-4 mL de WBB com fórceps.</li>
	<li>Pique o tecido com um pilão "solto" 55 vezes. Lave o pilão 'solto' com WBB. Agora morder o chorume com um pilão "apertado" 25 vezes.</li>
	<li>Divida a pasta igualmente em dois tubos de 50 mL e adicione 1,5 x volume de frio 30% BSA-dextran, agitando vigorosamente os tubos para misturar a pasta.</li>
</ol>4. Isolamento da fração vascular
<ol><li>Depois de sacudir vigorosamente os tubos, centrífuga s os tubos para 25 min em 3.000 x g e 4 °C.</li>
	<li>Transfira o supernatant (junto com a camada superior do myelin) a 2 tubos novos, e centrífuga os tubos para 25 min em 3.000 x g e 4 °C. Preservar as pelotas da primeira centrífuga, adicionando 3 mL de WBB frio (manter a pelota em 4 °C).</li>
	<li>Repita o passo 4.2 e preserve cuidadosamente as pelotas da2ª centrífugação.</li>
	<li>Descarte o dextran e a mielina com detritos de tecido dos tubos do passo 4.3. Preservar as pelotas no frio WBB.</li>
	<li>Pool o conteúdo do tubo 1 e tubo 2 a partir do passo 4.1 e fazer até o volume final de 10 mL com WBB frio.</li>
	<li>Repita esta etapa para tubos da etapa 4.2 e etapa 4.3. NOTA: Finalmente, há 3 tubos de 3 centrífugas.</li>
	<li>Dissociar a pelota com 6 para cima e para baixo cursos usando uma pipeta de 10 mL, até que nenhum grupo visível das pelotas estão restantes.</li>
	<li>Com a ajuda de um conjunto de filtro de vácuo e do filtro de malha de nylon, filtre as suspensões celulares de cada tubo. NOTA: Esta etapa de filtragem é importante para remover vasos mais longos/maiores através do filtro de malha.</li>
	<li>Recuperar e resuspender os capilares raspando o filtro com a ajuda de um fórceps ponta plana ou um raspador em WBB à temperatura ambiente. Filtrar a suspensão com um filtro fresco para recuperar mais capilares</li>
	<li>Divida a filtragem igualmente em dois tubos e centrífugapor 7 min a 1.000 x g e RT. NOTA: Durante este passo de centrífuga, prepare a solução enzimática. Determinar o volume de WBB necessário de acordo com o número de animais utilizados (ver Tabela de Materiais). Adicione 1x de DNase 1 e 1x de cloridrato de clorometano tosyl-l-lisyl (TLCK) (ver Tabela de Materiais)em WBB e pré-quente a 37 °C.</li>
	<li>Colete as pelotas do passo 4.10 em um tubo com WBB pré-aquecido com enzimas. Adicione pré-aquecido 1x colagem/dispase. Coloque o tubo no banho de água de mesa tremendo a 37 °C por precisamente 33 min.</li>
	<li>Pare a reação enzimática adicionando 30 mL de WBB frio. Centrífuga a suspensão por 7 min a 1.000 x g e RT.</li>
	<li>Descarte o supernatant com cuidado e dissociar a pelota em WBB com 6 para cima e para baixo cursos usando uma pipeta de 10 mL. Este passo deve ser menos rigoroso e comparativamente mais rápido.</li>
	<li>Centrífuga a suspensão por 7 min a 1.000 x g e RT. NOTA: Durante esta etapa, descarte o revestimento dos pratos da cultura e lave-os uma vez com DMEM na temperatura ambiente. Pratos de cultura de células de casaco por pelo menos 1 h na RT.</li>
	<li>Descarte o supernatant do tubo obtido na etapa 4.14, e dissociar a pelota em meios completos novos de DMEM, placa as pilhas (dia 0, P0) em 9 poços de placas de 6 poços (1 poço de 9.6 cm2 cada).</li>
</ol>5. Proliferação de pericitos cerebrais
<ol><li>Mantenha as culturas celulares a 37 °C e 5% DECO 2 em uma incubadora estéril. Substitua os meios da cultura após 24 h (dia 1) de chapeamento das pilhas removendo com cuidado os restos. Após o dia 1, mude a mídia cultural a cada 48 h.</li>
	<li>Observe a cultura celular por pelo menos 7-8 dias. Por esta altura, os crescimentos celulares no topo da unilayer endotelial deve ser observável.</li>
	<li>Passar as células no dia 8-10 (dependendo da confluência) em meio de cultura pericética para a passagem 1 (P1) em placas de cultura revestidas de gelatina. Mude a mídia cultural a cada 2 dias. Observe as células por 6-7 dias. As células são divididas consecutivamente novamente para a passagem 2 (P2) no dia 17 [e passagem 3 (P3) no dia 24 apenas se necessário], cultivadas em meio pericícito em placas revestidas de gelatina. NOTA: As células estarão prontas para experimentos/observação em quase 80-90% de confluência.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Azevedo, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+modulate+myelination+in+the+central+nervous+system.">Pericytes modulate myelination in the central nervous system.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (8), 5523-5529 (2018).</li><li>Hall, C. 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V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+simple+method+for+culturing+pericytes+from+mouse+brain.">A novel and simple method for culturing pericytes from mouse brain.</a> Microvascular Research. 84 (1), 74-80 (2012).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD146+coordinates+brain+endothelial+cell-pericyte+communication+for+blood-brain+barrier+development.">CD146 coordinates brain endothelial cell-pericyte communication for blood-brain barrier development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (36), 7622-7631 (2017).</li><li>Thomsen, M. 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E., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FACS+isolation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+mouse+brain+microregions.">FACS isolation of endothelial cells and pericytes from mouse brain microregions.</a> Nature Protocols. 13 (4), 738-751 (2018).</li><li>Ozerdem, U., Grako, K. A., Dahlin-Huppe, K., Monosov, E., Stallcup, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2+proteoglycan+is+expressed+exclusively+by+mural+cells+during+vascular+morphogenesis.">NG2 proteoglycan is expressed exclusively by mural cells during vascular morphogenesis.</a> Developmental Dynamics. 222 (2), 218-227 (2001).</li><li>Stallcup, W. B., You, W. K., Kucharova, K., Cejudo-Martin, P., Yotsumoto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NG2+Proteoglycan-Dependent+Contributions+of+Pericytes+and+Macrophages+to+Brain+Tumor+Vascularization+and+Progression.">NG2 Proteoglycan-Dependent Contributions of Pericytes and Macrophages to Brain Tumor Vascularization and Progression.</a> Microcirculation. 23 (2), 122-133 (2016).</li><li>Armulik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier.">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Os pericitos cerebrais são parte integrante da NVU e desempenham um papel ativo na indução e manutenção do BBB24. Da mesma forma, o papel dessas células nas diferentes doenças neurodegenerativas e patologias vasculares é intrigante. Assim, um modelo eficiente de células pericytes primárias de alta produção fornecerá uma plataforma eficiente para estudos in vitro.
Existem vários protocolos que foram propostos para o isolamento dos pericitos primários (Figura 4). Tigges et al.17 sugeriram um método que inclui tecido corticano com meninges. Esta abordagem é a tenderização do tecido de 6 camundongos (uma digestão de 37 °C, 70 min com enzimas papaina/DNAse), seguida por um passo de desintegração através de agulhas 21 G e 18 G. Este protocolo sugere uma separação de uma etapa (centrífuga em 22% bsa / pbs solução) que produz pelo menos 2 colágeno eu revestido poços de uma placa de 6 poços. As células são mantidas no meio de crescimento de células endotélias (ECGM) até a passagem 3 e mais tarde no meio de crescimento pericyte (PGM) para células de passagem para promover a proliferação de pericytes. Em uma outra aproximação similar, Chen eoutros18 propuseram a dissociação do tecido cortando o tecido com uma lâmina de lâmina e uma digestão esterilizadas do tecido com colagem/DNase para 90 min em 37 °C. Após a separação em uma etapa (centrífuga em 22% BSA) das células, a camada de mielina é removida e a pelota é lavada duas vezes no ECGM. Os microvasos são banhados em 3 poços de colágeno eu revesti pratos de 6 poços. Depois de atingir a confluência, as células são passagens duas vezes e depois mantidas em PGM. No final, se as células são passadas em proporção de 3, podemos obter 27 poços de placas de 6 poços apenas no uso de 10 camundongos no início do protocolo.
Em Thomsen et al., os autores sugerem isolamento de pericitos cerebrais através de uma digestão enzimática de duas etapas19. Meninges e matéria branca são removidos, e amostras de cérebro são cortadas em pedaços pequenos. As partes do tecido submetem-se à primeira reação da enzima na colagem/DNase I para 75 min em 37 °C, seguindo uma etapa da separação em 20% BSA. A pelota é coletada e digerida ainda mais em colagenase/dispase/DNase I por 50 min a 37 °C. Esta etapa é seguida pela separação do microvessel em um gradiente de Percoll de 33% e lavado mais uma vez. Os microvasos são semeados em pratos de colágeno IV/fibronectina revestidos de 35 mm. A proliferação de pericitos é favorecida por 10% FCS e sulfato de gentamicina no DMEM por 10 dias. Em outra abordagem de digestão de enzimas de duas etapas, Yamazaki et al. sugerem picar o tecido extisizado no Frio DMEM20. Na primeira reação enzimática, as amostras são tratadas com colagem/DNase I por 75 min a 37 °C. Após uma centrifugação de um passo, a pelota é novamente lavada uma vez e uma segunda reação enzimática é iniciada em colagem/dispase por 60 min a 37 °C. Após uma separação de uma etapa, a pelota é resuspensa e centrífuga em 22% de solução BSA. Finalmente, a pelota microvascular é resuspendida e banhada em uma placa de 6 poços. Para 5 cérebros do rato, 1 poço de uma placa de 6 poços pode ser banhado. Para obter os pericites, as culturas endotelimais são passagens três vezes enquanto mantidas em célula endotelial cerebral de camundongo (mBEC) médio II. Crouch e Doetsch20 sugerem método de purificação de pericyte pela FACS. Amostras de tecido do córtex e zona ventricular-subventricular do cérebro do rato são microdissecadas e picadas completamente com um bisturi. Após a incubação de enzimas colagenase/dispase por 30 min a 37 °C, o tecido digerido é separado da mielina e detritos centrífugas em uma solução de 22% v/v Percoll. A suspensão celular é então incubada em anticorpos fluorescentes conjugados para análise e classificação facs. As células classificadas são banhadas em poços revestidos de colágeno de 24 pratos bem. Sugere-se que um córtex produz células suficientes para um revestimento em 1 poço de placa de 24 poços.
Mesmo se produtivo, estes métodos vêm com diversas limitações, do uso do número elevado de animais para a isolação do único grupo a uma quantidade muito limitada de saída.
Durante o desenvolvimento deste protocolo proposto, fomos bem sucedidos na obtenção de alta produção: 9 poços de uma placa de 6 poços de apenas 10 camundongos. Para este fim, a remoção de meninges garante a remoção de um passo de grandes vasos do tecido. O moedor de tecido Dounce é mais apropriado para tecidos moles, como o cérebro. Ele também garante a redução da amostra com o pilão solto, homogeneização com o pilão apertado, e evita danos celulares desnecessários. Um dos principais objetivos nos protocolos de cultura celular primária é o desperdício mínimo de tecido e a recuperação prolongada da vasculatura cerebral. No protocolo apresentado, isso é alcançado por centrífuga repetitiva do tecido dextran-BSA infundido homogeneizar. Uma abordagem de centrifugação de três etapas ajuda a recuperar grandes quantidades de vasculatura do tecido homogeneado. Isto fornece uma recuperação 3x realçada de microvessels. Após a separação, a filtragem é o próximo passo essencial, o que favorece a exclusão de células musculares lisas associadas a grandes vasos. Como mencionado antes de uma combinação de enzimas diferentes foi proposta para a digestão enzimática. Enquanto dnase e colagem/dispase são usados para reduzir aglomerados de células e isolar células únicas, respectivamente, é muito importante prevenir a morte celular em um ambiente tão invasivo e isso é impedido pelo TLCK, o que aumenta assim o rendimento final. Inicialmente, a primeira passagem é permitida crescer um monolayer endothelial, que suporte mais tarde o crescimento de pericites unidos no unilayer. Desde que a sobrevivência de pilhas endoteliis preliminares é reduzida em cima da passagem, realça a probabilidade para a recuperação do pericyte. Além disso, este protocolo emprega outra passaging que garante evitar a contaminação de células endotélias. Note-se que, com um maior número de células de P2, a dependência de uma maior passagem das células é reduzida. Além disso, reduz a possibilidade de crescimento pericito ser ultrapassado por células musculares lisas, que proliferam em taxa muito maior.
A fim de alcançar uma saída mais elevada, existem várias etapas que são críticas e devem ser executadas com precisão no que diz respeito à temperatura e ao tempo. A mistura de tecido homogeneado em BSA-dextran deve ser rápido. A dissociação da pelota após as etapas da centrífuga deve ser rápida impedir a morte da pilha. Além disso, 33 min de digestão enzimática deve ser feito com precisão e cuidado. Uma das limitações para este protocolo é a duração de 7-8 dias que unilayer endotelial é permitido crescer e facilitar mais o crescimento dos pericytes. Evidentemente, o isolamento de micronavios é btter, o crescimento da unilayer é mais rápido, e, portanto, há um aumento do número de pericites. Recomenda-se não usar menos de 10 camundongos em cada extração para garantir um número adequado de frações microvasculares para suportar ainda mais o crescimento do pericito. Se os pontos acima mencionados forem seguidos com cuidado, a densidade celular desejada para a cultura do pericito cerebral pode ser facilmente alcançada.
Os modelos in vitro fornecem uma plataforma viável para o desenvolvimento de modelos derivados para obter mais informações sobre a relevância fisiopatológica e comunicação entre as outras células do NVU durante distúrbios neurológicos. Pericites isolados podem ser incorporados em uma cultura bicelular (com células endotélias ou gliais) e cultura tricelular (células endotélias e gliais) modelos. O desenvolvimento desses modelos não foi discutido aqui. Para concluir, este protocolo fornece uma abordagem para o isolamento das células primárias com maior produção e uma melhor plataforma para pesquisain vitro relacionada à biologia do pericyte cerebral.

Os pericitos cerebrais são um componente essencial da unidade neurovascular (NVU), que compreende uma unidade funcional com as células endotélias cerebrais da barreira hematoencefálica (BBB), células gliais, matriz extracelular e neurônios. Os pericitos são uma parte vital no funcionamento regulado do sistema nervoso central (SNC), pois servem como uma das interfaces para a troca de informações moleculares e celulares.
Os pericitos cerebrais são encaixados no lado abluminal das microvasos cerebrais, e são essenciais para estabelecer1 e manter2 a fisiologia BBB. Vários trabalhos recentes também destacaram o papel dos pericitos cerebrais na angiogênese3 e maturação dos vasos4,morgênese endotelial5 e sobrevivência6,e no controle do metabolismo do colesterol cerebral7. É importante ressaltar que a desregulação em qualquer um desses processos são características etiológicas de doenças neurodegenerativas.
De fato, os pericitos são uma necessidade funcional para o funcionamento normal do BBB e sua proteção contra a progressão de várias doenças neurológicas. Fisiologia degeneração e perda de pericitos são denominadores comuns na progressão da doença de Alzheimer8, perda neuronal durante a disfunção da matéria branca9,esclerose múltipla10, encefalopatia séptica11, acidente vascular cerebral isquêmico fase aguda12 e em outras doenças neurológicas. Pericitos também são fundamentais na metástase tumoral13. Curiosamente, pericites também foram mostrados para exibir um papel de resgate após trauma neurológico e distúrbios: na remielinação no cérebro1, acidente vascular cerebral isquêmico, lesão medular14 e promover a angiogênese15. A suscetibilidade dos pericytes para reforçar a manifestação fisiopatológica de traumas neurológicos e distúrbios torna-os um potencial alvo terapêutico16.
Modelos de pesquisa in vitro de pericites no BBB são ferramentas importantes para realizar extensos estudos. Esses modelos fornecem uma plataforma para estudos mais elaborados, representando modelos de trabalho do BBB e muito mais. Por exemplo, esses modelos podem ser usados para entender a fisiologia celular dentro de pericitos e entre outros tipos de células do NVU. Além disso, os modelos in vitro são ferramentas de investigação em primeira mão para testar a influência farmacológica de novas drogas e moléculas em pericites. Esses modelos também podem ser usados para entender o papel fisiopatológico dos pericytes em relação a distúrbios neurológicos. No entanto, o desenvolvimento de modelos in vitro requer maior produção para permitir a liberdade experimental. Estes modelos devem ser fáceis e rápidos, e reduzir o número de animais experimentais utilizados. Além disso, a capacidade de desenvolver esses modelos em modelos de cultura de células duplas e triplas é desejável.
Há muitos protocolos que foram desenvolvidos. Os protocolos propostos por Tigges et al.17, Chen et al.18, Thomsen et al.19, Yamazaki et al.20, e Crouch e Doetsch21 são abordagens louváveis que satisfazem a maioria das necessidades. Todos esses métodos produzem resultados eficazes, mas a dependência de um grande número de animais experimentais continua a ser um denominador comum para esses protocolos. Portanto, torna-se obrigatório desenvolver um método de alta produção que possa isolar e purificar pericites com a máxima eficiência possível. Neste protocolo, a pureza das células obtidas após uma segunda passagem é verificada com vários marcadores pericantes. Verificamos o Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas Receptor-β (PDGFR- β), que é usado como um marcador clássico de pericites17,e para NG2 (antígeno neuronil-glial 2), que é um marcador de pericyte mediada morgênese vascular22 e vascularização23. Também verificamos o cluster de diferenciação 146 (CD 146), que tem sido relatado como uma das moléculas expressas nos pericitos17,18.
Aqui, apresentamos um protocolo para a extração de pericitos primários de camundongos (tipo selvagem ou transgênicos) que irá satisfazer todos os requisitos acima mencionados com alta produção. Empregamos um método de proliferação livre baseado em antibióticos e imunopanning para os pericitos cerebrais primários, que provará ser um modelo eficiente para a realização de estudos in vitro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino acids BME</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6766</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal DMEM media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>316000083</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic fibroblast growth factor</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F-0291</td>
			<td>Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-8412</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase dispase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 &#956;m syringe filter and store at -20 &#176;C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 &#181;L of 10x collagenase dispase is required.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>31398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G-2500</td>
			<td>Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 &#176;C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin</td>
			<td>Biochrom AG</td>
			<td>A-2712</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>I.00289</td>
			<td>Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-8264</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-0887</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biocoat</td>
			<td>354230</td>
			<td>Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 &#181;g/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyte Medium-mouse</td>
			<td>Sciencell research laboratories</td>
			<td>1231</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-7254</td>
			<td>Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamins</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-6891</td>
			<td>Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment Requirements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration tools</td>
			<td>Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory equipment</td>
			<td>Swing bucket rotor centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath with agitator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood : BSL2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassware (all components to be heat sterilized)</td>
			<td>Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized)</td>
			<td>Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high output method to isolate cerebral pericytes from mouse

Nos últimos anos, os pericitos cerebrais tornaram-se o foco de uma extensa pesquisa em biologia vascular e patologia. A importância dos pericites na formação e fisiologia da barreira hematoencefálica é demonstrada agora mas sua base molecular permanece pela maior parte desconhecida. Como o papel fisiopatológico dos pericitos cerebrais em distúrbios neurológicos é intrigante e de grande importância, os modelos in vitro não são apenas suficientemente apropriados, mas também capazes de incorporar diferentes técnicas para esses estudos. Vários métodos têm sido propostos como modelos in vitro para a extração de pericitos cerebrais, embora um protocolo livre de antibióticos com alta produção seja desejável. Mais importante ainda, um método que aumentou a produção por extração reduz o uso de mais animais.
Aqui, propomos um método simples e eficiente para extrair pericitos cerebrais com produção suficientemente alta. A homogeneação do tecido cerebral do rato é misturada com uma solução BSA-dextran para a separação dos detritos do tecido e pelota microvascular. Propomos uma separação de três etapas seguida de filtragem para obter uma filtragem rica em micronavios. Com este método, a quantidade de fragmentos microvasculares obtidos de 10 camundongos é suficiente para semeadura 9 poços (9,6 cm2 cada) de uma placa de 6 poços. Mais interessante com este protocolo, o usuário pode obter 27 poços ricos pericyte (9,6 cm2 cada) na passagem 2. A pureza das culturas pericítonas é confirmada com a expressão de marcadores clássicos pericytes: NG2, PDGFR-β e CD146. Este método demonstra uma ferramenta in vitro eficiente e viável para estudos fisiológicos e fisiopatológicos sobre pericitos.

Este protocolo (Figura 1) produz eficientemente 9 poços (de placas de 6 poços) no momento da semeadura em P0 (Figura 2A (P0: Dia 1)).
De P0 a P2, há características morfológicas específicas pelas quais as células endotélias (indicadas por setas brancas) e o aumento gradual dos pericantes (indicados por setas pretas) podem ser observados. Em P0, as células alongadas endotélias que se desenvolvem a partir de microvasos estão em abundância (Figura 2A,P0: Dia 3), enquanto a abundância de tais células alongadas é reduzida em P1 e ausente em P2. Pelo contrário, os pericitos aparecem como células quadrilaterais que são abundantes em P2 (Figura 2A, P2: Dia 18).
Para confirmar a pureza da cultura pericítica em P2, verificamos a expressão de NG2, CD146 e PDGFR-beta como marcadores pericantes usando PCR quantitativo (Figura 2B),imunocitoquímica (Figura 2C),e borrão ocidental (Figura 3). Pericantes em P2 expressam níveis mais elevados de CD146, NG2 e PDGFR-β quando comparados à expressão no extrato total do cérebro do rato (Ms Br). Como controle, a expressão de marcadores endoteliais Occludin e CD31, os astrócitos marcador glial fibrilary ácido proteína (GFAP) e microglia marcador CD11b também foram observados ausentes em P2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig01.jpg"> Figura 1: Resumo do protocolo. Este esboço representa etapas críticas para a extração do pericyte que começa com a desintegração do tecido com o moedor de pilão de vidro seguido pela separação de 3 etapas no dextran e na filtragem. Este protocolo emprega uma etapa da digestão da enzima de 33 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig1alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig2a.jpg"> Figura 2: Morfologia das células e expressão de marcadores. (A)Fase contraste imagens de pericites em P0, P1 e P2 estágios de proliferação. As pilhas endotelial abundantes em P0 são indicadas por setas brancas. Seu número diminuiu em P1 e eles desapareceram em P2. Os pericitos são indicados por setas pretas. (B) Análise da expressão cd146, NG2 e PDGFR-β por PCR em pericantes em P2 com pericantes em amostras de P1 e cérebro de camundongos (Ms Br). (C)Imagens representativas de pericantes em P2 exibindo imunomanchas positivas de CD146, PDGFR-β e, NG2. Barra de escala: 50 μm (ampliação de 20x) e 20 μm (ampliação de 40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig2alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig03.jpg"> Figura 3: Pureza representativa das culturas celulares. Análise da expressão CD146, PDGFR-β, NG2, Occludin, GFAP, CD31, CD11b e Tubulin por borrão ocidental em pericantes em amostras de P2 e mouse brain (Ms Br). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig3alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60588/60588fig4a.jpg"> Figura 4: Comparação representativa de diferentes métodos de desintegração de tecidos, purificação, enriquecimento e digestão enzimática. Cada protocolo publicado é resumido com indicações sobre o número de animais utilizados para cada protocolo. As saídas também são indicadas no que diz respeito ao número de poços obtidos após a semeada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60588/60588fig4alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>

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A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

Apresentamos um protocolo para a extração de pericitos cerebrais murina. Baseado em uma extração pericyte orientada para enriquecimento livre de antibióticos, este protocolo é uma ferramenta valiosa para estudos in vitro que fornecem alta pureza e alto rendimento, diminuindo assim o número de animais experimentais usados.

Um método de alta saída para isolar pericites cerebrais do rato

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Recentemente, o papel dos pericítos cerebrais tornou-se evidente em distúrbios neurológicos e função cerebral. Portanto, o desenvolvimento de um método de cultura confiável para essas células é imperativo. Nosso protocolo para a extração de pericítos cerebrais murinas representa uma ferramenta confiável para estudos in vitro e para fornecer pericítes com alta pureza e rendimento celular.Demonstrando o procedimento com Anupriya Mehra será Lucie Dehouck, uma técnica do meu laboratório. Comece colocando o cérebro de um rato C57BL/6 macho de quatro semanas de idade específico em um limpador seco e estéril e usando fórceps de ponta curva para remover os nervos de cerebelo, estriado e occipital. Use um cotonete para remover todas as meninges visíveis e virar o tecido cerebral de cabeça para baixo.Abra os lóbulos com traços leves para fora e remova todos os vasos sanguíneos visíveis. Em seguida, coloque o tecido cerebral sem meninges em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 15 mililitros de tampão de lavagem frio B.To homogeneizar o tecido, transferir a amostra cerebral para um tubo de argamassa de moedor de tecido Dounce e adicionar três a quatro mililitros de tampão de lavagem B ao tubo. Use um pilão solto para picar o tecido 55 vezes, depois enxágue o pilão com tampão de lavagem B e pique o chorume de tecido com um pilão apertado 25 vezes.Ao final da homogeneização, igualmente aliquotar o chorume entre dois tubos de 50 mililitros e adicionar 1,5 vezes o volume de frio 30% bovino serum albumin dextran. Em seguida, agite vigorosamente os tubos para misturar o chorume. Para isolar a fração vascular, sedimentar as células por centrifugação e transferir os supernantes em dois novos tubos.Armazene a pelota na lavagem do tampão B no gelo. Resuspenda as pelotas em três mililitros de tampão de lavagem a frio B no gelo. Centrifugar os supernantes colhidos e repetir este passo mais uma vez.Descarte os supernaciantes e resuspenque as pelotas em três mililitros de tampão de lavagem B.Em seguida, acumule as pelotas resuspended e leve o volume final da suspensão da célula agrupada para 10 mililitros com tampão de lavagem frio fresco B.Dissociar ainda mais as células com uma pipeta de 10 milímetros seis vezes até que nenhum pedaço restante de pelotas seja visível e use um conjunto de filtro de vácuo e um filtro de malha de nylon para filtrar a suspensão da célula. Coloque o coador em uma placa de Petri e limpe a malha com tampão de lavagem fresco B e raspando para recuperar quaisquer capilares. Em seguida, realize uma segunda filtragem com um filtro fresco.Divida o filtrado igualmente entre dois tubos e colete as células por centrifugação. Depois de descartar os supernantes, junte as pelotas em um único tubo contendo tampão de lavagem pré-enwarmed B com enzimas e adicione Colagenase/Dispase pré-enwarmed ao tubo. Coloque o tubo em um banho de água de mesa tremendo por precisamente 33 minutos a 37 graus Celsius antes de parar a reação com 30 mililitros de tampão de lavagem a frio B.Colecione as células por centrifugação e descarte cuidadosamente o supernante.Rápido, mas cuidadosamente, ressumem a pelota na lavagem do tampão B seis vezes e centrifufique a suspensão novamente. Depois de descartar o supernaspe, resuspenque a pelota em 18 mililitros de média dMEM completa e sementes dois mililitros de suspensão celular em DMEM completo em nove poços de três placas de seis poços revestidos de Matrigel. Coloque as culturas celulares em uma incubadora estéril de 37 graus Celsius 5% de dióxido de carbono por 24 horas antes de remover cuidadosamente os detritos de cada poço e adicionar mídia DMEM fresca.Depois de 48 horas, troque o meio em cada poço a cada 48 horas. No dia 8 a 10, quando as células atingem 100% de confluência, passe as células em meio de cultura pericíte para novas placas de gelatina revestidas de seis poços e devolva as células à incubadora de cultura celular por mais seis a sete dias com monitoramento. Em seguida, divida as células novamente no dia 17 em pericíte médio em novas placas revestidas de gelatina.Da passagem zero à segunda passagem, há características morfológicas específicas pelas quais as células endoteliais e o subsequente aumento gradual de pericítos podem ser identificados. Em uma passagem cultura zero, células endoteliais alongadas que se desenvolvem a partir de microvexilhões estão em abundância. Esta abundância é reduzida após a passagem um e ausente após a passagem dois.Pelo contrário, os pericílitos aparecem como raras células quadrilaterais nas culturas primitivas e se tornam abundantes pela segunda passagem. A avaliação da expressão de NG2, CD146 e PDGFR beta pode ser usada para avaliar a pureza da cultura pericíte por PCR quantitativo, imunocitoquímica e mancha ocidental. A digestão enzimápica é um passo crítico para o sucesso do protocolo.Certifique-se de monitorar rigorosamente as concentrações enzimáticas e o tempo de incubação.

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