Name: generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

يشكر المؤلفون أول منشأة تصنيع صغيرة في ETH Zurich. تم دعم هذا العمل من قبل مجلس البحوث الأسترالي اكتشاف في وقت مبكر جائزة الباحث الوظيفي DE180100911 (إلى D.R.B.)، وغوردون وبيتي مور جائزة المحققين مبادرة الميكروبات البحرية GBMF3783 (إلى R.S.)، ومنحة المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم 1-002745-000 (إلى R.S.).

1. تصنيع جهاز Microfluidic لتجربة النبض الكيميائي واحد
<ol><li>تصميم القناة باستخدام برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) وطباعتها على فيلم شفافية لإنشاء قناع الصورة(الشكل 1A).</li>
	<li>قم بتلفيق المعلم عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة (في ظل ظروف غرفة نظيفة).<ol>
<li>تنظيف رقاقة ال?...

<ol>
	<li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of the chemotactic response. , (1991).</li><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+structuring+of+marine+ecosystems.">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li><li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., Gonz&#225;lez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+recyclers:+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms.">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li><li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+diversity+modulates+population+performance.">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).</li><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients.">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+compounds:+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology.">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li><li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds:+New+tools+for+cellular+physiology.">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signal+integration+in+bacteria.">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li><li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal.">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li><li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus.">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li><li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes.">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985 (2015).</li><li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients.">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices.">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).</li><li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes.">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li><li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel,+fast+caged+neurotransmitters.">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li><li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm:+Photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li><li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T=298.15K.">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li><li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+properties+of+seawater:+a+review+of+existing+correlations+and+data.">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li><li>. Nikon depth of field calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019)</li><li>Ki&#248;rboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates:+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters.">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li><li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria.">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li><li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches.">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li><li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap.">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior.">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li><li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels.">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li></ol>

تسمح هذه الطريقة للباحثين بدراسة الضريبة الكيميائية البكتيرية تحت التدرجات الديناميكية الخاضعة للرقابة في الأجهزة الدقيقة والسائلة، مما يتيح الحصول على بيانات قابلة للتكرار. يهدف الإنشاء شبه الفوري للنبضات الكيميائية على المقياس الدقيق عن طريق التحليل الضوئي إلى إعادة إنتاج أنواع الب...

تعتمد الميكروبات على chemotaxis ، وعملية الكشف عن التدرجات الكيميائية وتعديل الحركة في الاستجابة1، للتنقل في المناظر الطبيعية الكيميائية ، والاقتراب من مصادر المغذيات والمضيفين ، والهروب من المواد الضارة. هذه العمليات على نطاق صغير تحديد الحركية على نطاق كلي من التفاعلات بين الميكروبات وبيئتها2،3. وقد أحدثت التطورات الأخيرة في microfluidics وتقنيات microfabrication ، بما في ذلك الطباعة الحجرية لينة4، ثورة في قدرتنا على خلق البيئات الدقيقة التي تسيطر عليها لدراسة التفاعلات من الميكروبات. على سبيل المثال ، درست التجارب السابقة chemotaxis البكتيرية عن طريق توليد درجة عالية من التحكم ، وتدرجات مستقرة من تركيزات المغذيات المتوسطة إلى العالية5،6. ومع ذلك ، في البيئات الطبيعية ، يمكن أن تكون التدرجات الكيميائية على نطاق صغير قصيرة الأجل - تبدد عن طريق الانتشار الجزيئي - وظروف الخلفية غالبا ما تكون مخففة للغاية7. لقياس الاستجابة الكيميائية للمجموعات الميكروبية التي تعرضت لأول مرة لبيئات كيميائية غير مستقرة، ابتكرنا هنا ووصف طرقًا للجمع بين تقنية الموائع الدقيقة والتحلل الضوئي، وبالتالي محاكاة التدرجات التي تواجهها البكتيريا البرية في الطبيعة.
تستخدم تقنية Uncaging مسابر حساسة للضوء تغلف الجزيئات الحيوية وظيفياً في شكل غير نشط. التشعيع يطلق الجزيء في قفص، مما يسمح للاضطراب المستهدف من عملية بيولوجية8. بسبب السيطرة السريعة والدقيقة للكيمياء الخلوية التي uncaging يوفر9، وقد تم تقليديا استخدام التدليل الضوئي من المركبات القفص من قبل علماء الأحياء وعلم وظائف الأعضاء وعلماء الأعصاب لدراسة تفعيل الجينات10، قنوات أيون11، والخلايا العصبية12. في الآونة الأخيرة ، استفاد العلماء من المزايا الهامة للانطال الضوئي لدراسة chemotaxis13، لتحديد ديناميات تبديل flagella من الخلايا البكتيرية الفردية المعرضة لتحفيز chemoattractant خطوة خطوة14،15، والتحقيق في أنماط الحركة من الخلايا المنوية واحدة في ثلاثي الأبعاد (3D) التدرجات16.
في نهجنا ، نقوم بتنفيذ التحليل الضوئي للأحماض الأمينية في قفص داخل الأجهزة microfluidic لدراسة الاستجابة السلوكية للسكان البكتيرية للنبضات الكيميائية التي تسيطر عليها ، والتي تصبح متاحة على الفور تقريبا من خلال الإفراج عن الصور. استخدام هدف التكبير المنخفض (4x) (NA = 0.13، عمق التركيز حوالي 40 ميكرومتر) يسمح لكل من مراقبة الاستجابة التجميعية على مستوى السكان لآلاف البكتيريا على مجال رؤية كبير (3.2 مم × 3.2 مم)، وقياس الحركة على مستوى الخلية الواحدة. نقدم تطبيقين لهذه الطريقة: 1) إطلاق نبضة كيميائية واحدة لدراسة ديناميات التراكم البكتيري-تبديد بدءاً من ظروف موحدة، و2)إطلاق نبضات متعددة لتوصيف ديناميات التراكم البكتيري في ظل ظروف جذب كيميائي متفاوتة زمنياً وغير متجانسة مكانياً. وقد تم اختبار هذه الطريقة على البكتيريا البحرية Vibrio ordalii أداء chemotaxis نحو الغلوتامات الأحماض الأمينية17، ولكن هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على مجموعات مختلفة من الأنواع وchemoattractants ، وكذلك على العمليات البيولوجية وراء chemotaxis (على سبيل المثال ، امتصاص المواد الغذائية ، والتعرض للمضادات الحيوية ، واستشعار النصاب القانوني). يعد هذا النهج بالمساعدة في توضيح إيكولوجيا وسلوك الكائنات الحية الدقيقة في بيئات واقعية والكشف عن المفاضلات الخفية التي تواجهها البكتيريا الفردية عند التنقل في التدرجات الديناميكية الزائلة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>&#62;98% purity, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>to eliminate spent media from the bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubators Incu-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>390-0384</td>
			<td>to bake 3D master</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duster</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>16650-22</td>
			<td>to clean the wafer and microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>444-0601</td>
			<td>to bond the microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSafe micro centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688312</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>for image analysis and bacterial tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>631-1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon Eclipse TiE</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td>with motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNI-Glutamate</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1490</td>
			<td>&#62;98 % purity, photosensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing equipment</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Objet30 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing service</td>
			<td>3D Printing Studios</td>
			<td>Custom</td>
			<td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>to calibrate the uncaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscope Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven Venti-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>466-3516</td>
			<td>to bake PDMS (with forced convection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8-3050</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU8-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma chamber Zepto</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO-1</td>
			<td>to functionalize the surfaces before bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCT0447100</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size, 19 % open area, 24 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene microtubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>I.D. x O.D.: 0.015&#34; x 0.043&#34; / 0.38mm x 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>611-2605</td>
			<td>to weight PDMS mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Andor Zyla</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Product No. SS1-160p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2015</td>
			<td>Dassault Systemes SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td>Used to design the mold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencolor</td>
			<td></td>
			<td>for LED 395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>110-41-155</td>
			<td>PDMS Si Elastomer Kit; curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Luer-Lok)</td>
			<td>B Braun Omnifix</td>
			<td>4616308F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Needle</td>
			<td>Agani</td>
			<td>A228</td>
			<td>from 10 to 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump 11 Pico Plus Elite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroGrey</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Dual Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Mold Material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior

نحن نُظهر طريقة لتوليد نبضات كيميائية ديناميكية خاضعة للرقابة - حيث يصبح attractant المترجم متاحًا فجأة على النطاق الصغير - لإنشاء بيئات صغيرة لتجارب chemotaxis الميكروبية. لإنشاء نبضات كيميائية ، قمنا بتطوير نظام لإدخال مصادر الأحماض الأمينية على الفور عن طريق التحليل الضوئي للأحماض الأمينية في قفص داخل غرفة microfluidic polydimethylsiloxane (PDMS) التي تحتوي على تعليق بكتيري. طبقنا هذه الطريقة على البكتيريا الكيميائية ، Vibrio ordalii، والتي يمكن أن تتسلق بنشاط هذه التدرجات الكيميائية الديناميكية في حين يتم تعقبها عن طريق المجهر الفيديو. الأحماض الأمينية، التي قدمت خاملة بيولوجيا ('caged') عن طريق التعديل الكيميائي مع مجموعة حماية قابلة للإزالة الضوئية، موجودة بشكل موحد في التعليق ولكنها غير متوفرة للاستهلاك حتى إطلاقها المفاجئ، والذي يحدث في النقاط التي يحددها المستخدم في الزمان والمكان عن طريق شعاع LED مركز بالقرب من الأشعة فوق البنفسجية A. يمكن تحديد عدد الجزيئات التي يتم إطلاقها في النبض من خلال علاقة معايرة بين وقت التعرض وكسر الكسر الغير مُقَدَّم، حيث يتميز طيف الامتصاص بعد التحليل الضوئي باستخدام التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. يمكن دمج غشاء البولي المسامية النانوية (PCTE) في الجهاز الميكروسائلي للسماح بالإزالة المستمرة عن طريق تدفق المركبات غير المستقرة والوسائط المستهلكة. يتم تحقيق رابطة قوية لا رجعة فيها بين غشاء PCTE وبنية PDMS microfluidic عن طريق طلاء الغشاء مع محلول من 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) تليها تنشيط البلازما من الأسطح التي يتعين استعبادها. ويمكن للنظام الذي يتم التحكم فيه بالحاسوب أن يولد تسلسلات من النبضات يحددها المستخدم في مواقع مختلفة وبكثافة مختلفة، وذلك لخلق مناظر طبيعية للموارد ذات تغير مكاني وزمني مقرر. وفي كل مشهد كيميائي، يمكن الحصول على ديناميات الحركة البكتيرية على النطاق الفردي وتراكمها على مستوى السكان، مما يسمح بالقياس الكمي لأداء التكتيك الكيميائي وآثاره على التجمعات البكتيرية في البيئات ذات الصلة إيكولوجيا.

استخدمنا أجهزة الموائع الدقيقة والسائلة(الشكل 1)لدراسة ملامح التراكم البكتيري في ظل ظروف المغذيات الديناميكية. تم استخراج المسارات البكتيرية من مقاطع الفيديو المسجلة التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر على تباين المرحلة لديناميكيات تبديد التراكم للسكان البكتيريين بعد ن?...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

يتم تقديم بروتوكول لتوليد المناظر الطبيعية الكيميائية الديناميكية عن طريق الانحلال الضوئي داخل الاجهزة microfluidic وmillifluidic. هذه المنهجية مناسبة لدراسة العمليات البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك السلوك المتنوعة ، وامتصاص المغذيات ، أو التكيف مع المواد الكيميائية للكائنات الحية الدقيقة ، سواء على مستوى الخلية الواحدة أو السكان.

توليد المناظر الطبيعية الكيميائية الديناميكية الخاضعة للرقابة لدراسة السلوك الميكروبي

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

هذه الطريقة تسمح لتوضيح البيئة الدقيقة والسلوك من الكائنات الحية الدقيقة التنقل التدرجات الكيميائية الحيوية والكشف عن المقايضات الخفية، وديناميات المغذيات، والسكان في البيئة الدقيقة ذات الصلة بيئيا. من خلال الجمع بين تكنولوجيا microfluidic مع التحليل الضوئي ، ونحن توليد نبضات كيميائية تسيطر عليها ، حيث المترجمة الكيماوية تصبح متاحة فجأة في microscale ، لقياس الاستجابة الكيميائية من السكان الميكروبية تتعرض لأول مرة إلى التدرجات الكيميائية غير اكيد. صمم القناة باستخدام برنامج CAD، واطبعه على فيلم شفافية لإنشاء قناع الصورة.تلفيق السيد عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة في غرفة نظيفة، وفقا للمخطوطة. إعداد خليط PDMS عن طريق الجمع بين الداسترومر مع وكيل علاجها بنسبة 10 إلى واحد في منقار 40 ملليلتر. مع سكين بلاستيكية، اخلط بقوة حتى يصبح السائل متجانساً.على الفور degas خليط PDMS في غرفة فراغ لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. لتسريع العملية، الإفراج دوريا الفراغ من أجل انفجار الفقاعات التي تشكل في واجهة. إزالة الغبار من سطح سيد مع منظف مضغوط.ثم صب خليط PDMS دياسيد على سيد، وخبز في فرن في 80 درجة مئوية لمدة ساعتين. قطع PDMS مع شفرة حول microstructures على مسافة قدرها حوالي خمسة ملليمترات، ومن ثم بعناية قشر PDMS من سيد. ثقوب لكمة لتكون بمثابة مدخل ومنفذ من القنوات الدقيقة.ختم microchannel مع شريط لاصق لمنع تراكم الغبار. صمم الشكل ثلاثي الأبعاد باستخدام برنامج التصميم ثلاثي الأبعاد، وطبعة المفتاح لقالب PDMS مع طابعة ثلاثية الأبعاد عالية الدقة. بعد إعداد و degassing خليط PDMS كما فعلت سابقا، وتنظيف سطح سيد عن طريق dabbing مع شريط لاصق.ضع السيد على مقياس ثم، في حين تجنب المنطقة الوسطى من سيد، صب 23.4 غراما من خليط PDMS uncured من أجل الحصول على الارتفاع المطلوب من PDMS عن طريق مطابقة ارتفاع سيد في 0.5 ملليمتر. إزالة أي فقاعات المتبقية مع مساعدة من الهواء المضغوط.وضع المدلى بها PDMS على سيد في فرن في 45 درجة مئوية لخبز لمدة 12 ساعة على الأقل. ثم، بلطف قشر قبالة طبقة PDMS تصلب، ومدخل لكمة وثقوب منفذ لحقن التعليق البكتيري. قم بتنشيط كل من سطح طبق بيتري وطبقة PDMS مع بلازما الأكسجين لمدة دقيقتين.السندات قالب PDMS على طبق بيتري عن طريق الضغط بلطف على القالب إلى طبق بيتري. تجنب الضغط على مكان وجود الميزات. ضع طبق بيتري المستعبدين إلى قالب 3D PDMS في فرن في 45 درجة مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل لتعزيز السندات الكيميائية.بعد ذلك، قم بتنشيط غشاء البولي المسامي النانوي في غرفة بلازما الأكسجين لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية، وتمييع حل تجاري من 3-aminopropyltriethoxysilane في المياه ديونيد إلى 1٪ من قبل حجم باستخدام أنبوب البولي بروبلين. نقل المخفف 3-aminopropyltriethoxysilane حل في طبق بيتري, وتزج الغشاء المنشط في حل 3-aminopropyltltthoxysilane لمدة 20 دقيقة.ثم, إزالة الغشاء من حل 3-aminopropyltriethoxysilane مع ملاقط, ووضعها على غرفة نظيفة مسح لتجف. لتصنيع قنوات PDMS microfluidic التي ستقع على الغشاء وتسمح بغسل الساحة البكتيرية ، كرر تصنيع الجهاز microfluidic لتجربة النبض الكيميائي واحد كما كان عليه في السابق. لسندات قنوات الغسيل PDMS إلى الغشاء الوظيفي، أولا تنشيط كل من قناة غسل PDMS والغشاء البولي مع غرفة بلازما الأكسجين لمدة دقيقتين.مباشرة بعد العلاج البلازما، وجلب الغشاء وظيفية وقناة غسل PDMS في اتصال عن طريق الضغط بلطف على قناة غسل PDMS على الغشاء. من المهم أن تضغط بلطف معا PDMS والغشاء، أو قد يكون الغشاء لا رجعة فيه المستعبدين إلى سقف 200 ميكرومتر ارتفاع PDMS microchannel. ثم، وتفعيل كل من الاستعبادي صفح PDMS غسل قناة الغشاء البولي و 3D PDMS العفن المستعبدين سابقا إلى طبق بيتري عن طريق وضعها في غرفة البلازما الأكسجين لمدة دقيقتين.شطيرة الغشاء بين طبقتين من طبقات PDMS، واضغط معا. ضع طبق بيتري المستعبدين إلى هيكل الساندويتش في فرن في 45 درجة مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل لتعزيز السندات الكيميائية. للبدء، والحفاظ على غرفة ميليفلورويديك تحت فراغ لمدة 20 دقيقة.ثم، ضع طبق بيتري الذي يحتوي على غرفة المليفلوريميك على مرحلة المجهر. مع ماصة، ملء الغرفة تحت الغشاء مع تعليق البكتيرية المخفف من GFP-fluorescent فيبريو ordalii في واحد ملليمولار 4-ميثوكسي-7-النيترويندولينيل-قفص-إل-جلوتاميت حل في مياه البحر الاصطناعية. بعد ملء القناة مع تعليق البكتيرية، وامتصاص حل في الزائدة مع منشفة ورقية، وختم مدخل ومنافذ مع المقابس PDMS عن طريق الضغط بلطف لهم في الثقوب.ملء حقنة مع محلول مياه البحر الاصطناعية من واحد ملليمولار 4-ميثوكسي-7-النيترويندولينيل-قفص-L-الغلوتامات، وإرفاق أنابيب إلى مدخل ومأخذ قناة الغسيل فوق الغشاء. قم بتوصيل الأنابيب بخزان للنفايات، وتأكد من أن الأنبوب مغمور بالكامل في خزان نفايات السوائل لتجنب تذبذبات الضغط. تعيين معدل التدفق على مضخة حقنة إلى 50 ميكرولتررس في الدقيقة الواحدة.بدء ضخ حقنة لتحديد تدفق في قناة الغسيل فوق الغشاء. بدء تشغيل البرنامج التحكم في شعاع LED ومرحلة المجهر، وتوليد تسلسلات محددة من قبل المستخدم من البقول في مواقع مختلفة ومع كثافة مختلفة. تسجيل الفيديو باستخدام هدف 4x في فترات زمنية منتظمة على مدى فترة عدة ساعات وعلى عدة مواقع متجاورة لتغطية سطح كبير.في هذه الدراسة، تم استخدام الأجهزة microfluidic و مللي فلوريد لدراسة الاستجابة الكيميائية البكتيرية وتراكم ملامح في ظل ظروف المغذيات الحيوية. وتظهر الإسقاطات الحد الأقصى للكثافة الوضع البكتيري، المشار إليه بالآثار البيضاء، على مدى فاصل زمني 0.5 ثانية مباشرة بعد إطلاق النبضة و40 ثانية بعد إطلاق النبض. كما تم عرض المسارات البكتيرية باللون الأسود بعد 60 ثانية من إطلاق النبض.وتمثل المنطقة المظللة النبض الكيميائي الذي يطلقه التحليل الضوئي في الوقت صفر ثانية في منتصف مجال الرؤية، الذي انتشر فيما بعد. يتم هنا عرض تركيز البكتيريا، وكذلك الديناميات الزمنية لسرعة الانجراف شعاعي بعد إطلاق نبض في وسط مجال الرؤية. القيم السلبية للسرعة الانجراف تتوافق مع الحركة الكيماوية الموجهة نحو مركز النبض.يتم تقديم إحصاءات السباحة هنا للسكان البكتيرية في غياب التدرجات الكيميائية. تمثل المسارات الإسقاطات ثنائية الأبعاد للحركة البكتيرية ثلاثية الأبعاد في القناة الدقيقة. وكان توزيع احتمال سرعة السباحة البكتيرية المقاسة مناسباً من خلال توزيع غاما.من المسارات البكتيرية، تم استخراج التوزيع الاحتمالي للوقت بين إعادة التوجيه المتتالية. وقد استخدم نمط إعادة التوجيه، وتوزيع سرعة السباحة، وإحصاءات إعادة التوجيه للكائنات الحية في إثراء نموذج قائم على الفرد. وقد تم اختبار هذه الطريقة على البكتيريا البحرية فيبريو ordalii أداء chemotaxis نحو الغلوتامات الأحماض الأمينية، ولكن المنهجية المقترحة تنطبق على نطاق واسع على مجموعة مختلفة من الأنواع وكيماوياتtractants، وكذلك للعمليات البيولوجية وراء chemotaxis، مثل السكان وديناميات المجتمع في ظروف غير متجانسة مكانيا وديناميكية.وقد تجاهلت التقنيات الكلاسيكية في علم البيئة الميكروبية وعلم الأحياء الدقيقة، مثل النمو في الثقافات الدفعية أو الثقافات، إلى حد كبير الخصائص الملعقة الزمنية للموائل الميكروبية. ويهدف الخلق شبه الفوري للبقوليات الكيميائية في النطاقات الدقيقة عن طريق التحليل الضوئي إلى إعادة إنتاج نوع البقول الغذائية التي تواجهها البكتيريا البحرية في البرية من مجموعة من المصادر، على سبيل المثال، الانتشار المنتشر للأعمدة خلف الجسيمات العضوية الغارقة أو المغذيات المنتشرة من خلايا العوالق النباتية المتحللة. حل أمينوسيلان هو سامة بشكل حاد وينبغي التعامل معها بعناية فائقة.نحن نعمل حصرا تحت غطاء محرك الدخان وارتداء معدات واقية مثل معطف المختبر، نظارات السلامة، والقفازات. كما أننا نهتم بالنفايات التي ولدناها.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

أسطح Micropatterned لدراسة التفاعلات حمض الهيالورونيك مع خلايا السرطان

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

التوليف من البروتين الاصطناعي Intein بوساطة هيدروجيل

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

تسيطر البيئة الميكروية للتحقيق ديناميكية الدم الحمراء تجميع خلية

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

مفاعل حيوي رواية لزراعة ارتفاع كثافة المجتمعات الميكروبية متنوعة

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

بالتناوب المغناطيسي Microgels الجيلاتين الهجين-الميدان الاستجابة لرقابة الإصدار المخدرات

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

توسيع Nanopatterned ركائز باستخدام تقنية غرزة لNanotopographical التحوير سلوك الخلية

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

نمذجة السلوك سرطان المبيض متعددة الخلايا الجسم الشبه الكروي في Microdevice دينامية 3D البريتوني

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

تحليل الميكانيكية الحيوية البيئية للتنبؤ بسلوك تليين يزرع العصبية

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

البذر الخلايا Stepwise على السقالات تيسلاتيد لدراسة الأوعية الدموية تنبت

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...