Name: generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

Forfatterne takker den første mikrofabrikation facilitet på ETH Zürich. Dette arbejde blev støttet af en australsk Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (til D.R.B.), en Gordon og Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (til RS), og en schweizisk National Science Foundation tilskud 1-002745-000 (til R.S.).

1. Fremstilling af den mikrofluidiske enhed til single chemical-pulse Eksperiment
<ol><li>Design kanalen ved hjælp af COMPUTER-aided design (CAD) software og udskrive den på en gennemsigtighed film for at skabe fotomaske(Figur 1A).</li>
	<li>Opfabriker mesteren ved blød litografi (under renrumsforhold).<ol>
<li>Rengør en silicium wafer (4 inches) i hurtig rækkefølge med acetone, methanol og isopropanol, derefter tørre ved hjælp af kvælstof. Waferen bages i ovnen v...

<ol>
	<li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of the chemotactic response. , (1991).</li><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+structuring+of+marine+ecosystems.">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li><li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., Gonz&#225;lez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+recyclers:+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms.">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li><li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+diversity+modulates+population+performance.">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).</li><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients.">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+compounds:+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology.">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li><li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds:+New+tools+for+cellular+physiology.">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signal+integration+in+bacteria.">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li><li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal.">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li><li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus.">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li><li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes.">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985 (2015).</li><li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients.">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices.">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).</li><li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes.">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li><li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel,+fast+caged+neurotransmitters.">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li><li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm:+Photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li><li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T=298.15K.">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li><li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+properties+of+seawater:+a+review+of+existing+correlations+and+data.">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li><li>. Nikon depth of field calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019)</li><li>Ki&#248;rboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates:+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters.">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li><li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria.">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li><li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches.">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li><li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap.">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior.">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li><li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels.">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li></ol>

Denne metode gør det muligt for forskere at studere bakterielke kemotaxis under kontrollerede, dynamiske gradienter i mikro- og millifluidic enheder, så reproducerbare dataindsamling. Den næsten øjeblikkelige skabelse af kemiske impulser på mikroskala ved fotolyse har til formål at reproducere de typer af næringsstoffer pulser, bakterier støder på i naturen fra en række kilder, for eksempel, diffusive spredning af fjer bag synkende marine partikler25, eller næringsstof spredning fra lys...

Mikrober er afhængige af kemotaxis, processen med at opdage kemiske gradienter og ændre motilitet som reaktion1, at navigere kemiske landskaber, tilgang næringsstof kilder og værter, og undslippe skadelige stoffer. Disse mikroskalaprocesser bestemmer makroskalakinetik af interaktioner mellem mikrober og deres miljø2,3. De seneste fremskridt inden for mikrofluidik og mikrofabrikationsteknologier, herunder blød litografi4,har revolutioneret vores evne til at skabe kontrollerede mikromiljøer til at studere samspillet mellem mikrober. For eksempel har tidligere forsøg studeret bakterielke kemotaxis ved at generere stærkt kontrollerede, stabile gradienter af mellemliggende til høje næringsstofkoncentrationer5,6. I naturlige miljøer kan mikroskalakemiske gradienter dog være kortvarige – spredes ved molekylær diffusion – og baggrundsforholdene er ofte meget fortyndet7. For direkte at måle den kemotaktiske reaktion af mikrobielle populationer, der først blev udsat for ustabile kemiske miljøer, udtænkte vi og beskriver her metoder til at kombinere mikrofluidic-teknologi med fotolyse og dermed efterligne gradienter, som vilde bakterier støder på i naturen.
Uncaging teknologi anvender lysfølsomme sonder, der funktionelt indkapsler biomolekyler i en inaktiv form. Bestråling frigiver molekylet i buret, hvilket gør det muligt at forstyrre en biologisk proces8. På grund af den hurtige og præcise kontrol af cellulære kemi, at udbåren giver9, fotolyse af bur forbindelser har traditionelt været ansat af biologer, fysiologer og neuroforskere til at studere aktivering af gener10, ion kanaler11, og neuroner12. For nylig har forskerne udnyttet de betydelige fordele ved fotolyse til at studere kemotaxis13, at bestemme flagella skifte dynamik enkelte bakterieceller udsat for en trinvis kemoattractant stimulus14,15, og at undersøge motilitet mønstre af enkelt sædceller celler i tre-dimensionelle (3D) gradienter16.
I vores tilgang implementerer vi fotolyse af buraminosyrer inden for mikrofluidic enheder for at studere en bakteriebestands adfærdsmæssige reaktion på kontrollerede kemiske impulser, som bliver næsten øjeblikkeligt tilgængelige via fotoudgivelse. Anvendelsen af et mål med lav forstørrelse (4x) (NA = 0,13, fokusdybde ca. 40 μm) gør det muligt både at observation af aggregeringiv respons på befolkningsniveau for tusindvis af bakterier over et stort synsfelt (3,2 mm x 3,2 mm) og måling af bevægelse på enkeltcelleniveau. Vi præsenterer to anvendelser af denne metode: 1) frigivelse af en enkelt kemisk puls til at studere bakteriel akkumulering−dissipation dynamik fra ensartede forhold, og 2i) frigivelse af flere impulser til at karakterisere bakteriel akkumulering dynamik under tidsvarierende, rumligt heterogene kemoattractant betingelser. Denne metode er blevet testet på de marine bakterier Vibrio ordalii udfører kemotaxis mod aminosyren glutamat17,men metoden er stort set gældende for forskellige kombinationer af arter og kemoattractants, samt biologiske processer ud over kemotaxis (f.eks næringsstof optagelse, antibiotika eksponering, kvorum sensing). Denne tilgang lover at hjælpe med at belyse økologi og adfærd mikroorganismer i realistiske miljøer og at afdække de skjulte kompromiser, at de enkelte bakterier står over for, når du navigerer flygtige dynamiske gradienter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>&#62;98% purity, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>to eliminate spent media from the bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubators Incu-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>390-0384</td>
			<td>to bake 3D master</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duster</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>16650-22</td>
			<td>to clean the wafer and microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>444-0601</td>
			<td>to bond the microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSafe micro centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688312</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>for image analysis and bacterial tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>631-1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon Eclipse TiE</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td>with motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNI-Glutamate</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1490</td>
			<td>&#62;98 % purity, photosensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing equipment</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Objet30 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing service</td>
			<td>3D Printing Studios</td>
			<td>Custom</td>
			<td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>to calibrate the uncaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscope Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven Venti-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>466-3516</td>
			<td>to bake PDMS (with forced convection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8-3050</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU8-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma chamber Zepto</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO-1</td>
			<td>to functionalize the surfaces before bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCT0447100</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size, 19 % open area, 24 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene microtubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>I.D. x O.D.: 0.015&#34; x 0.043&#34; / 0.38mm x 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>611-2605</td>
			<td>to weight PDMS mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Andor Zyla</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Product No. SS1-160p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2015</td>
			<td>Dassault Systemes SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td>Used to design the mold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencolor</td>
			<td></td>
			<td>for LED 395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>110-41-155</td>
			<td>PDMS Si Elastomer Kit; curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Luer-Lok)</td>
			<td>B Braun Omnifix</td>
			<td>4616308F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Needle</td>
			<td>Agani</td>
			<td>A228</td>
			<td>from 10 to 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump 11 Pico Plus Elite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroGrey</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Dual Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Mold Material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior

Vi demonstrerer en metode til generering af kontrollerede, dynamiske kemiske impulser – hvor lokaliseret kemoattractant pludselig fås på mikroskalaen – for at skabe mikromiljøer til mikrobielle kemotaxiseksperimenter. For at skabe kemiske impulser udviklede vi et system til at indføre aminosyrekilder nær øjeblikkeligt ved fotolyse af aminosyrer i bur i et polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidic kammer, der indeholder en bakteriel suspension. Vi anvendte denne metode til kemotactic bakterien, Vibrio ordalii, som aktivt kan klatre disse dynamiske kemiske gradienter og samtidig spores af video mikroskopi. Aminosyrer, gengivet biologisk inert ('bur') ved kemisk modifikation med en fotoaftagelig beskyttende gruppe, er ensartet til stede i suspensionen, men ikke tilgængelig til forbrug, indtil deres pludselige frigivelse, som opstår på brugerdefinerede tidspunkter i tid og rum ved hjælp af en nær-UV-A fokuseret LED stråle. Antallet af molekyler, der frigives i pulsen, kan bestemmes af en kalibreringsforhold mellem eksponeringstid og brudfraktion, hvor absorptionsspektret efter fotolyse er karakteriseret ved hjælp af UV-Vis spektroskopi. En nanoporøs polycarbonatmembran (PCTE) kan integreres i den mikrofluidiske enhed, så den kontinuerlige fjernelse af de uncaged-forbindelser og de brugte medier kan fjernes kontinuerligt. En stærk, irreversibel binding mellem PCTE membranen og PDMS mikrofluidic struktur opnås ved belægning membranen med en opløsning af 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) efterfulgt af plasma aktivering af overflader, der skal bindes. Et computerstyret system kan generere brugerdefinerede sekvenser af impulser på forskellige steder og med forskellige intensiteter, så der skabes ressourcelandskaber med foreskrevne rumlige og tidsmæssige variationer. I hvert kemisk landskab kan dynamikken i bakteriebevægelsen i den enkelte skala og deres akkumulering på befolkningsniveau opnås, hvilket gør det muligt at kvantificere kemotaktisk ydeevne og dens virkninger på bakteriesammenlægninger i økologisk relevante miljøer.

Vi brugte de mikrofluidiske og millifluidiske enheder(figur 1)til at studere bakterielle akkumuleringsprofiler under dynamiske næringsstofforhold. Bakterielle baner blev udvundet fra optagede videoer erhvervet ved fase kontrast mikroskopi af ophobning-spredning dynamik af en bakteriepopulation efter en kemisk puls udgivet af photolyse (Figur 2 og Figur 3). Ved i gennemsnit millioner af baner, den spatiotemporal dynamik radial drift...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

En protokol for produktion af dynamiske kemiske landskaber ved fotolyse inden for mikrofluidic og millifluidic opsætninger præsenteres. Denne metode er velegnet til at studere forskellige biologiske processer, herunder motiladfærd, optagelse af næringsstoffer eller tilpasning til kemikalier af mikroorganismer, både på enkeltcelle- og befolkningsniveau.

Generering af kontrollerede, dynamiske kemiske landskaber til undersøgelse af mikrobiel adfærd

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Denne metode gør det muligt at belyse mikroskala økologi og adfærd mikroorganismer navigere dynamiske kemiske gradienter og til at afdække deres skjulte trade-offs, næringsstof kinetik, og befolkningsdynamik i økologisk relevante mikromiljøer. Ved at kombinere mikrofluidisk teknologi med fotolyse genererer vi kontrollerede kemiske impulser, hvor lokaliseret kemoattractant pludselig bliver tilgængeligt på mikroskalaen, for at måle mikrobielle populationers chemotactic respons, der først blev udsat for ustabile kemiske gradienter. Design kanalen ved hjælp af CAD-software, og udskriv den på en gennemsigtighedsfilm for at oprette fotomasken.Fremstille masteren ved blød litografi i et rent rum, ifølge manuskriptet. Forbered en PDMS blanding ved at kombinere elastomer med sin hærdningsmiddel på en 10-til-en forholdet i en 40-milliliter bægerglas. Med en plastikkniv blandes kraftigt, indtil væsken er homogen.Straks afgas PDMS blandingen i et vakuumkammer i 45 minutter ved stuetemperatur. For at fremskynde processen, med jævne mellemrum frigive vakuum for at sprænge bobler, der danner på grænsefladen. Fjern støv fra overfladen af masteren med en trykrenser.Hæld derefter den afgasset PDMS-blanding på masteren, og bag den i en ovn ved 80 grader Celsius i to timer. Skær PDMS med en klinge omkring mikrostrukturerne i en afstand af ca. fem millimeter, og skræl derefter forsigtigt PDMS fra masteren. Punch huller til at tjene som indløb og udløb af mikrokanalen.Mikrokanalen forsegles med tape for at forhindre ophobning af støv. Design 3D-formen ved hjælp af 3D-designsoftware, og udskriv masteren til PDMS-formen med en 3D-printer i høj opløsning. Efter klargøring og afgasning af PDMS blandingen som gjort tidligere, rense overfladen af master ved dabbing med tape.Sæt mesteren på en skala. Derefter, mens undgå den centrale region af master, hæld 23,4 gram uhærdet PDMS blanding for at opnå den ønskede højde af PDMS ved at matche højden af master på 0,5 millimeter. Fjern eventuelle resterende bobler ved hjælp af trykluft.Placer PDMS støbt på master i en ovn ved 45 grader Celsius at bage i mindst 12 timer. Derefter skal du forsigtigt skrælle det hærdede PDMS lag, og punch indløb og udløb huller til injektion af bakteriel suspension. Aktiver både overfladen af en petriskål og PDMS-formen med iltplasma i to minutter.Bond PDMS formen på petriskålen ved forsigtigt at trykke formen til petriskålen. Undgå at trykke på det sted, hvor funktionerne er placeret. Placer petriskålen bundet til PDMS 3D-formen i en ovn ved 45 grader Celsius i mindst 12 timer for at styrke den kemiske binding.Dernæst aktiveres den nanoporous polycarbonatmembran i et iltplasmakammer i et minut ved stuetemperatur. Under en kemisk hætte fortyndes en kommerciel opløsning af 3-aminopropyltriethoxysilane i deioniseret vand til 1% volumen ved hjælp af et polypropylenrør. Den fortyndede 3-aminopropyltriethoxysilane opløsning overføres i en petriskål, og den aktiverede membran nedsænkes i 3-aminopropyltriethoxysilanopløsningen i 20 minutter.Fjern derefter membranen fra 3-aminopropyltriethoxysilane opløsningen med pincet, og læg den på et rent rum tørre til tørre. Til fremstilling af PDMS mikrofluidiske kanaler, der vil ligge på membranen og tillade vask af bakteriearenaen, skal du gentage fremstillingen af den mikrofluidiske anordning til det enkelte kemiske pulseksperiment som gjort tidligere. For at binde PDMS-vaskekanalerne til den funktionaliserede membran skal du først aktivere både PDMS-vaskekanalen og polycarbonatmembranen med et iltplasmakammer i to minutter.Umiddelbart efter plasmabehandlingen bringes den funktionaliserede membran og PDMS-vaskekanalen i kontakt ved forsigtigt at trykke PDMS-vaskekanalen på membranen. Det er vigtigt forsigtigt at presse PDMS og membranen sammen, eller membranen kan være uigenkaldeligt bundet til loftet i 200-mikrometer højde PDMS mikrokanal. Derefter aktivere både bundet laminat PDMS vask kanal polycarbonat membran og 3D PDMS skimmel tidligere bundet til petriskålen ved at placere dem i en ilt plasma kammer i to minutter.Sandwich membranen mellem to PDMS lag, og tryk sammen. Placer petriskålen bundet til sandwichstrukturen i en ovn ved 45 grader Celsius i mindst 12 timer for at styrke den kemiske binding. Til at begynde, opretholde millifluidic kammer under vakuum i 20 minutter.Derefter placere petriskålen indeholder millifluidkammeret på et mikroskop. Med en pipette fyldes kammeret under membranen med den fortyndede bakterielle suspension af GFP-fluorescerende Vibrio ordalii i en millimolar 4-methoxy-7-nitroindolinyl-bur-L-glutamatopløsning i kunstigt havvand. Efter at have fyldt kanalen med bakterieaffjedringen, suges opløsningen for meget med en køkkenrulle, og der skal forsegles ind og udløb med PDMS-stik ved forsigtigt at trykke dem ind i hullerne.Fyld en sprøjte med en kunstig havvandsopløsning på en millimolar 4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamat, og fastgør slangen til indløb og udløb af vaskekanalen over membranen. Tilslut slangen til et affaldsreservoir, og sørg for, at slangen er helt nedsænket i væskeaffaldsbeholderen for at undgå tryksosting. Indstil strømningshastigheden på sprøjtepumpen til 50 mikroliter i minuttet.Start sprøjtepumpen for at etablere flowet i vaskekanalen over membranen. Start den software, der styrer LED-strålen og mikroskopstadiet, og generere brugerdefinerede sekvenser af impulser på forskellige steder og med forskellige intensiteter. Optag video ved hjælp af en 4x målsætning med jævne mellemrum over en periode på flere timer og over flere sammenhængende steder for at dække en stor overflade.I denne undersøgelse blev de mikrofluidiske og millifluidiske enheder brugt til at studere bakterielt chemotactic respons og akkumuleringsprofiler under dynamiske næringsstofforhold. Maksimal intensitetsprojektioner viser bakteriepositionen, angivet med hvide spor, over et interval på 0,5 sekunder umiddelbart efter impulsudsætningen og 40 sekunder efter pulseudløselsen. De bakterielle baner blev også vist i sort 60 sekunder efter pulsudløselsen.Det skraverede område repræsenterer den kemiske puls, der frigives ved fotolyse ved tid nul sekund i midten af synsfeltet, som efterfølgende spredte sig. Den bakterielle koncentration, samt den tidsmæssige dynamik i den radiale drift hastighed efter en puls frigivelse i midten af synsfeltet er vist her. Negative værdier af afdrift hastighed svarer til rettet chemotactic bevægelse mod midten af pulsen.Svømning statistikker præsenteres her for en bakteriel befolkning i mangel af kemiske gradienter. Baner repræsenterer de to-dimensionelle fremskrivninger af den tre-dimensionelle bakterielle bevægelse i mikrokanalen. Sandsynlighedsfordelingen af målt bakteriel svømmehastighed var egnet ved en gammafordeling.Fra bakterieforløbene blev sandsynligheden for, at tiden mellem hinanden følgende omlægninger blev udvundet. Omlægningsmønsteret, fordelingen af svømmehastigheden og organismernes omlægningsstatistik blev anvendt til at informere en individuel baseret model. Denne metode er blevet testet på de marine bakterier Vibrio ordalii udfører chemotaxis mod aminosyren glutamat, men den foreslåede metode er bredt gældende for forskellige kombination af arter og kemoattractants, samt biologiske processer ud over chemotaxis, såsom befolkning og samfund dynamik i rumligt heterogene og dynamiske forhold.Klassiske teknikker i mikrobiel økologi og mikrobiologi, såsom vækster i batchkulturer eller kemostater, har stort set ignoreret de bølgende tidsmæssige karakteristika ved mikrobielle levesteder. Den næsten øjeblikkelige skabelse af kemiske impulser på mikroskalaer ved fotolyse har til formål at reproducere den type næringsstofimpulser, som marine bakterier støder på i naturen fra en række kilder, for eksempel den diffusive spredning af fjer bag synkende organiske partikler eller næringsstoffet spreder sig fra lyserede fytoplanktonceller. Aminosilaneopløsningen er akut giftig og bør håndteres med ekstrem omhu.Vi arbejder udelukkende under røghætten og bærer beskyttelsesudstyr som laboratoriekittel, sikkerhedsbriller og handsker. Vi tager os også af det affald, vi genererede.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Syntese af en Intein-medieret Kunstig Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Kontrolleret Mikrofluid Miljø for Dynamic Undersøgelse af røde blodlegemer Sammenlægning

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A Novel bioreaktor for High Density Dyrkning af Diverse mikrobielle samfund

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Vekslende magnetfelt-Responsive Hybrid Gelatine Mikrogeler for Controlled Drug frigivelse

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Udvidelse Nanopatterned Underlag Brug Stitch Teknik for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modeling Kræft i æggestokkene flercellede Sfæroide Behavior i en dynamisk 3D Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

Miljømæssige dynamisk mekanisk analyse til at forudsige den blødgørende opførsel af neurale implantater

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Trinvis celle såning på Tessellated stilladser til undersøgelse spirende blodkar

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...