Name: generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

De auteurs danken de eerste microfabricagefaciliteit van ETH Zürich. Dit werk werd ondersteund door een Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (aan D.R.B.), een Gordon en Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (aan R.S.), en een Swiss National Science Foundation subsidie 1-002745-000 (naar R.S.).

1. Fabricage van het microfluïde apparaat voor het single chemical-pulse experiment
<ol><li>Ontwerp het kanaal met behulp van computer-aided design (CAD) software en print het op een transparantie film om de foto masker(Figuur 1A)te maken.</li>
	<li>Fabriceer de meester door zachte lithografie (onder clean-room omstandigheden).<ol>
<li>Reinig een silicium wafer (4 inch) in snelle opeenvolging met aceton, methanol en isopropanol, dan droog met behulp van stikstof. Bak de w...

<ol>
	<li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of the chemotactic response. , (1991).</li><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+structuring+of+marine+ecosystems.">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li><li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., Gonz&#225;lez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+recyclers:+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms.">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li><li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+diversity+modulates+population+performance.">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).</li><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients.">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+compounds:+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology.">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li><li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds:+New+tools+for+cellular+physiology.">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signal+integration+in+bacteria.">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li><li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal.">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li><li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus.">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li><li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes.">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985 (2015).</li><li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients.">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices.">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).</li><li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes.">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li><li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel,+fast+caged+neurotransmitters.">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li><li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm:+Photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li><li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T=298.15K.">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li><li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+properties+of+seawater:+a+review+of+existing+correlations+and+data.">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li><li>. Nikon depth of field calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019)</li><li>Ki&#248;rboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates:+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters.">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li><li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria.">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li><li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches.">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li><li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap.">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior.">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li><li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels.">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li></ol>

Deze methode stelt onderzoekers in staat om bacteriële chemotaxis te bestuderen onder gecontroleerde, dynamische gradiënten in micro- en millifluïdische apparaten, waardoor reproduceerbare gegevens kunnen worden verkregen. De bijna ogenblikkelijke creatie van chemische pulsen op microschaal door fotolyse heeft tot doel de soorten voedingspulsen te reproduceren die bacteriën in het wild tegenkomen uit een reeks bronnen, bijvoorbeeld de verspreiding van pluimen achter zinkende mariene deeltjes25...

Microben vertrouwen op chemotaxis, het proces van het detecteren van chemische gradiënten en het wijzigen van de beweeglijkheid in reactie1,om chemische landschappen te navigeren, voedingsbronnen en gastheren te benaderen en schadelijke stoffen te ontsnappen. Deze microschaalprocessen bepalen de macroschaalkinetiek van interacties tussen microben en hun omgeving2,3. Recente ontwikkelingen in microfluidica en microfabricage technologieën, waaronder zachte lithografie4,hebben een revolutie teweeggebracht ons vermogen om gecontroleerde micro-omgevingen te creëren waarin de interacties van microben te bestuderen. In het verleden zijn bijvoorbeeld bacteriële chemotaxi's onderzocht door sterk gecontroleerde, stabiele gradiënten van tussenliggende tot hoge nutriëntenconcentraties te genereren5,6. In natuurlijke omgevingen kunnen chemische gradiënten op microschaal echter van korte duur zijn, verdrijving door moleculaire diffusie en achtergrondomstandigheden zijn vaak sterk verdund7. Om de chemotactische respons van microbiële populaties die voor het eerst werden blootgesteld aan onstabiele chemische omgevingen direct te meten, bedachten en beschrijven we hier methoden om microfluïdetechnologie te combineren met fotolyse, waardoor gradiënten nabootsen die wilde bacteriën in de natuur tegenkomen.
Uncaging technologie maakt gebruik van lichtgevoelige sondes die functioneel biomoleculen in een inactieve vorm inkapselen. Doorstraling komt het gekooide molecuul vrij, waardoor een biologisch proces gericht kan worden verstoord8. Als gevolg van de snelle en nauwkeurige controle van cellulaire chemie die de ontwering biedt9, fotolyse van gekooide verbindingen is traditioneel gebruikt door biologen, fysiologen en neurowetenschappers om de activering van genen te bestuderen10, ionkanalen11, en neuronen12. Meer recent hebben wetenschappers gebruik gemaakt van de aanzienlijke voordelen van fotolyse om chemotaxis13te bestuderen , om de flagella switching dynamiek van individuele bacteriële cellen blootgesteld aan een stapsgewijze chemoattractant stimulus14,15te bepalen en om beweeglijkheidspatronen van enkele zaadcellen in driedimensionale (3D) gradiënten te onderzoeken16.
In onze aanpak implementeren we fotolyse van gekooide aminozuren in microfluïdische apparaten om de gedragsreactie van een bacteriële populatie te bestuderen op gecontroleerde chemische pulsen, die bijna onmiddellijk beschikbaar worden via fotorelease. Het gebruik van een doelstelling met een lage vergroting (4x) (NA = 0,13, diepte van de focus ongeveer 40 μm) maakt zowel de waarneming van de aggregatieve respons op populatieniveau van duizenden bacteriën over een groot gezichtsveld (3,2 mm x 3,2 mm) als de meting van beweging op eencellige niveau mogelijk. We presenteren twee toepassingen van deze methode: 1) het vrijkomen van een enkele chemische puls om bacteriële accumulatie−dissipatiedynamiek te bestuderen vanaf uniforme omstandigheden, en 2i) het vrijkomen van meerdere pulsen om de bacteriële accumulatiedynamiek te karakteriseren onder tijdsvariërende, ruimtelijk heterogene chemoattractante omstandigheden. Deze methode is getest op de mariene bacteriën Vibrio ordalii die chemotaxis uitvoeren in de richting van het aminozuur glutamaat17, maar de methode is in grote lijnen van toepassing op verschillende combinaties van soorten en chemoattractants, evenals op biologische processen buiten chemotaxis (bijvoorbeeld, opname van voedingsstoffen, blootstelling aan antibiotica, quorumsensing). Deze aanpak belooft te helpen de ecologie en het gedrag van micro-organismen in realistische omgevingen te verduidelijken en de verborgen afwegingen te ontdekken waarmee individuele bacteriën worden geconfronteerd bij het navigeren in kortstondige dynamische gradiënten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>&#62;98% purity, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>to eliminate spent media from the bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubators Incu-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>390-0384</td>
			<td>to bake 3D master</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duster</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>16650-22</td>
			<td>to clean the wafer and microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>444-0601</td>
			<td>to bond the microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSafe micro centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688312</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>for image analysis and bacterial tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>631-1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon Eclipse TiE</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td>with motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNI-Glutamate</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1490</td>
			<td>&#62;98 % purity, photosensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing equipment</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Objet30 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing service</td>
			<td>3D Printing Studios</td>
			<td>Custom</td>
			<td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>to calibrate the uncaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscope Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven Venti-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>466-3516</td>
			<td>to bake PDMS (with forced convection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8-3050</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU8-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma chamber Zepto</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO-1</td>
			<td>to functionalize the surfaces before bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCT0447100</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size, 19 % open area, 24 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene microtubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>I.D. x O.D.: 0.015&#34; x 0.043&#34; / 0.38mm x 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>611-2605</td>
			<td>to weight PDMS mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Andor Zyla</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Product No. SS1-160p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2015</td>
			<td>Dassault Systemes SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td>Used to design the mold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencolor</td>
			<td></td>
			<td>for LED 395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>110-41-155</td>
			<td>PDMS Si Elastomer Kit; curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Luer-Lok)</td>
			<td>B Braun Omnifix</td>
			<td>4616308F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Needle</td>
			<td>Agani</td>
			<td>A228</td>
			<td>from 10 to 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump 11 Pico Plus Elite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroGrey</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Dual Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Mold Material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior

We demonstreren een methode voor de generatie van gecontroleerde, dynamische chemische pulsen-waar gelokaliseerde chemoattractant plotseling beschikbaar wordt op de microschaal- om micro-omgevingen te creëren voor microbiële chemotaxis experimenten. Om chemische pulsen te maken, ontwikkelden we een systeem om aminozuurbronnen bijna onmiddellijk te introduceren door fotolyse van gekooide aminozuren in een polydimethylsiloxane (PDMS) microfluïde kamer met een bacteriële suspensie. We hebben deze methode toegepast op de chemotactische bacterie, Vibrio ordalii, die actief deze dynamische chemische gradiënten kan beklimmen terwijl ze worden gevolgd door videomicroscopie. Aminozuren, biologisch inert ('gekooid') door chemische modificatie met een fotoverwijderbare beschermende groep, zijn gelijkmatig aanwezig in de suspensie, maar niet beschikbaar voor consumptie tot hun plotselinge release, die optreedt op door de gebruiker gedefinieerde punten in tijd en ruimte door middel van een bijna UV-A gerichte LED-balk. Het aantal moleculen dat vrijkomt in de puls kan worden bepaald door een kalibratierelatie tussen blootstellingstijd en ontwetelste fractie, waarbij het absorptiespectrum na fotolyse wordt gekenmerkt door het gebruik van UV-Vis spectroscopie. Een nanoporeus polycarbonaat (PCTE) membraan kan worden geïntegreerd in het microfluïde apparaat om de continue verwijdering door stroom van de ontgaardde verbindingen en de verbruikte media mogelijk te maken. Een sterke, onomkeerbare binding tussen het PCTE membraan en de PDMS microfluidic structuur wordt bereikt door het membraan te coaten met een oplossing van 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES), gevolgd door plasmaactivering van de te binden oppervlakken. Een computergestuurd systeem kan door de gebruiker gedefinieerde sequenties van pulsen genereren op verschillende locaties en met verschillende intensiteiten, om hulpbronnenlandschappen te creëren met voorgeschreven ruimtelijke en temporele variabiliteit. In elk chemisch landschap kan de dynamiek van bacteriële beweging op individuele schaal en hun accumulatie op populatieniveau worden verkregen, waardoor de kwantificering van de chemotactische prestaties en de effecten ervan op bacteriële aggregaties in ecologisch relevante omgevingen mogelijk wordt.

We gebruikten de microfluïde en millifluïde apparaten(figuur 1)om bacteriële accumulatieprofielen te bestuderen onder dynamische voedingscondities. Bacteriële trajecten werden geëxtraheerd uit opgenomen video's die werden verkregen door fasecontrastmicroscopie van de accumulatie-dissipatiedynamiek van een bacteriële populatie na een chemische puls die werd vrijgegeven door fotolyse (figuur 2 en figuur 3). Door het gemiddeld va...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Een protocol voor de generatie van dynamische chemische landschappen door fotolyse binnen microfluïde en millifluïde opstellingen wordt gepresenteerd. Deze methodologie is geschikt om diverse biologische processen te bestuderen, waaronder het motile gedrag, de opname van voedingsstoffen of aanpassing aan chemische stoffen van micro-organismen, zowel op eencellig als populatieniveau.

Het genereren van gecontroleerde, dynamische chemische landschappen om microbieel gedrag te bestuderen

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Deze methode maakt het mogelijk om de microschaal ecologie en het gedrag van micro-organismen navigeren dynamische chemische gradiënten te verduidelijken en om hun verborgen trade-offs, nutriënten kinetiek, en de dynamiek van de bevolking in ecologisch relevante micro-omgevingen te ontdekken. Door microfluïde technologie te combineren met fotolyse, genereren we gecontroleerde chemische pulsen, waarbij gelokaliseerde chemoattractant plotseling beschikbaar komt op microschaal, om de chemotactische respons van microbiële populaties te meten die voor het eerst werden blootgesteld aan onstabiele chemische gradiënten. Ontwerp het kanaal met CAD-software en print het op een transparantiefilm om het fotomasker te maken.Fabriceer de meester door zachte lithografie in een schone kamer, volgens het manuscript. Bereid een PDMS-mengsel door het elastomeer te combineren met zijn uithardingsmiddel met een 10-op-een verhouding in een bekerglas van 40 milliliter. Meng met een plastic mes krachtig tot de vloeistof homogeen is.Ontgassen het PDMS-mengsel onmiddellijk gedurende 45 minuten in een vacuümkamer bij kamertemperatuur. Om het proces te versnellen, periodiek laat het vacuüm om de bubbels die zich vormen op de interface barsten. Verwijder stof van het oppervlak van de meester met een reiniger onder druk.Giet vervolgens het ontgassen PDMS-mengsel op de meester en bak het twee uur in een oven op 80 graden Celsius. Snijd de PDMS met een mes rond de microstructuren op een afstand van ongeveer vijf millimeter, en dan voorzichtig schil de PDMS van de meester. Punch gaten om te dienen als de inlaat en uitlaat van de microchannel.Verzegel het microkanaal met plakband om ophoping van stof te voorkomen. Ontwerp de 3D-vorm met behulp van 3D-ontwerpsoftware en print de master voor de PDMS-mal met een 3D-printer met hoge resolutie. Na het voorbereiden en ontgassen van het PDMS-mengsel zoals eerder gedaan, reinigt u het oppervlak van de meester door te deppen met plakband.Zet de meester op een weegschaal. Vervolgens, terwijl het vermijden van het centrale gebied van de meester, giet 23,4 gram van ongecureerd PDMS mengsel om de gewenste hoogte van PDMS te verkrijgen door het afstemmen van de hoogte van de meester op 0,5 millimeter. Verwijder de resterende bellen met behulp van perslucht.Plaats de PDMS gegoten op de meester in een oven op 45 graden Celsius om te bakken voor ten minste 12 uur. Dan, voorzichtig schil van de geharde PDMS laag, en punch inlaat en uitlaat gaten voor de injectie van de bacteriële suspensie. Activeer zowel het oppervlak van een petrischaal als de PDMS-mal met zuurstofplasma gedurende twee minuten.Bond de PDMS mal op de Petri schotel door zachtjes druk op de mal aan de Petri schotel. Houd niet in op de plaats waar de functies zich bevinden. Plaats de petrischaal gebonden aan de PDMS 3D-mal in een oven op 45 graden Celsius gedurende ten minste 12 uur om de chemische binding te versterken.Activeer vervolgens het nanoporeus polycarbonaatmembraan in een zuurstofplasmakamer gedurende één minuut bij kamertemperatuur. Verdun onder een chemische kap een commerciële oplossing van 3-aminopropyltriethoxysilane in gedeïoniseerd water tot 1% in volume met behulp van een polypropyleenbuis. Breng de verdunde 3-aminopropyltriethoxysilane-oplossing over in een petrischaaltje en dompel het geactiveerde membraan gedurende 20 minuten onder in de 3-aminopropyltriethoxysilaneoplossing.Verwijder vervolgens het membraan uit de 3-aminopropyltriethoxysilane-oplossing met een pincet en plaats het op een schone kamer om te drogen. Voor de fabricage van de PDMS microfluïde kanalen die op het membraan liggen en het wassen van de bacteriële arena mogelijk maken, herhaal de fabricage van het microfluïde apparaat voor het enkele chemische pulsexperiment zoals eerder gedaan. Om de PDMS-waskanalen aan het gefunctionaliseerde membraan te binden, activeert u eerst twee minuten lang zowel het PDMS-waskanaal als het polycarbonaatmembraan met een zuurstofplasmakamer.Breng onmiddellijk na de plasmabehandeling het gefunctionaliseerde membraan en het PDMS-waskanaal in contact door het PDMS-waskanaal voorzichtig op het membraan te drukken. Het is belangrijk om de PDMS en het membraan voorzichtig tegen elkaar te drukken, of het membraan kan onomkeerbaar worden gebonden aan het plafond van de PDMS-microkanaal van 200 micrometer. Activeer vervolgens zowel het gebonden laminaat PDMS waskanaal polycarbonaat membraan als de 3D PDMS mal eerder gebonden aan de petrischaal door ze te plaatsen in een zuurstof plasma kamer gedurende twee minuten.Sandwich het membraan tussen twee PDMS lagen, en druk samen. Plaats de petrischaal gebonden aan de sandwich structuur in een oven op 45 graden Celsius voor ten minste 12 uur om de chemische binding te versterken. Om te beginnen moet u de millifluïde kamer gedurende 20 minuten onder vacuüm houden.Plaats vervolgens de petrischaal met de millifluïde kamer op een microscooppodium. Vul met een pipet de kamer onder het membraan met de verdunde bacteriële suspensie van GFP-fluorescerende Vibrio ordalii in één millimolar 4-methoxy-7-nitroindolinyl-gekooide-L-glutamaatoplossing in kunstmatig zeewater. Na het vullen van het kanaal met de bacteriële suspensie, zuig de oplossing in overmaat met een papieren handdoek, en verzegel inlaat en uitlaat met PDMS pluggen door ze voorzichtig te drukken in de gaten.Vul een spuit met een kunstmatige zeewateroplossing van één millimolar 4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamaat, en bevestig buizen aan de inlaat en uitlaat van het waskanaal boven het membraan. Sluit de slang aan op een afvalreservoir en zorg ervoor dat de slang volledig onder water staat in het vloeistofafvalreservoir om drukschommelingen te voorkomen. Stel de stroomsnelheid op de spuitpomp in op 50 microliter per minuut.Start de spuitpomp om de stroming in het waskanaal boven het membraan vast te stellen. Start de software die de LED-straal en de microscoopfase aanst handt en genereer door de gebruiker gedefinieerde sequenties van pulsen op verschillende locaties en met verschillende intensiteiten. Neem video op met behulp van een 4x-doelstelling op regelmatige tijdstippen over een periode van enkele uren en over meerdere aaneengesloten locaties om een groot oppervlak te bedekken.In deze studie werden de microfluïde en millifluïde apparaten gebruikt om bacteriële chemotactische respons en accumulatieprofielen te bestuderen onder dynamische voedingsomstandigheden. Maximale intensiteitsprojecties tonen de bacteriële positie, aangegeven door witte sporen, over een interval van 0,5 seconden onmiddellijk na de pulsafgifte en 40 seconden na de pulsontslag. De bacteriële trajecten werden ook weergegeven in het zwart 60 seconden na de puls release.Het schaduwrijke gebied vertegenwoordigt de chemische impuls die door fotolyse op tijd nul seconde in het midden van het gebied van mening wordt vrijgegeven, dat later verspreidde. De bacteriële concentratie, evenals de temporele dynamica van de radiale afwijkingssnelheid na een impulsversie in het centrum van het gezichtsveld worden hier getoond. Negatieve waarden van de driftsnelheid komen overeen met gerichte chemotactische beweging naar het midden van de puls.Zwemstatistieken worden hier gepresenteerd voor een bacteriële populatie bij afwezigheid van chemische gradiënten. Trajecten vertegenwoordigen de tweedimensionale projecties van de driedimensionale bacteriële beweging in het microkanaal. De waarschijnlijkheidsverdeling van gemeten bacteriële het zwemmen snelheid werd geschikt door een gammadistributie.Uit de bacteriële trajecten werd de waarschijnlijkheidsverdeling van de tijd tussen opeenvolgende heroriëntaties geëxtraheerd. Het heroriëntatiepatroon, de verdeling van de zwemsnelheid en de heroriëntatiestatistieken van de organismen werden gebruikt om een individueel gebaseerd model te informeren. Deze methode is getest op de mariene bacteriën Vibrio ordalii het uitvoeren van chemotaxi's in de richting van het aminozuur glutamaat, maar de voorgestelde methode is in grote lijnen toepasbaar op verschillende combinatie van soorten en chemoattractants, evenals op biologische processen buiten chemotaxis, zoals populatie en gemeenschapsdynamiek in ruimtelijk heterogene en dynamische omstandigheden.Klassieke technieken in microbiële ecologie en microbiologie, zoals gezwellen in batchculturen of chemostats, hebben de spatio-temporele kenmerken van microbiële habitats grotendeels genegeerd. De bijna-onmiddellijke creatie van chemische pulsen op de microschalen door middel van fotolyse heeft tot doel het type nutriëntenpulsen te reproduceren dat mariene bacteriën in het wild tegenkomen uit verschillende bronnen, bijvoorbeeld de verspreiding van pluimen achter zinkende organische deeltjes of de voedingsstof die zich verspreidt uit lysed fytoplanktoncellen. De aminosilane oplossing is acuut giftig en moet met uiterste zorg worden behandeld.We werken uitsluitend onder de rookkap en dragen beschermende apparatuur zoals labcoat, veiligheidsbril en handschoenen. We zorgen ook voor het afval dat we hebben gegenereerd.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Micropatterned Oppervlakken aan hyaluronzuur Interacties met kanker cellen te bestuderen

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Synthese van een inteïne gemedieerde Kunstmatige Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Gecontroleerde Microfluïdische Milieu voor Dynamic Onderzoek van Red Blood Cell Aggregation

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A Novel Bioreactor voor High Density Teelt van Diverse microbiële gemeenschappen

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Wisselend magneetveld-Responsive Hybrid Gelatine Microgels voor Controlled Drug release

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Uitbreiding van nanopatterned Substrates met steek Techniek voor Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modelleren van eierstokkanker Meercellige Sferoïde Gedrag in een dynamische 3D peritoneale microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

Milieu dynamische mechanische analyse te voorspellen de verzachtende werking van neurale implantaten

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Stapsgewijs cel zaaien opssellated steigers om ontkiemende bloedvaten te bestuderen

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...