Name: generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00
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Les auteurs remercient l'installation de microfabrication FIRST de l'ETH Zurich. Ce travail a été soutenu par un Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (à D.R.B.), un Gordon and Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (à R.S.), et une subvention de la Swiss National Science Foundation 1-002745-000 (à R.S.).

1. Fabrication du dispositif microfluidique pour l'expérience à impulsion chimique unique
<ol><li>Concevez le canal à l'aide d'un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAD) et imprimez-le sur un film de transparence pour créer le masque photo (Figure 1A).</li>
	<li>Fabriquer le maître par lithographie douce (dans des conditions de chambre propre).<ol>
<li>Nettoyer une plaquette de silicium (4 pouces) en succession rapide avec de l'acétone, du méthanol et ...

<ol>
	<li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of the chemotactic response. , (1991).</li><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+structuring+of+marine+ecosystems.">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li><li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., Gonz&#225;lez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+recyclers:+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms.">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li><li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+diversity+modulates+population+performance.">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).</li><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients.">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+compounds:+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology.">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li><li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds:+New+tools+for+cellular+physiology.">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signal+integration+in+bacteria.">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li><li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal.">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li><li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus.">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li><li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes.">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985 (2015).</li><li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients.">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices.">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).</li><li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes.">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li><li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel,+fast+caged+neurotransmitters.">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li><li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm:+Photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li><li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T=298.15K.">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li><li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+properties+of+seawater:+a+review+of+existing+correlations+and+data.">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li><li>. Nikon depth of field calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019)</li><li>Ki&#248;rboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates:+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters.">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li><li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria.">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li><li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches.">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li><li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap.">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior.">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li><li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels.">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li></ol>

Cette méthode permet aux chercheurs d'étudier les chimiotaxis bactériens sous des gradients dynamiques contrôlés dans des dispositifs micro et millifluidiques, permettant l'acquisition de données reproductibles. La création quasi instantanée d'impulsions chimiques à l'échelle micrométrique par photolyse vise à reproduire les types d'impulsions nutritives que les bactéries rencontrent à l'état sauvage à partir d'une gamme de sources, par exemple, la diffusion diffuse des panaches derrière les particules m...

Les microbes s'appuient sur la chimiotaxie, le processus de détection des gradients chimiques et la modification de la motilité en réponse1, pour naviguer dans les paysages chimiques, approcher les sources nutritives et les hôtes, et échapper aux substances nocives. Ces processus à l'échelle micrométrique déterminent la cinétique macro-échelle des interactions entre les microbes et leur environnement2,3. Les progrès récents dans les technologies de microfluidique et de microfabrication, y compris la lithographie douce4, ont révolutionné notre capacité à créer des microenvironnements contrôlés dans lesquels étudier les interactions des microbes. Par exemple, des expériences antérieures ont étudié la chimiotaxie bactérienne en générant des gradients stables et hautement contrôlés de concentrations de nutriments intermédiaires à élevés5,6. Cependant, dans les environnements naturels, les gradients chimiques à l'échelle micrométrique peuvent être de courte durée, dissipées par la diffusion moléculaire, et les conditions de fond sont souvent très diluées7. Pour mesurer directement la réponse chimiothérapeutique des populations microbiennes d'abord exposées à des environnements chimiques instables, nous avons conçu et décrit ici des méthodes pour combiner la technologie microfluidique avec la photolyse, imitant ainsi les gradients que les bactéries sauvages rencontrent dans la nature.
La technologie de déballage utilise des sondes sensibles à la lumière qui encapsulent fonctionnellement des biomolécules sous une forme inactive. L'irradiation libère la molécule en cage, permettant la perturbation ciblée d'un processus biologique8. En raison du contrôle rapide et précis de la chimie cellulaire que le démantèle permet9, la photolyse des composés en cage a traditionnellement été utilisé par les biologistes, les physiologistes et les neuroscientifiques pour étudier l'activation des gènes10, canaux ioniques11, et les neurones12. Plus récemment, les scientifiques ont mis à profit les avantages significatifs de la photolyse pour étudier la chimiotaxie13, pour déterminer la dynamique de commutation de flagelle des cellules bactériennes individuelles exposées à un stimulus chimioattractant étape14,15, et d'étudier les modèles de motilité des spermatozoïdes simples dans les gradients tridimensionnels (3D)16.
Dans notre approche, nous mettons en œuvre la photolyse des acides aminés en cage dans les dispositifs microfluidiques pour étudier la réponse comportementale d'une population bactérienne aux impulsions chimiques commandées, qui deviennent presque instantanément disponibles par photorelease. L'utilisation d'un objectif de faible grossissement (4x) (NA - 0,13, profondeur de mise au point d'environ 40 m) permet à la fois l'observation de la réponse agrégative au niveau de la population de milliers de bactéries sur un grand champ de vision (3,2 mm x 3,2 mm), et la mesure du mouvement au niveau d'une seule cellule. Nous présentons deux applications de cette méthode : 1) la libération d'une impulsion chimique unique pour étudier la dynamique bactérienne d'accumulation-dissipation à partir de conditions uniformes, et 2i) la libération des impulsions multiples pour caractériser la dynamique d'accumulation bactérienne dans des conditions de chimioattractant séquentitentes et spatialement variables et spatialement. Cette méthode a été testée sur la bactérie marine Vibrio ordalii effectuant des chimiotaxis vers le glutamate d'acide aminé17, mais la méthode est largement applicable à différentes combinaisons d'espèces et de chimioattractants, ainsi qu'à des processus biologiques au-delà de la chimiotaxie (p. ex., absorption des nutriments, exposition aux antibiotiques, détection du quorum). Cette approche promet d'aider à élucider l'écologie et le comportement des micro-organismes dans des environnements réalistes et de découvrir les compromis cachés auxquels les bactéries individuelles sont confrontées lorsqu'elles naviguent dans des gradients dynamiques éphémères.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>&#62;98% purity, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>to eliminate spent media from the bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubators Incu-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>390-0384</td>
			<td>to bake 3D master</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duster</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>16650-22</td>
			<td>to clean the wafer and microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>444-0601</td>
			<td>to bond the microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSafe micro centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688312</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>for image analysis and bacterial tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>631-1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon Eclipse TiE</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td>with motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNI-Glutamate</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1490</td>
			<td>&#62;98 % purity, photosensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing equipment</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Objet30 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing service</td>
			<td>3D Printing Studios</td>
			<td>Custom</td>
			<td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>to calibrate the uncaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscope Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven Venti-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>466-3516</td>
			<td>to bake PDMS (with forced convection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8-3050</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU8-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma chamber Zepto</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO-1</td>
			<td>to functionalize the surfaces before bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCT0447100</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size, 19 % open area, 24 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene microtubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>I.D. x O.D.: 0.015&#34; x 0.043&#34; / 0.38mm x 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>611-2605</td>
			<td>to weight PDMS mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Andor Zyla</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Product No. SS1-160p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2015</td>
			<td>Dassault Systemes SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td>Used to design the mold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencolor</td>
			<td></td>
			<td>for LED 395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>110-41-155</td>
			<td>PDMS Si Elastomer Kit; curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Luer-Lok)</td>
			<td>B Braun Omnifix</td>
			<td>4616308F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Needle</td>
			<td>Agani</td>
			<td>A228</td>
			<td>from 10 to 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump 11 Pico Plus Elite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroGrey</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Dual Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Mold Material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior

Nous démontrons une méthode pour la génération des impulsions chimiques contrôlées et dynamiques, où le chimioattractant localisé devient soudainement disponible à l'échelle micro-pour créer des micro-environnements pour des expériences microbiennes de chimiotaxis. Pour créer des impulsions chimiques, nous avons développé un système pour introduire des sources d'acides aminés quasi-instantanément par photolyse d'acides aminés en cage dans une chambre microfluidique de polydiméthylsiloxane (PDMS) contenant une suspension bactérienne. Nous avons appliqué cette méthode à la bactérie chimiotaxique, Vibrio ordalii, qui peut gravir activement ces gradients chimiques dynamiques tout en étant suivi par microscopie vidéo. Les acides aminés, rendus biologiquement inertes («caged») par modification chimique avec un groupe de protection photomovible, sont uniformément présents dans la suspension, mais pas disponibles pour la consommation jusqu'à leur libération soudaine, qui se produit à des points définis par l'utilisateur dans le temps et l'espace au moyen d'un faisceau LED axé sur les UV-A. Le nombre de molécules libérées dans l'impulsion peut être déterminé par une relation d'étalonnage entre le temps d'exposition et la fraction non-curation, où le spectre d'absorption après la photolyse est caractérisé par l'utilisation de la spectroscopie UV-Vis. Une membrane de polycarbonate nanoporeux (PCTE) peut être intégrée dans le dispositif microfluidique pour permettre l'élimination continue par l'écoulement des composés non encages et du support usé. Un lien fort et irréversible entre la membrane PCTE et la structure microfluidique PDMS est atteint en enrobant la membrane d'une solution de 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) suivie d'une activation plasmatique des surfaces à cautionr. Un système contrôlé par ordinateur peut générer des séquences d'impulsions définies par l'utilisateur à différents endroits et avec des intensités différentes, de manière à créer des paysages de ressources avec la variabilité spatiale et temporelle prescrite. Dans chaque paysage chimique, la dynamique du mouvement bactérien à l'échelle individuelle et leur accumulation au niveau de la population peuvent être obtenues, permettant ainsi la quantification de la performance chimiothérapeutique et ses effets sur les agrégations bactériennes dans des environnements écologiquement pertinents.

Nous avons utilisé les dispositifs microfluidiques et millifluidiques (Figure 1) pour étudier les profils d'accumulation bactérienne dans des conditions nutritives dynamiques. Les trajectoires bactériennes ont été extraites de vidéos enregistrées acquises par microscopie de contraste de phase de la dynamique accumulation-dissipation d'une population bactérienne à la suite d'une impulsion chimique libérée par photolyse(figure 2 et <strong class="xfig"...

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Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Un protocole pour la génération de paysages chimiques dynamiques par photolyse dans des configurations microfluidiques et millifluidiques est présenté. Cette méthodologie est appropriée pour étudier divers processus biologiques, y compris le comportement motile, l'absorption des nutriments, ou l'adaptation aux produits chimiques des micro-organismes, à la fois au niveau de la cellule unique et au niveau de la population.

Générer des paysages chimiques contrôlés et dynamiques pour étudier le comportement microbien

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Cette méthode permet d’élucider l’écologie microscale et le comportement des micro-organismes naviguant dans les gradients chimiques dynamiques et de découvrir leurs compromis cachés, leur cinétique nutritive et leur dynamique des populations dans des microenvironnements écologiquement pertinents. En combinant la technologie microfluidique avec la photolyse, nous générons des impulsions chimiques contrôlées, où le chimioattractant localisé devient soudainement disponible à l’échelle micrométrique, pour mesurer la réponse chimiootactic des populations microbiennes d’abord exposées à des gradients chimiques instables. Concevez le canal à l’aide d’un logiciel CAO et imprimez-le sur un film transparent pour créer le masque photo.Fabriquez le maître par lithographie douce dans une pièce propre, selon le manuscrit. Préparer un mélange PDMS en combinant l’élastomer avec son agent de séchage à un rapport de 10 pour un dans un bécher de 40 millilitres. À l’aide d’un couteau en plastique, mélanger vigoureusement jusqu’à ce que le liquide soit homogène.Dégazer immédiatement le mélange PDMS dans une chambre à vide pendant 45 minutes à température ambiante. Pour accélérer le processus, relâchez périodiquement le vide afin d’éclater les bulles qui se forment à l’interface. Retirer la poussière de la surface du maître à l’aide d’un nettoyant pressurisé.Verser ensuite le mélange de PDMS dégazé sur le maître et le cuire au four à 80 degrés Celsius pendant deux heures. Couper le PDMS avec une lame autour des microstructures à une distance d’environ cinq millimètres, puis peler soigneusement le PDMS du maître. Percer des trous pour servir d’entrée et de sortie du microcanal.Sceller le microcanal avec du ruban adhésif pour éviter l’accumulation de poussière. Concevez la forme 3D à l’aide d’un logiciel de conception 3D et imprimez le maître pour le moule PDMS avec une imprimante 3D haute résolution. Après avoir préparé et dégazé le mélange PDMS comme cela a été fait précédemment, nettoyez la surface du maître en tamponnant avec du ruban adhésif.Mettez le maître sur une échelle. Ensuite, tout en évitant la région centrale du maître, versez 23,4 grammes de mélange PDMS non durci afin d’obtenir la hauteur désirée de PDMS en faisant correspondre la hauteur du maître à 0,5 millimètre. Retirez les bulles restantes à l’aide d’air comprimé.Placer le PDMS jeté sur le maître dans un four à 45 degrés Celsius pour cuire au moins 12 heures. Ensuite, décollez doucement la couche de PDMS durcie, et perforez les trous d’entrée et de sortie pour l’injection de la suspension bactérienne. Activez à la fois la surface d’une boîte de Pétri et le moule PDMS avec du plasma d’oxygène pendant deux minutes.Lier le moule PDMS sur la boîte de Petri en appuyant doucement sur le moule à la boîte de Pétri. Évitez de presser l’endroit où se trouvent les caractéristiques. Placer la boîte de Pétri collée au moule PDMS 3D dans un four à 45 degrés Celsius pendant au moins 12 heures pour renforcer le lien chimique.Ensuite, activez la membrane nanoporeuse en polycarbonate dans une chambre plasmatique à oxygène pendant une minute à température ambiante. Sous un capot chimique, diluer une solution commerciale de 3 aminopropyltriethoxysilane dans l’eau déionisée à 1% en volume à l’aide d’un tube de polypropylène. Transférer la solution diluée de 3 aminopropyltriethoxysilane dans une boîte de Pétri et plonger la membrane activée dans la solution 3-aminopropyltriethoxysilane pendant 20 minutes.Ensuite, retirez la membrane de la solution 3-aminopropyltriethoxysilane avec des pinces à épiler, et placez-la sur un lingette de pièce propre pour sécher. Pour la fabrication des canaux microfluidiques PDMS qui se trouveront sur la membrane et permettront le lavage de l’arène bactérienne, répétez la fabrication du dispositif microfluidique pour l’expérience d’impulsion chimique unique comme cela a été fait précédemment. Pour lier les canaux de lavage PDMS à la membrane fonctionnalisée, activez d’abord le canal de lavage PDMS et la membrane en polycarbonate avec une chambre plasmatique à oxygène pendant deux minutes.Immédiatement après le traitement au plasma, mettre en contact la membrane fonctionnalisée et le canal de lavage PDMS en appuyant doucement sur le canal de lavage PDMS sur la membrane. Il est important de presser doucement ensemble le PDMS et la membrane, ou la membrane pourrait être irréversiblement collée au plafond du microcanal PDMS de 200 micromètres de hauteur. Ensuite, activez à la fois la membrane de polycarbonate de canal de lavage PDMS collée et le moule PDMS 3D précédemment collé à la boîte de Petri en les plaçant dans une chambre plasmatique à oxygène pendant deux minutes.Sandwich de la membrane entre deux couches PDMS, et appuyez ensemble. Placer la boîte de Pétri collée à la structure du sandwich dans un four à 45 degrés Celsius pendant au moins 12 heures pour renforcer le lien chimique. Pour commencer, maintenir la chambre millifluidique sous vide pendant 20 minutes.Ensuite, placez la boîte de Pétri contenant la chambre millifluidique sur une scène de microscope. À l’aide d’une pipette, remplir la chambre sous la membrane de la suspension bactérienne diluée du Vibrio ordalii fluorescent GFP dans une solution 4-méthoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamate dans l’eau de mer artificielle. Après avoir rempli le canal avec la suspension bactérienne, sucer la solution en excès avec une serviette en papier, et sceller l’entrée et la sortie avec des bouchons PDMS en les appuyant doucement dans les trous.Remplissez une seringue d’une solution artificielle d’eau de mer d’un millimolaire 4-methoxy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamate, et fixez le tube à l’entrée et à la sortie du canal de lavage au-dessus de la membrane. Connectez le tube à un réservoir de déchets et assurez-vous que le tube est entièrement immergé dans le réservoir de déchets liquides afin d’éviter les oscillations de pression. Réglez le débit de la pompe à seringues à 50 microlitres par minute.Démarrez la pompe à seringues pour établir le débit dans le canal de lavage au-dessus de la membrane. Démarrez le logiciel contrôlant le faisceau LED et l’étape du microscope, et générer des séquences définies par l’utilisateur d’impulsions à différents endroits et avec des intensités différentes. Enregistrez la vidéo à l’aide d’un objectif 4x à intervalles réguliers sur une période de plusieurs heures et sur plusieurs endroits contigus pour couvrir une grande surface.Dans cette étude, les dispositifs microfluidiques et millifluidiques ont été utilisés pour étudier la réponse chemotactique bactérienne et les profils d’accumulation dans des conditions nutritives dynamiques. Les projections d’intensité maximale montrent la position bactérienne, indiquée par des traces blanches, sur un intervalle de 0,5 seconde immédiatement après la libération de l’impulsion et 40 secondes après la libération de l’impulsion. Les trajectoires bactériennes ont également été montrées en noir 60 secondes après la libération de l’impulsion.La région ombragée représente l’impulsion chimique libérée par photolyse à l’époque zéro seconde au milieu du champ de vision, qui s’est ensuite diffusée. La concentration bactérienne, ainsi que la dynamique temporelle de la vitesse de dérive radiale suite à une libération d’impulsion au centre du champ de vision sont montrés ici. Les valeurs négatives de la vitesse de dérive correspondent au mouvement chemotactic dirigé vers le centre de l’impulsion.Les statistiques de natation sont présentées ici pour une population bactérienne en l’absence de gradients chimiques. Les trajectoires représentent les projections bidimensionnelles du mouvement bactérien tridimensionnel dans le microcanal. La distribution de probabilité de la vitesse bactérienne mesurée de natation a été adaptée par une distribution gamma.Des trajectoires bactériennes, la répartition des probabilités du temps entre les réorientations successives a été extraite. Le modèle de réorientation, la répartition de la vitesse de nage et les statistiques de réorientation des organismes ont été utilisés pour éclairer un modèle individuel. Cette méthode a été testée sur la bactérie marine Vibrio ordalii effectuant des chimiotaxis vers le glutamate aux acides aminés, mais la méthodologie proposée s’applique largement à différentes combinaisons d’espèces et de chimioattractants, ainsi qu’aux processus biologiques au-delà de la chimiotaxis, tels que la dynamique de la population et de la communauté dans des conditions spatialement hétérogènes et dynamiques.Les techniques classiques d’écologie microbienne et de microbiologie, telles que les croissances dans les cultures par lots ou les chemostats, ont largement ignoré les caractéristiques spatio-temporelles des habitats microbiens. La création quasi instantanée d’impulsions chimiques aux microscales par photolyse vise à reproduire le type d’impulsions nutritives que les bactéries marines rencontrent à l’état sauvage à partir d’un éventail de sources, par exemple, la propagation diffusive des panaches derrière l’enfoncement de particules organiques ou la propagation des nutriments à partir de cellules phytoplanctoniques lysées. La solution d’aminosilane est extrêmement toxique et doit être manipulée avec un soin extrême.Nous travaillons exclusivement sous le capot de fumée et portons l’équipement protecteur comme le manteau de laboratoire, les lunettes de sécurité, et les gants. Nous nous occupons également des déchets que nous avons générés.

Research

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