Name: generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00
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Die Autoren danken der FIRST Mikrofabrikation an der ETH Zürich. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (nach D.R.B.), einen Gordon and Betty Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (nach R.S.) und ein Stipendium der Swiss National Science Foundation. 1-002745-000 (nach R.S.).

1. Herstellung des Mikrofluidischen Geräts für das Einzel-Chemie-Puls-Experiment
<ol><li>Entwerfen Sie den Kanal mithilfe der CAD-Software (Computer-Aided Design), und drucken Sie ihn auf einen Transparenzfilm, um die Fotomaske zu erstellen (Abbildung 1A).</li>
	<li>Fertigen Sie den Meister durch weiche Lithographie (unter Reinraumbedingungen).<ol>
<li>Einen Siliziumwafer (4 Zoll) in schneller Folge mit Aceton, Methanol und Isopropanol reinigen, dann mit Stickstoff trock...

<ol>
	<li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of the chemotactic response. , (1991).</li><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+structuring+of+marine+ecosystems.">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li><li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., Gonz&#225;lez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+recyclers:+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms.">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li><li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+diversity+modulates+population+performance.">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).</li><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients.">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+compounds:+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology.">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li><li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds:+New+tools+for+cellular+physiology.">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signal+integration+in+bacteria.">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li><li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal.">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li><li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus.">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li><li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes.">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985 (2015).</li><li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients.">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices.">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).</li><li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes.">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li><li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel,+fast+caged+neurotransmitters.">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li><li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm:+Photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li><li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T=298.15K.">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li><li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+properties+of+seawater:+a+review+of+existing+correlations+and+data.">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li><li>. Nikon depth of field calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019)</li><li>Ki&#248;rboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates:+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters.">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li><li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria.">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li><li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches.">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li><li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap.">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior.">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li><li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels.">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li></ol>

Diese Methode ermöglicht es Forschern, bakterielle Chemotaxis unter kontrollierten, dynamischen Gradienten in mikro- und millifluidischen Geräten zu untersuchen und so eine reproduzierbare Datenerfassung zu ermöglichen. Die nahezu sofortige Erzeugung chemischer Impulse im Mikromaßstab durch Photolyse zielt darauf ab, die Arten von Nährstoffpulsen, denen Bakterien in freier Wildbahn begegnen, aus einer Reihe von Quellen zu reproduzieren, zum Beispiel die diffusive Ausbreitung von Pflaumen hinter sinkenden Meeresparti...

Mikroben verlassen sich auf Chemotaxis, den Prozess der Erkennung chemischer Gradienten und Modifizieren der Beweglichkeit in Reaktion1, um chemische Landschaften zu navigieren, Nährstoffquellen und Wirte zu nähern und schädlichen Substanzen zu entkommen. Diese mikroskalen Prozesse bestimmen die makroskalige Kinetik der Wechselwirkungen zwischen Mikroben und ihrer Umgebung2,3. Jüngste Fortschritte in der Mikrofluidik und Mikrofabrikationstechnologien, einschließlich der weichen Lithographie4, haben unsere Fähigkeit revolutioniert, kontrollierte Mikroumgebungen zu schaffen, in denen die Wechselwirkungen von Mikroben untersucht werden können. Zum Beispiel haben frühere Experimente bakterielle Chemotaxis untersucht, indem hochkontrollierte, stabile Gradienten von mittleren bis hohen Nährstoffkonzentrationen5,6erzeugt wurden. In natürlichen Umgebungen können jedoch mikroskalige chemische Gradienten kurzlebig sein, die durch molekulare Diffusion abgeführt werden, und die Hintergrundbedingungen sind oft stark verdünnt7. Um die chemotaktische Reaktion von mikrobiellen Populationen, die zuerst in stabilen chemischen Umgebungen ausgesetzt waren, direkt zu messen, haben wir Methoden entwickelt und hier beschrieben, um mikrofluidische Technologie mit Photolyse zu kombinieren und dabei Gradienten nachzuahmen, denen wilde Bakterien in der Natur begegnen.
Die Unkaging-Technologie verwendet lichtempfindliche Sonden, die Biomoleküle funktionell in inaktiver Form verkapseln. Die Bestrahlung setzt das Käfigmolekül frei, wodurch die gezielte Störung eines biologischen Prozessesermöglicht wird 8. Aufgrund der schnellen und präzisen Kontrolle der zellulären Chemie, die die Unkaging bietet9, Photolyse von Käfigverbindungen wurde traditionell von Biologen, Physiologen und Neurowissenschaftlern verwendet, um die Aktivierung der Gene10, Ionenkanäle11, und Neuronen12zu studieren. In jüngerer Zeit haben Wissenschaftler die signifikanten Vorteile der Photolyse genutzt, um Chemotaxis13zu untersuchen, um die Flagella-Schaltdynamik einzelner Bakterienzellen zu bestimmen, die einem stufenweisen Chemolockantenreiz14,15, ausgesetzt sind, und um Motilitätsmuster einzelner Spermien in dreidimensionalen (3D) Gradienten16zu untersuchen.
In unserem Ansatz implementieren wir die Photolyse von Käfig-Aminosäuren in mikrofluidischen Geräten, um die Verhaltensreaktion einer bakterienpopulation auf kontrollierte chemische Impulse zu untersuchen, die durch Photorelease nahezu sofort verfügbar werden. Die Verwendung eines objektiven Objektivs mit geringer Vergrößerung (4x) (NA = 0,13, Schwerpunkttiefe ca. 40 m) ermöglicht sowohl die Beobachtung der aggregationiven Reaktion von Tausenden von Bakterien auf Populationsebene über ein großes Sichtfeld (3,2 mm x 3,2 mm) als auch die Messung der Bewegung auf Einzelzellebene. Wir stellen zwei Anwendungen dieser Methode vor: 1) die Freisetzung eines einzelnen chemischen Impulses zur Untersuchung der bakteriellen Akkumulations-Dissipationsdynamik ausgehend von einheitlichen Bedingungen und 2i) die Freisetzung mehrerer Impulse, um die bakterielle Akkumulationsdynamik unter zeitverändernden, räumlich heterogenen Chemopitantenbedingungen zu charakterisieren. Diese Methode wurde an den Meeresbakterien Vibrio ordalii getestet, die Chemotaxis in Richtung der Aminosäure Glutamat17durchführen, aber die Methode ist allgemein anwendbar auf verschiedene Kombinationen von Arten und Chemoattractants, sowie auf biologische Prozesse jenseits von Chemotaxis (z. B. Nährstoffaufnahme, Antibiotika-Exposition, Quorum-Erkennung). Dieser Ansatz verspricht dabei, die Ökologie und das Verhalten von Mikroorganismen in realistischen Umgebungen aufzuklären und die versteckten Kompromisse aufzudecken, denen einzelne Bakterien beim Navigieren in flüchtigen dynamischen Gradienten ausgesetzt sind.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>&#62;98% purity, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>to eliminate spent media from the bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubators Incu-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>390-0384</td>
			<td>to bake 3D master</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duster</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>16650-22</td>
			<td>to clean the wafer and microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>444-0601</td>
			<td>to bond the microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSafe micro centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688312</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>for image analysis and bacterial tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>631-1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon Eclipse TiE</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td>with motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNI-Glutamate</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1490</td>
			<td>&#62;98 % purity, photosensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing equipment</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Objet30 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing service</td>
			<td>3D Printing Studios</td>
			<td>Custom</td>
			<td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>to calibrate the uncaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscope Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven Venti-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>466-3516</td>
			<td>to bake PDMS (with forced convection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8-3050</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU8-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma chamber Zepto</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO-1</td>
			<td>to functionalize the surfaces before bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCT0447100</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size, 19 % open area, 24 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene microtubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>I.D. x O.D.: 0.015&#34; x 0.043&#34; / 0.38mm x 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>611-2605</td>
			<td>to weight PDMS mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Andor Zyla</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Product No. SS1-160p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2015</td>
			<td>Dassault Systemes SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td>Used to design the mold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencolor</td>
			<td></td>
			<td>for LED 395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>110-41-155</td>
			<td>PDMS Si Elastomer Kit; curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Luer-Lok)</td>
			<td>B Braun Omnifix</td>
			<td>4616308F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Needle</td>
			<td>Agani</td>
			<td>A228</td>
			<td>from 10 to 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump 11 Pico Plus Elite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroGrey</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Dual Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Mold Material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior

Wir demonstrieren eine Methode zur Erzeugung kontrollierter, dynamischer chemischer Impulse, bei denen lokalisiertes Chemoattractant plötzlich auf mikroscale verfügbar wird, um Mikroumgebungen für mikrobielle Chemotaxis-Experimente zu schaffen. Um chemische Impulse zu erzeugen, haben wir ein System entwickelt, um Aminosäurequellen nahezu augenblicklich durch Photolyse von Käfig-Aminosäuren in einer polydimethylsiloxanen (PDMS) Mikrofluidkammer einzuführen, die eine bakterielle Suspension enthält. Wir haben diese Methode auf das chemotaktische Bakterium Vibrio ordaliiangewendet, das diese dynamischen chemischen Gradienten aktiv erklimmen kann, während es durch Videomikroskopie verfolgt wird. Aminosäuren, die durch chemische Modifikation mit einer photoabnehmbaren Schutzgruppe biologisch inert ("käfig") gerendert werden, sind in der Suspension einheitlich vorhanden, können aber bis zu ihrer plötzlichen Freisetzung, die zu benutzerdefinierten Zeitpunkten in Zeit und Raum mit Hilfe eines nahezu UV-A fokussierten LED-Strahls erfolgt, nicht zum Verzehr stehen. Die Anzahl der im Puls freigesetzten Moleküle kann durch eine Kalibrierbeziehung zwischen Belichtungszeit und unkaging fraktion bestimmt werden, wobei das Absorptionsspektrum nach der Photolyse durch UV-Vis-Spektroskopie gekennzeichnet ist. Eine nanoporöse Polycarbonatmembran (PCTE) kann in das mikrofluidische Gerät integriert werden, um die kontinuierliche Entfernung der ungecaged Compounds und der verbrauchten Medien durch den Fluss zu ermöglichen. Eine starke, irreversible Verbindung zwischen der PCTE-Membran und der mikrofluidischen PdMS-Struktur wird durch Beschichtung der Membran mit einer Lösung aus 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) und anschließender Plasmaaktivierung der zu verklebenden Oberflächen erreicht. Ein computergesteuertes System kann benutzerdefinierte Pulssequenzen an verschiedenen Stellen und mit unterschiedlichen Intensitäten erzeugen, um Ressourcenlandschaften mit vorgeschriebener räumlicher und zeitlicher Variabilität zu schaffen. In jeder chemischen Landschaft kann die Dynamik der bakteriellen Bewegung auf der individuellen Skala und ihre Akkumulation auf Populationsebene erreicht werden, wodurch die Quantifizierung der chemotaktischen Leistung und ihrer Auswirkungen auf bakterielle Aggregationen in ökologisch relevanten Umgebungen ermöglicht wird.

Wir verwendeten die mikrofluidischen und millifluidischen Geräte (Abbildung 1), um bakterielle Akkumulationsprofile unter dynamischen Nährstoffbedingungen zu untersuchen. Bakterielle Flugbahnen wurden aus aufgezeichneten Videos extrahiert, die durch Phasenkontrastmikroskopie der Akkumulations-Ableitungsdynamik einer bakterienpopulation nach einem durch Photolyse freigesetzten chemischen Impuls aufgenommen wurden (Abbildung 2 und Abbildung ...

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Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Ein Protokoll zur Erzeugung dynamischer chemischer Landschaften durch Photolyse in mikrofluidischen und millifluidischen Setups wird vorgestellt. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse, einschließlich des Motilverhaltens, der Nährstoffaufnahme oder der Anpassung an Chemikalien von Mikroorganismen, sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene.

Generieren kontrollierter, dynamischer chemischer Landschaften zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Diese Methode ermöglicht es, die mikroskalige Ökologie und das Verhalten von Mikroorganismen, die dynamische chemische Gradienten navigieren, aufzuklären und ihre versteckten Kompromisse, Nährstoffkinetik und Populationsdynamik in ökologisch relevanten Mikroumgebungen aufzudecken. Durch die Kombination von mikrofluidischer Technologie mit Photolyse erzeugen wir kontrollierte chemische Impulse, bei denen lokalisiertes Chemoattractant plötzlich auf der Mikroskala verfügbar wird, um die chemotaktische Reaktion von mikrobiellen Populationen zu messen, die zuerst unbeständigen chemischen Gradienten ausgesetzt waren. Entwerfen Sie den Kanal mit CAD-Software, und drucken Sie ihn auf einen Transparenzfilm, um die Fotomaske zu erstellen.Fertigen Sie den Meister durch weiche Lithographie in einem rein raum, nach dem Manuskript. Bereiten Sie eine PDMS-Mischung vor, indem Sie das Elastomer mit seinem Härtungsmittel im Verhältnis 10 zu eins in einem 40-Milliliter-Becher kombinieren. Mit einem Kunststoffmesser kräftig mischen, bis die Flüssigkeit homogen ist.Sofortige Entgasen des PDMS-Gemisches in einer Vakuumkammer für 45 Minuten bei Raumtemperatur. Um den Prozess zu beschleunigen, lassen Sie das Vakuum regelmäßig los, um die Blasen zu platzen, die sich an der Schnittstelle bilden. Entfernen Sie Staub von der Oberfläche des Masters mit einem Druckreiniger.Dann gießen Sie die entgaste PDMS-Mischung auf den Meister und backen Sie sie zwei Stunden lang im Ofen bei 80 Grad Celsius. Schneiden Sie das PDMS mit einer Klinge um die Mikrostrukturen in einem Abstand von etwa fünf Millimetern, und schälen Sie das PDMS dann vorsichtig vom Master. Stanzlöcher als Ein- und Auslass des Mikrokanals dienen.Versiegeln Sie den Mikrokanal mit Klebeband, um Staubansammlungen zu verhindern. Entwerfen Sie die 3D-Form mit 3D-Designsoftware, und drucken Sie den Master für die PDMS-Form mit einem hochauflösenden 3D-Drucker. Nach der Vorbereitung und Entgasung der PDMS-Mischung wie zuvor, reinigen Sie die Oberfläche des Masters durch Dabbing mit Klebeband.Setzen Sie den Master auf eine Skala. Dann, während die zentrale Region des Masters zu vermeiden, gießen Sie 23,4 Gramm ungehärtete PDMS-Mischung, um die gewünschte Höhe von PDMS zu erhalten, indem Sie die Höhe des Masters auf 0,5 Millimeter anpassen. Entfernen Sie alle verbleibenden Blasen mit Hilfe von Druckluft.Legen Sie den PDMS auf den Master in einem Ofen bei 45 Grad Celsius, um für mindestens 12 Stunden zu backen. Dann die gehärtete PDMS-Schicht vorsichtig abziehen und Ein- und Auslasslöcher für die Injektion der bakteriellen Suspension bohren. Aktivieren Sie sowohl die Oberfläche einer Petrischale als auch die PDMS-Form mit Sauerstoffplasma für zwei Minuten.Verkleben Sie die PDMS-Form auf der Petrischale, indem Sie die Form vorsichtig auf die Petrischale drücken. Vermeiden Sie es, an der Stelle zu drücken, an der sich die Features befinden. Die Mitdersäsung an die PDMS 3D-Form geklebte Petrischale mindestens 12 Stunden lang in einen Ofen bei 45 Grad Celsius geben, um die chemische Bindung zu stärken.Aktivieren Sie anschließend die nanoporöse Polycarbonatmembran in einer Sauerstoffplasmakammer für eine Minute bei Raumtemperatur. Unter einer chemischen Haube eine kommerzielle Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan in entionisiertem Wasser auf 1% Volumen mit einem Polypropylenrohr verdünnen. Übertragen Sie die verdünnte 3-Aminopropyltriethoxysilan-Lösung in eine Petrischale und tauchen Sie die aktivierte Membran 20 Minuten lang in die 3-Aminopropyltriethoxysilan-Lösung ein.Dann entfernen Sie die Membran aus der 3-Aminopropyltriethoxysilan-Lösung mit einer Pinzette und legen Sie sie auf ein sauberes Raumtuch zum Trocknen. Für die Herstellung der mikrofluidischen PDMS-Kanäle, die auf der Membran liegen und das Waschen der Bakterienarena ermöglichen, wiederholen Sie die Fertigung des mikrofluidischen Geräts für das einzelne chemische Pulsexperiment wie bisher. Um die PDMS-Waschkanäle an die funktionalisierte Membran zu binden, aktivieren Sie zunächst zwei Minuten lang sowohl den PDMS-Waschkanal als auch die Polycarbonatmembran mit einer Sauerstoffplasmakammer.Bringen Sie unmittelbar nach der Plasmabehandlung die funktionalisierte Membran und den PDMS-Waschkanal in Kontakt, indem Sie den PDMS-Waschkanal vorsichtig auf die Membran drücken. Es ist wichtig, das PDMS und die Membran vorsichtig zusammenzudrücken, oder die Membran könnte irreversibel an die Decke des 200-Mikrometer-Mikrokanals PDMS gebunden werden. Aktivieren Sie dann sowohl die gebundene Laminat-PDMS-Waschkanal-Polycarbonatmembran als auch die zuvor mit der Petrischale verklebte 3D-PDMS-Form, indem Sie sie für zwei Minuten in eine Sauerstoffplasmakammer legen.Sandwich endielieren Sie die Membran zwischen zwei PDMS-Schichten, und drücken Sie zusammen. Die Petrischale mindestens 12 Stunden lang mit der Sandwichstruktur in einem Ofen bei 45 Grad Celsius verklebt, um die chemische Bindung zu stärken. Um zu beginnen, halten Sie die Millifluidische Kammer unter Vakuum für 20 Minuten.Legen Sie dann die Petrischale mit der Millifluidischen Kammer auf eine Mikroskopstufe. Mit einer Pipette füllen Sie die Kammer unterhalb der Membran mit der verdünnten bakteriellen Suspension von GFP-fluoreszierenden Vibrio ordalii in einmillimolaren 4-Methoxy-7-Nitroindolinyl-Kaltert-L-Glutamat-Lösung in künstlichem Meerwasser. Nachdem Sie den Kanal mit der bakteriellen Suspension gefüllt haben, saugen Sie die Lösung überzählig mit einem Papiertuch und versiegeln Sie Ein- und Auslass mit PDMS-Steckern, indem Sie sie vorsichtig in die Löcher drücken.Füllen Sie eine Spritze mit einer künstlichen Meerwasserlösung aus einem Millimolaren 4-Methoxy-7-Nitroindolinyl-caged-L-Glutamat, und befestigen Sie Schläuche am Ein- und Auslass des Waschkanals über der Membran. Schließen Sie die Schläuche an ein Abfallreservoir an, und stellen Sie sicher, dass die Schläuche vollständig in das Flüssigkeitsabfallreservoir eingetaucht sind, um Druckschwankungen zu vermeiden. Stellen Sie den Durchfluss an der Spritzenpumpe auf 50 Mikroliter pro Minute ein.Starten Sie die Spritzenpumpe, um den Durchfluss im Waschkanal über der Membran zu ermitteln. Starten Sie die Software, die den LED-Strahl und die Mikroskopstufe steuert, und erzeugen Sie benutzerdefinierte Pulssequenzen an verschiedenen Stellen und mit unterschiedlichen Intensitäten. Zeichnen Sie Videos mit einem 4-fachen Objektiv in regelmäßigen Zeitintervallen über einen Zeitraum von mehreren Stunden und über mehrere zusammenhängende Positionen auf, um eine große Oberfläche abzudecken.In dieser Studie wurden die mikrofluidischen und millifluidischen Geräte verwendet, um bakterielle chemotaktische Reaktions- und Akkumulationsprofile unter dynamischen Nährstoffbedingungen zu untersuchen. Maximale Intensitätsprojektionen zeigen die bakterielle Position, die durch weiße Spuren angezeigt wird, über ein 0,5-Sekunden-Intervall unmittelbar nach der Pulsfreisetzung und 40 Sekunden nach der Pulsfreisetzung. Die bakteriellen Bahnen wurden auch 60 Sekunden nach der Pulsfreisetzung in Schwarz dargestellt.Der schattierte Bereich stellt den chemischen Impuls dar, der durch Photolyse zur Zeit Null Sekunde in der Mitte des Sichtfeldes freigesetzt wird, die sich anschließend diffundierte. Die bakterielle Konzentration sowie die zeitliche Dynamik der radialen Driftgeschwindigkeit nach einer Pulsfreisetzung in der Mitte des Sichtfeldes werden hier dargestellt. Negative Werte der Driftgeschwindigkeit entsprechen der gerichteten chemotaktischen Bewegung in Richtung des Zentrums des Pulses.Schwimmstatistiken werden hier für eine Bakterienpopulation ohne chemische Gradienten vorgestellt. Trajektorien stellen die zweidimensionalen Projektionen der dreidimensionalen bakteriellen Bewegung im Mikrokanal dar. Die Wahrscheinlichkeitsverteilung der gemessenen bakteriellen Schwimmgeschwindigkeit passte durch eine Gammaverteilung.Aus den bakteriellen Bahnen wurde die Wahrscheinlichkeitsverteilung der Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Neuorientierungen extrahiert. Das Neuorientierungsmuster, die Verteilung der Schwimmgeschwindigkeit und die Neuorientierungsstatistiken der Organismen wurden verwendet, um ein individuelles Modell zu informieren. Diese Methode wurde an den Meeresbakterien Vibrio ordalii getestet, die Chemotaxis in Richtung der Aminosäure Glutamat durchführen, aber die vorgeschlagene Methode ist im Großen und Ganzen auf verschiedene Kombinationen von Arten und Chemoattractanten sowie auf biologische Prozesse jenseits von Chemotaxis anwendbar, wie Populations- und Gemeinschaftsdynamik unter räumlich heterogenen und dynamischen Bedingungen.Klassische Techniken in der mikrobiellen Ökologie und Mikrobiologie, wie das Wachstum in Batchkulturen oder Chemostats, haben die räumlich-zeitlichen Eigenschaften mikrobieller Lebensräume weitgehend ignoriert. Die nahezu sofortige Erzeugung chemischer Impulse an den Mikroskalen durch Photolyse zielt darauf ab, die Art von Nährstoffpulsen zu reproduzieren, auf die Meeresbakterien in freier Wildbahn aus einer Reihe von Quellen stoßen, zum Beispiel die diffusive Ausbreitung von Pflaumen hinter sinkenden organischen Partikeln oder die Nährstoffausbreitung aus lysierten Phytoplanktonzellen. Die Aminosilanlösung ist akut toxisch und sollte mit äußerster Sorgfalt behandelt werden.Wir arbeiten ausschließlich unter der Dunstabzugshaube und tragen Schutzausrüstungen wie Labormantel, Schutzbrille und Handschuhe. Wir kümmern uns auch um den Abfall, den wir anfallen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Mikrostrukturierten Oberflächen zum Studium Hyaluronsäure Wechselwirkungen mit Krebszellen

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Forschung

Biotechnik

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Synthese einer Intein-vermittelten Protein-Hydrogel Künstliche

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Controlled Environment Mikrofluidik für dynamische Untersuchung der Aggregation roter Blutzellen

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

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A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Magnetisches Wechselfeld-Responsive Hybrid Gelatine Mikrogele der gezielten Medikamentenapplikation

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Der Ausbau nano Substraten Stichtechnik für Nanotopographical Modulation des Zellverhaltens

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modellierung Ovarian Cancer Vielzellige Sphäroid-Verhalten in einer dynamischen 3D-Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

Ökologische dynamische mechanische Analyse um die Erweichung Verhalten der neuronale Implantate

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Schrittweise Zellaussaat auf tessellierten Gerüsten zur Untersuchung keimender Blutgefäße

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...