Name: generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00
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Gli autori ringraziano la PRIMA struttura di microfabbricazione del PEE di zurighese. Questo lavoro è stato sostenuto da un Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (a D.R.B.), un Gordon and Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (a R.S.), e una sovvenzione della Swiss National Science Foundation 1-002745-000 (a R.S.).

1. Fabbricazione del dispositivo microfluidico per l'esperimento singolo impulso chimico
<ol><li>Progettare il canale utilizzando un software CAD (Computer-Aided Design) e stamparlo su una pellicola trasparente per creare la maschera fotografica (Figura 1A).</li>
	<li>Fabbricare il maestro con litografia morbida (in condizioni di camera pulita).<ol>
<li>Pulire un wafer di silicio (4 pollici) in rapida successione con acetone, metanolo e isopropanolo, quindi asciugare con a...

<ol>
	<li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of the chemotactic response. , (1991).</li><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+structuring+of+marine+ecosystems.">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li><li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., Gonz&#225;lez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+recyclers:+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms.">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li><li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+diversity+modulates+population+performance.">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).</li><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients.">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+compounds:+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology.">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li><li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds:+New+tools+for+cellular+physiology.">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signal+integration+in+bacteria.">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li><li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal.">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li><li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus.">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li><li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes.">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985 (2015).</li><li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients.">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices.">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).</li><li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes.">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li><li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel,+fast+caged+neurotransmitters.">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li><li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm:+Photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li><li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T=298.15K.">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li><li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+properties+of+seawater:+a+review+of+existing+correlations+and+data.">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li><li>. Nikon depth of field calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019)</li><li>Ki&#248;rboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates:+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters.">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li><li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria.">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li><li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches.">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li><li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap.">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior.">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li><li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels.">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li></ol>

Questo metodo consente ai ricercatori di studiare la chemiotassi batterica sotto gradienti controllati e dinamici in dispositivi micro e millifluidi, consentendo l'acquisizione di dati riproducibili. La creazione quasi istantanea di impulsi chimici su microscala mediante fotolisi mira a riprodurre i tipi di legumi nutritivi che i batteri incontrano in natura da una serie di fonti, ad esempio la diffusione diffusa dei pennacchi dietro le particelle marine che affondano25, o il nutriente che si diff...

I microbi si basano sulla chemiotassi, il processo di rilevamento dei gradienti chimici e di modifica della motilità in risposta1,per navigare nei paesaggi chimici, avvicinarsi a fonti di nutrienti e ospiti e sfuggire a sostanze nocive. Questi processi di microscala determinano la cinetica su macroscala delle interazioni tra i microbi e il loro ambiente2,3. I recenti progressi nella microfluidica e nelle tecnologie di microfabbricazione, tra cui la litografia morbida4,hanno rivoluzionato la nostra capacità di creare microambienti controllati in cui studiare le interazioni dei microbi. Ad esempio, esperimenti passati hanno studiato chemiotassi batterici generando gradienti altamente controllati e stabili di concentrazioni di nutrienti intermedi e ad alto5,6. Tuttavia, negli ambienti naturali, i gradienti chimici su microscala possono essere di breve durata, dissipati dalla diffusione molecolare, e le condizioni di fondo sono spesso altamente diluite7. Per misurare direttamente la risposta chemiotattica delle popolazioni microbiche prima esposte ad ambienti chimici instabili, abbiamo ideato e qui descritto metodi per combinare la tecnologia microfluidica con la fotolisi, imitando così i gradienti che i batteri selvatici incontrano in natura.
Uncaging technology impiega sonde sensibili alla luce che incapsulano funzionalmente le biomolecole in forma inattiva. L'irradiazione rilascia la molecola in gabbia, permettendo la perturbazione mirata di un processo biologico8. A causa del controllo rapido e preciso della chimica cellulare che lo sblocco offre9, fotolisi di composti in gabbia è stato tradizionalmente impiegato da biologi, fisiologi e neuroscienziati per studiare l'attivazione dei geni10, canali ionici11, e neuroni12. Più di recente, gli scienziati hanno sfruttato i vantaggi significativi della fotolisi per studiare la chemiotassi13, per determinare la dinamica di commutazione flagella di singole cellule batteriche esposte a uno stimolo chemioattraente passo14,15, e per studiare i modelli di motilità di singole cellule sperometrive in gradienti tridimensionali (3D)16.
Nel nostro approccio, implementiamo la fotolisi di aminoacidi in gabbia all'interno di dispositivi microfluidici per studiare la risposta comportamentale di una popolazione batterica agli impulsi chimici controllati, che diventano quasi istantaneamente disponibili attraverso il photorelease. L'uso di un obiettivo a basso ingrandimento (4x) (NA - 0,13, profondità di messa a fuoco di circa 40 m) consente sia l'osservazione della risposta aggregata a livello di popolazione di migliaia di batteri su un ampio campo visivo (3,2 mm x 3,2 mm), sia la misurazione del movimento a livello di singola cellula. Presentiamo due applicazioni di questo metodo: 1) il rilascio di un singolo impulso chimico per studiare la dinamica di accumulo batterico-dissipazione a partire da condizioni uniformi, e 2i) il rilascio di impulsi multipli per caratterizzare la dinamica di accumulo batterico in condizioni chemoaattrazionli eterogenee nel tempo. Questo metodo è stato testato sui batteri marini Vibrio ordalii che eseguono chemiotassi verso il glutammato aminoacido17, ma il metodo è ampiamente applicabile a diverse combinazioni di specie e chemioattraenti, nonché ai processi biologici oltre la chemiotassi (ad esempio, assorbimento di nutrienti, esposizione agli antibiotici, quorum sensing). Questo approccio promette di aiutare a chiarire l'ecologia e il comportamento dei microrganismi in ambienti realistici e di scoprire i compromessi nascosti che i singoli batteri affrontano durante la navigazione nei gradienti dinamici effimeri.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>&#62;98% purity, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>to eliminate spent media from the bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubators Incu-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>390-0384</td>
			<td>to bake 3D master</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duster</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>16650-22</td>
			<td>to clean the wafer and microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>444-0601</td>
			<td>to bond the microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSafe micro centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688312</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>for image analysis and bacterial tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>631-1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon Eclipse TiE</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td>with motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNI-Glutamate</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1490</td>
			<td>&#62;98 % purity, photosensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing equipment</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Objet30 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing service</td>
			<td>3D Printing Studios</td>
			<td>Custom</td>
			<td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>to calibrate the uncaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscope Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven Venti-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>466-3516</td>
			<td>to bake PDMS (with forced convection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8-3050</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU8-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma chamber Zepto</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO-1</td>
			<td>to functionalize the surfaces before bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCT0447100</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size, 19 % open area, 24 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene microtubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>I.D. x O.D.: 0.015&#34; x 0.043&#34; / 0.38mm x 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>611-2605</td>
			<td>to weight PDMS mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Andor Zyla</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Product No. SS1-160p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2015</td>
			<td>Dassault Systemes SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td>Used to design the mold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencolor</td>
			<td></td>
			<td>for LED 395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>110-41-155</td>
			<td>PDMS Si Elastomer Kit; curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Luer-Lok)</td>
			<td>B Braun Omnifix</td>
			<td>4616308F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Needle</td>
			<td>Agani</td>
			<td>A228</td>
			<td>from 10 to 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump 11 Pico Plus Elite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroGrey</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Dual Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Mold Material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior

Dimostriamo un metodo per la generazione di impulsi chimici controllati e dinamici, dove il chemoattractant localizzato diventa improvvisamente disponibile su microscala, per creare micro-ambienti per esperimenti microbici chemiotassi. Per creare impulsi chimici, abbiamo sviluppato un sistema per introdurre le fonti di amminoacidi quasi istantaneamente mediante fotolisi di amminoacidi in gabbia all'interno di una camera microfluidica polidimetilsiloxana (PDMS) contenente una sospensione batterica. Abbiamo applicato questo metodo al batterio chemiotattico, Vibrio ordalii, che può scalare attivamente questi gradienti chimici dinamici mentre viene tracciato dalla microscopia video. Gli amminoacidi, resi biologicamente inerediti ('ingabbiati') dalla modifica chimica con un gruppo di protezione fotoriamo, sono uniformemente presenti nella sospensione ma non sono disponibili per il loro rilascio improvviso, che si verifica in punti di tempo e spazio definiti dall'utente mediante un fascio LED climatizzato vicino all'UV-A. Il numero di molecole rilasciate nell'impulso può essere determinato da una relazione di calibrazione tra il tempo di esposizione e la frazione disidratazione, dove lo spettro di assorbimento dopo la fotolisi è caratterizzato dall'utilizzo della spettroscopia UV-Vis. Una membrana in policarbonato nanoporoso (PCTE) può essere integrata nel dispositivo microfluidico per consentire la rimozione continua da parte dei composti non in gabbia e dei supporti esauriti. Un legame forte e irreversibile tra la membrana PCTE e la struttura microfluidica PDMS si ottiene rivestindo la membrana con una soluzione di 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) seguita dall'attivazione al plasma delle superfici da legare. Un sistema controllato dal computer può generare sequenze definite dall'utente di impulsi in luoghi diversi e con intensità diverse, in modo da creare paesaggi di risorse con prescritta variabilità spaziale e temporale. In ogni paesaggio chimico, è possibile ottenere la dinamica del movimento batterico su scala individuale e il loro accumulo a livello di popolazione, consentendo così la quantificazione delle prestazioni chemiotattiche e i suoi effetti sulle aggregazioni batteriche in ambienti ecologicamente rilevanti.

Abbiamo usato i dispositivi microfluidici e millifluidici (Figura 1) per studiare i profili di accumulo batterico in condizioni di nutrienti dinamiche. Le traiettorie batteriche sono state estratte da video registrati acquisiti mediante microscopia a contrasto di fase della dinamica di dissipazione dell'accumulo di una popolazione batterica a seguito di un impulso chimico rilasciato dalla fotolisi (Figura 2 e Figura 3). Mediando mil...

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Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Viene presentato un protocollo per la generazione di paesaggi chimici dinamici mediante fotolisi all'interno di configurazioni microfluidiche e millifluidiche. Questa metodologia è adatta per studiare diversi processi biologici, tra cui il comportamento motile, l'assorbimento di nutrienti o l'adattamento alle sostanze chimiche dei microrganismi, sia a livello di singola cellula che di popolazione.

Generazione di paesaggi chimici dinamici e controllati per studiare il comportamento microbico

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Questo metodo consente di chiarire l'ecologia su microscala e il comportamento dei microrganismi che navigano in gradienti chimici dinamici e di scoprire i loro trade-off nascosti, la cinetica dei nutrienti e le dinamiche della popolazione in microambientati ecologicamente rilevanti. Combinando la tecnologia microfluidica con la fotolisi, generiamo impulsi chimici controllati, dove il chemioattrattante localizzato diventa improvvisamente disponibile su microscala, per misurare la risposta chemiotattica delle popolazioni microbiche esposte per la prima volta a gradienti chimici instabili. Progettare il canale utilizzando il software CAD e stamparlo su una pellicola trasparente per creare la maschera fotografica.Fabbrica il maestro con una litografia morbida in una stanza pulita, secondo il manoscritto. Preparare una miscela PDMS combinando l'elastomero con il suo agente polimerizzante con un rapporto 10 a uno in un bicchiere da 40 millilitri. Con un coltello di plastica, mescolare vigorosamente fino a quando il liquido non è omogeneo.Degasa immediatamente la miscela PDMS in una camera a vuoto per 45 minuti a temperatura ambiente. Per accelerare il processo, rilasciare periodicamente il vuoto per far scoppiare le bolle che si formano sull'interfaccia. Rimuovere la polvere dalla superficie del master con un detergente pressurizzato.Quindi versare la miscela PDMS degassata sul master e cuocerla in forno a 80 gradi Celsius per due ore. Tagliare il PDMS con una lama intorno alle microstrutture a una distanza di circa cinque millimetri, quindi sbucciare con cura il PDMS dal master. Fori di punzonatura per fungere da ingresso e uscita del microcanale.Sigillare il microcanale con nastro adesivo per evitare l'accumulo di polvere. Progetta la forma 3D utilizzando il software di progettazione 3D e stampa il master per lo stampo PDMS con una stampante 3D ad alta risoluzione. Dopo aver preparato e degassato la miscela PDMS come fatto in precedenza, pulire la superficie del master tamponando con nastro adesivo.Metti il maestro su una bilancia. Quindi, evitando la regione centrale del master, versare 23,4 grammi di miscela PDMS non curata per ottenere l'altezza desiderata di PDMS abbinando l'altezza del master a 0,5 millimetri. Rimuovere eventuali bolle rimanenti con l'aiuto di aria compressa.Posizionare il PDMS gettato sul master in un forno a 45 gradi Celsius per cuocere per almeno 12 ore. Quindi, staccare delicatamente lo strato PDMS indurito e punzonare i fori di ingresso e uscita per l'iniezione della sospensione batterica. Attivare sia la superficie di una piastra di Petri che lo stampo PDMS con plasma di ossigeno per due minuti.Legare lo stampo PDMS sulla piastra di Petri premendo delicatamente lo stampo alla piastra di Petri. Evitare di premere dove si trovano le feature. Posizionare la piastra di Petri incollata allo stampo 3D PDMS in un forno a 45 gradi Celsius per almeno 12 ore per rafforzare il legame chimico.Successivamente, attivare la membrana in policarbonato nanoporous in una camera al plasma di ossigeno per un minuto a temperatura ambiente. Sotto una cappa chimica, diluire una soluzione commerciale di 3-amminopropiltrietossisilano in acqua deionizzata all'1% in volume utilizzando un tubo di polipropilene. Trasferire la soluzione diluita di 3-amminopropiltrietossisilano in una piastra di Petri e immergere la membrana attivata nella soluzione di 3-amminopropiltrietossisilano per 20 minuti.Quindi, rimuovere la membrana dalla soluzione di 3-amminopropiltrietossisilano con una pinzetta e posizionarla su una pulizia della stanza per asciugare. Per la fabbricazione dei canali microfluidici PDMS che si trovano sulla membrana e consentono il lavaggio dell'arena batterica, ripetere la fabbricazione del dispositivo microfluidico per il singolo esperimento di impulso chimico come fatto in precedenza. Per legare i canali di lavaggio PDMS alla membrana funzionalizzata, attivare prima sia il canale di lavaggio PDMS che la membrana in policarbonato con una camera al plasma di ossigeno per due minuti.Subito dopo il trattamento al plasma, mettere a contatto la membrana funzionalizzata e il canale di lavaggio PDMS premendo delicatamente il canale di lavaggio PDMS sulla membrana. È importante premere delicatamente insieme il PDMS e la membrana, oppure la membrana potrebbe essere irreversibilmente incollata al soffitto del microcanale PDMS di altezza di 200 micrometri. Quindi, attivare sia la membrana in policarbonato del canale di lavaggio PDMS in laminato incollato che lo stampo PDMS 3D precedentemente legato alla piastra di Petri posizionandoli in una camera al plasma di ossigeno per due minuti.Incastro la membrana tra due strati PDMS e premi insieme. Posizionare la piastra di Petri incollata alla struttura del sandwich in un forno a 45 gradi Celsius per almeno 12 ore per rafforzare il legame chimico. Per iniziare, mantenere la camera millifluidica sotto vuoto per 20 minuti.Quindi, posizionare la piastra di Petri contenente la camera millifluidica su uno stadio di microscopio. Con una pipetta, riempire la camera sotto la membrana con la sospensione batterica diluita della soluzione di GFP-fluorescente Vibrio ordalii in una soluzione di glutammato 4-metossi-7-nitroindolinil-gabbia-L-glutammato in acqua di mare artificiale. Dopo aver riempito il canale con le sospensioni batteriche, succhiare la soluzione in eccesso con un tovagliolo di carta e sigillare l'ingresso e l'uscita con spine PDMS premendoli delicatamente nei fori.Riempire una siringa con una soluzione artificiale di acqua di mare di un millimolare 4-metossi-7-nitroindolinil-gabbia-L-glutammato e attaccare i tubi all'ingresso e all'uscita del canale di lavaggio sopra la membrana. Collegare il tubo a un serbatoio di rifiuti e assicurarsi che il tubo sia interamente immerso nel serbatoio dei rifiuti fluidi per evitare oscillazioni di pressione. Impostare la portata sulla pompa della siringa su 50 microlitri al minuto.Avviare la pompa della siringa per stabilire il flusso nel canale di lavaggio sopra la membrana. Avviare il software che controlla il fascio LED e lo stadio del microscopio e generare sequenze di impulsi definite dall'utente in luoghi diversi e con intensità diverse. Registra video usando un obiettivo 4x a intervalli di tempo regolari per un periodo di diverse ore e su più posizioni contigue per coprire una superficie di grandi dimensioni.In questo studio, i dispositivi microfluidici e millifluidici sono stati utilizzati per studiare la risposta chemiotattica batterica e i profili di accumulo in condizioni nutritive dinamiche. Le proiezioni di intensità massima mostrano la posizione batterica, indicata da tracce bianche, su un intervallo di 0,5 secondi immediatamente dopo il rilascio dell'impulso e 40 secondi dopo il rilascio dell'impulso. Le traiettorie batteriche sono state mostrate anche in nero 60 secondi dopo il rilascio dell'impulso.La regione ombreggiata rappresenta l'impulso chimico rilasciato dalla fotolisi al tempo zero secondo nel mezzo del campo visivo, che successivamente si diffuse. La concentrazione batterica, così come la dinamica temporale della velocità di deriva radiale a seguito di un rilascio di impulsi al centro del campo visivo sono mostrati qui. I valori negativi della velocità di deriva corrispondono al moto chemiotattico diretto verso il centro dell'impulso.Le statistiche sul nuoto sono presentate qui per una popolazione batterica in assenza di gradienti chimici. Le traiettorie rappresentano le proiezioni bidimensionali del moto batterico tridimensionale nel microcanale. La distribuzione di probabilità della velocità di nuoto batterica misurata era adatta a una distribuzione gamma.Dalle traiettorie batteriche, è stata estratta la distribuzione di probabilità del tempo tra riorientamenti successivi. Il modello di riorientamento, la distribuzione della velocità di nuoto e le statistiche di riorientamento degli organismi sono stati usati per informare un singolo modello basato. Questo metodo è stato testato sui batteri marini Vibrio ordalii che eseguono chemiotassi verso l'amminoacido glutammato, ma la metodologia proposta è ampiamente applicabile a diverse combinazioni di specie e chemioattratti, nonché a processi biologici oltre la chemiotassi, come la dinamica della popolazione e della comunità in condizioni spazialmente eterogenee e dinamiche.Le tecniche classiche in ecologia microbica e microbiologia, come le crescita delle colture batch o dei chemostati, hanno ampiamente ignorato le caratteristiche spazio-temporali degli habitat microbici. La creazione quasi istantanea di impulsi chimici su microscala mediante fotolisi mira a riprodurre il tipo di impulsi nutritivi che i batteri marini incontrano in natura da una serie di fonti, ad esempio la diffusione diffusiva di pennacchi dietro particelle organiche che affondano o la diffusione di nutrienti da cellule fitoplancton lysed. La soluzione di amminosilano è acutamente tossica e deve essere maneggiata con estrema cura.Lavoriamo esclusivamente sotto il cofano dei fumi e indossiamo dispositivi di protezione come camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti. Ci prendiamo cura anche dei rifiuti che abbiamo generato.

Research

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