Name: generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00
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著者らは、ETHチューリッヒのFIRST微細加工施設に感謝している。この研究は、オーストラリア研究評議会創立早期キャリア研究者賞DE180100911(D.R.B.へ)、ゴードンとベティムーア海洋微生物イニシアチブ調査官賞GBMF3783(R.S.へ)、スイス国立科学財団助成金によって支援されました。1-002745-000 (R.S.へ)。

1. 単一化学パルス実験のためのマイクロ流体装置の作製
<ol><li>コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用してチャンネルを設計し、透明フィルムに印刷してフォトマスクを作成します(図1A)。</li>
	<li>柔らかいリソグラフィー(清潔な部屋の条件下で)によってマスターを製造する。<ol>
<li>アセトン、メタノール、イソプロパノールでシリコンウエハ(4イン...

<ol>
	<li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of the chemotactic response. , (1991).</li><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+structuring+of+marine+ecosystems.">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li><li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., Gonz&#225;lez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+recyclers:+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms.">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li><li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+diversity+modulates+population+performance.">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).</li><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients.">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+compounds:+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology.">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li><li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds:+New+tools+for+cellular+physiology.">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signal+integration+in+bacteria.">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li><li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal.">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li><li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus.">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li><li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes.">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985 (2015).</li><li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients.">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices.">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).</li><li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes.">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li><li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel,+fast+caged+neurotransmitters.">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li><li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm:+Photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li><li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T=298.15K.">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li><li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+properties+of+seawater:+a+review+of+existing+correlations+and+data.">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li><li>. Nikon depth of field calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019)</li><li>Ki&#248;rboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates:+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters.">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li><li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria.">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li><li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches.">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li><li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap.">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior.">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li><li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels.">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li></ol>

この方法により、研究者はマイクロおよびミリ流体デバイスの制御された動的勾配の下で細菌の走化を研究することができ、再現性のあるデータ収集を可能にする。光彩によるマイクロスケールでの化学パルスのほぼ瞬時の生成は、細菌が野生で遭遇する栄養パルスの種類を、例えば、沈没海洋粒子25の背後にあるプルームの拡散拡散、または、毛状細胞細胞26...

微生物は、化学勾配を検出し、応答1で運動性を改変するプロセスである化学化学軸に依存して、化学景観をナビゲートし、栄養源と宿主にアプローチし、有害物質を脱出します。これらのマイクロスケールプロセスは、微生物とその環境2、3との間の相互作用のマクロスケールの動態を決定する。ソフトリソグラフィ4を含むマイクロ流体技術および微細加工技術の最近の進歩は、微生物の相互作用を研究する制御された微小環境を作り出す能力に革命をもたらしています。例えば、過去の実験では、高い栄養素濃度5、6の中間体から高い栄養濃度の高い制御、安定した勾配を生成することにより、細菌の走化を研究してきた。しかし、自然環境では、マイクロスケールの化学勾配は、分子拡散によって消失する短時間で、背景条件は高度に希釈されることが多い7である。微生物集団の化学化学反応を直接測定するために、微生物が自然界で遭遇する勾配を模倣し、微小流体技術と光流動を組み合わせる方法を考案し、ここで説明しました。
アンセジング技術は、生体分子を非アクティブな形で機能的にカプセル化する光感受性プローブを採用しています。照射は、ケージ分子を放出し、生物学的プロセスの標的摂動を可能にする8。細胞化学の迅速かつ正確な制御のために9,ケージ化合物の光分化は、伝統的に遺伝子 10 の活性化を研究する生物学者、生理学者や神経科学者によって採用されています10,イオンチャネル11,ニューロン12.最近では、科学者たちは、光化の重要な利点を利用して走化性13を研究し、段階的な化学誘引刺激刺激物14、15にさらされた個々の細菌細胞のフラグラスイッチングダイナミクスを決定し、3次元(3D)勾配16における単一精子細胞の運動パターンを調査した。
我々のアプローチでは、マイクロ流体デバイス内でケージアミノ酸の光分化を実施し、光放出を通じてほぼ瞬時に入手可能になる制御された化学パルスに対する細菌集団の行動応答を研究する。低倍率(4倍)目標(NA = 0.13、焦点深度約40μm)を使用することで、大視野(3.2 mm x 3.2 mm)にわたる数千もの細菌の集団レベルの凝集応答を観察し、単一細胞レベルでの運動の測定を可能にします。この方法の2つの用途を提示する:1)均一な条件から始まる細菌の蓄積−放散ダイナミクスを研究するための単一の化学パルスの放出、および2i)時間変動、空間的に不均一な化学誘引条件下での細菌蓄積ダイナミクスを特徴付ける複数のパルスの放出。この方法は、アミノ酸グルタミン酸17に向かって走化を行う海洋細菌ビブリオダリに対して試験されているが、この方法は、種および化学誘引物質の異なる組み合わせ、ならびに化学原性を超える生物学的プロセス(例えば、栄養取り込み、抗生物質暴露、クォーラムセンシング)に広く適用可能である。このアプローチは、現実的な環境における微生物の生態と挙動を解明し、一時的な動的勾配をナビゲートする際に個々の細菌が直面する隠れたトレードオフを明らかにすることを約束します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>&#62;98% purity, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>to eliminate spent media from the bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubators Incu-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>390-0384</td>
			<td>to bake 3D master</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duster</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>16650-22</td>
			<td>to clean the wafer and microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>444-0601</td>
			<td>to bond the microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSafe micro centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688312</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>for image analysis and bacterial tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>631-1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon Eclipse TiE</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td>with motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNI-Glutamate</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1490</td>
			<td>&#62;98 % purity, photosensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing equipment</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Objet30 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing service</td>
			<td>3D Printing Studios</td>
			<td>Custom</td>
			<td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>to calibrate the uncaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscope Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven Venti-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>466-3516</td>
			<td>to bake PDMS (with forced convection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8-3050</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU8-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma chamber Zepto</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO-1</td>
			<td>to functionalize the surfaces before bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCT0447100</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size, 19 % open area, 24 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene microtubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>I.D. x O.D.: 0.015&#34; x 0.043&#34; / 0.38mm x 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>611-2605</td>
			<td>to weight PDMS mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Andor Zyla</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Product No. SS1-160p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2015</td>
			<td>Dassault Systemes SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td>Used to design the mold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencolor</td>
			<td></td>
			<td>for LED 395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>110-41-155</td>
			<td>PDMS Si Elastomer Kit; curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Luer-Lok)</td>
			<td>B Braun Omnifix</td>
			<td>4616308F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Needle</td>
			<td>Agani</td>
			<td>A228</td>
			<td>from 10 to 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump 11 Pico Plus Elite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroGrey</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Dual Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Mold Material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior

マイクロスケールで局所的な化学誘起物質が突然利用可能になる制御された動的化学パルスの生成方法を実証し、微生物走化実験のためのマイクロ環境を作り出す。化学パルスを作製するために、細菌懸濁液を含むポリジメチルシロキサン(PDMS)マイクロ流体室内でカゲアミノ酸を光分解することで、ほぼ瞬時にアミノ酸源を導入するシステムを開発しました。この方法を走化細菌、ビブリオ・オルダリに応用し、ビデオ顕微鏡で追跡しながらこれらの動的化学勾配を積極的に登ることができる。アミノ酸は、フォトリムーバル可能な保護基による化学的修飾によって生物学的に不活性('caged')をレンダリングし、懸濁液中に均一に存在するが、ほぼUV-A焦点を当てたLEDビームによって時間と空間のユーザー定義のポイントで発生する突然の放出まで消費できない。パルスで放出される分子の数は、光分解後の吸収スペクトルがUV-Vis分光法を用いて特徴付けられる露光時間と非定率との間の較正関係によって決定することができる。ナノ多孔性ポリカーボネート(PCTE)膜をマイクロ流体デバイスに組み込み、解毒された化合物および使用済み培地の流れによる連続的な除去を可能にすることができる。PCTE膜とPDMSマイクロ流体構造との間の強く不可逆的な結合は、3-アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)の溶液で膜をコーティングし、続いて結合する表面のプラズマ活性化によって達成される。コンピュータ制御システムは、異なる場所で異なる強度を持つパルスのユーザー定義シーケンスを生成し、所定の空間的および時間的変動性を持つリソース景観を作成することができます。各化学環境において、個々のスケールでの細菌の動きのダイナミクスと集団レベルでの蓄積を得ることができるため、化学戦術性能の定量化と、生態学的に関連する環境における細菌凝集への影響が可能になる。

微小流体およびミリ流体デバイス(図1)を使用して、動的栄養条件下での細菌蓄積プロファイルを研究しました。細菌の軌跡は、光熱により放出された化学パルスに続く細菌集団の蓄積・散逸ダイナミクスの位相差顕微鏡で取得した記録されたビデオから抽出した(図2および図3)。何百万もの軌道を平均化することにより、放射...

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Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

マイクロ流体およびミリ流体のセットアップ内の光の解析による動的化学景観の生成のためのプロトコルが提示されます。この方法論は、単一細胞および集団レベルの両方で、運動行動、栄養取り込み、または微生物の化学物質への適応を含む多様な生物学的プロセスを研究するのに適している。

微生物の挙動を研究するための制御された動的化学景観の生成

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

この方法は、動的化学勾配をナビゲートする微生物の微小な生態学と行動を解明し、生態学的に関連する微環境における隠されたトレードオフ、栄養素運動学、および集団ダイナミクスを明らかにすることを可能にする。マイクロ流体技術と光起液を組み合わせることで、局所的な化学誘引物質がマイクロスケールで突然入手可能になる制御された化学パルスを生成し、最初に不安定な化学勾配にさらされた微生物集団の化学戦術応答を測定します。CADソフトウェアを使用してチャンネルを設計し、透明フィルムに印刷してフォトマスクを作成します。原稿によると、クリーンルームで柔らかいリソグラフィによってマスターを製造します。エラストマーと硬化剤を40ミリリットルビーカーで10対1の比率で組み合わせてPDMS混合物を調製します。プラスチックナイフで、液体が均質になるまで激しく混ぜます。PDMS混合物を真空チャンバー内で室温で45分間すぐに脱気する。プロセスを迅速化するには、インターフェイスで形成される気泡を破裂させるために、定期的に真空を解放します。加圧クリーナーでマスターの表面からほこりを取り除きます。その後、脱ガスPDMS混合物をマスターに注ぎ、オーブンで80°Cで2時間焼きます。約5ミリメートルの距離で微細構造の周りにブレードでPDMSをカットし、慎重にマスターからPDMSを剥がします。マイクロチャネルの入口および出口として機能するパンチ穴。マイクロチャネルを粘着テープで密封して、ほこりの蓄積を防ぎます。3D デザイン ソフトウェアを使用して 3D 形状を設計し、高解像度の 3D プリンタで PDMS 金型のマスタ シェイプを印刷します。前に行ったようにPDMS混合物を調製し、脱気した後、粘着テープで手を出すことによってマスターの表面をきれいにします。マスターをスケールに入れてください。次に、マスターの中央領域を避けながら、0.5ミリメートルでマスターの高さを一致させることによってPDMSの所望の高さを得るために、未硬化PDMS混合物の23.4グラムを注ぎます。圧縮空気の助けを借りて残りの気泡を取り除く。少なくとも12時間焼くために摂氏45度でオーブンでマスターに投げられたPDMSキャストを置きます。次に、硬化PDMS層を軽く剥がし、細菌懸濁液の注入のために入口及び出口穴をパンチする。ペトリ皿の表面とPDMS型の両方を酸素プラズマで2分間活性化します。ペトリ皿にそっと押して、ペトリ皿にPDMS型を接着します。フィーチャが配置されている場所を押すのは避けてください。ケミカルボンドを強化するために、45°CのオーブンでPDMS 3D金型に結合したペトリ皿を少なくとも12時間置きます。次に、酸素プラズマチャンバー内のナノ多孔性ポリカーボネート膜を室温で1分間活性化する。化学フードの下で、ポリプロピレンチューブを使用して、脱イオン水中の3-アミノプロピルトリエトキシシランの市販溶液を1体積%に希釈します。希釈した3-アミノプロピルトリエトキシシラン溶液をペトリ皿に移し、活性化膜を3-アミノプロピルトリエトキシシラン溶液に20分間浸漬する。次いで、ピンセットを用いて3-アミノプロピルトリエトキシシラン溶液から膜を取り出し、クリーンルームの上に拭いて乾燥させた。膜上に横たわるPDMSマイクロ流体チャネルの製造のために、細菌のアリーナの洗浄を可能にし、前に行われた単一の化学パルス実験のためのマイクロ流体デバイスの製造を繰り返す。PDMS洗浄チャネルを機能化膜に結合させるために、まずPDMS洗浄チャネルとポリカーボネート膜の両方を酸素プラズマチャンバーで2分間活性化する。プラズマ処理の直後に、PDMS洗浄チャネルを膜上に静かに押し込んで機能性膜とPDMS洗浄チャネルを接触させます。PDMSと膜を穏やかに押し合うことが重要であり、または膜が200マイクロメートルの高さのPDMSマイクロチャネルの天井に不可逆的に結合する可能性があります。次いで、結合したラミネートPDMS洗浄チャネルポリカーボネート膜と3D PDMS型の両方を、酸素プラズマチャンバーに2分間入れることで、ペトリ皿に結合した3D PDMS型の両方を活性化する。2つのPDMS層の間に膜を挟み、一緒に押します。ペトリ皿をサンドイッチ構造に結合し、少なくとも12時間は摂氏45度のオーブンに入れ、化学結合を強化します。まず、20分間真空下でミリ流体室を維持します。次に、ミリ流体室を含むペトリ皿を顕微鏡ステージに置きます。ピペットで、人工海水中の1ミリモル4-メトキシ-7-ニトロインドリニルケージL-グルタミン酸溶液中のGFP蛍光ビブリオオルダリの希薄な細菌懸濁液で膜の下のチャンバーを満たします。チャネルに細菌懸濁液を充填した後、ペーパータオルで溶液を過剰に吸い込み、入口と出口をPDMSプラグで密封し、穴にそっと押し込みます。注射器に1ミリモル4-メトキシ-7-ニトロインドリニルケージL-グルタミン酸の人工海水溶液を充填し、膜上の洗浄チャネルの入口および出口にチューブを取り付けます。チューブを廃棄物貯留層に接続し、チューブが完全に流体廃棄物貯蔵所に沈み、圧力振動を避けるようにします。シリンジポンプの流量を毎分50マイクロリットルに設定します。シリンジポンプを起動して、膜上の洗浄チャネルの流れを確立します。LEDビームと顕微鏡ステージを制御するソフトウェアを起動し、異なる場所で、異なる強度でユーザー定義のパルスシーケンスを生成します。数時間の期間にわたって一定の時間間隔で、大きなサーフェスをカバーするために複数の連続した場所にわたって 4 倍の目標を使用してビデオを録画します。本研究では、微小流体およびミリ流体デバイスを使用して、動的栄養条件下での細菌化学戦術応答および蓄積プロファイルを研究した。最大強度投影法は、パルス放出直後の0.5秒間隔およびパルス放出後40秒の間に、白色の痕跡で示される細菌の位置を示す。細菌の軌跡は、パルス放出後60秒で示した。シェーディングされた領域は、視野の中央で0秒の時点で光起によって放出される化学パルスを表し、その後拡散した。細菌濃度と、視野の中心におけるパルス放出後の放射状ドリフト速度の時間的ダイナミクスをここに示す。ドリフト速度の負の値は、パルスの中心に向かって指示された化学戦術運動に対応します。化学的勾配がない場合の細菌集団に関する水泳統計がここで提示される。軌道は、マイクロチャネルにおける3次元細菌運動の2次元突起を表す。測定された細菌の泳ぐ速度の確率分布はガンマ分布によって適合した。細菌軌跡から、連続した方向転換間の確率分布を抽出した。再配向パターン、泳泳速度の分布、および生物の方向転換統計を使用して、個々のモデルに通知しました。この方法は、アミノ酸グルタミン酸に向かって走気性を行う海洋細菌ビブリオオルダリについて試験されているが、提案された方法論は、種および化学誘引物質の異なる組み合わせ、ならびに空間的に不均一で動的な条件下での集団およびコミュニティダイナミクスのような化学軸を超えた生物学的プロセスに広く適用可能である。バッチ培養やチェモストの成長など、微生物生態学や微生物学における古典的な技術は、微生物生息地の時空間的特徴をほとんど無視してきた。光起彩によるマイクロスケールでの化学パルスのほぼ瞬時の作成は、海洋細菌が野生で遭遇する栄養パルスの種類を、例えば、沈む有機粒子の背後にあるプルームの拡散や、リセドフィトプランクトン細胞から広がる栄養素を再現することを目的としています。アミノシラン溶液は、急性毒性であり、細心の注意を払って処理する必要があります.私たちはフームフードの下で独占的に働き、ラボコート、安全ゴーグル、手袋などの保護具を着用しています。また、発生した廃棄物の処理も行っています。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

赤血球凝集の動的な調査のための制御されたマイクロ流体環境

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A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

多様な微生物群集の高密度栽培のための新しいバイオリアクター

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

制御された薬物放出のための磁場応答性ハイブリッドゼラチンマイクロゲルを交互に

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

細胞の挙動のNanotopographical変調のステッチ法を用いたナノパターン基板を拡大

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

ダイナミックな3D腹膜のマイクロデバイスに卵巣癌多細胞スフェロイドの挙動のモデル化

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

神経のインプラントの軟化挙動を予測する環境の動的機械分析

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

発芽血管を研究するためのテッセレーション足場の段階的な細胞播種

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...