Name: generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00
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저자는 ETH 취리히에서 첫 번째 미세 가공 시설에 감사드립니다. 이 작품은 호주 연구위원회 발견 초기 경력 연구원 상 DE180100911 (D.R.B.), 고든과 베티 무어 해양 미생물 이니셔티브 조사자 상 GBMF3783 (R.S.에), 스위스 국립 과학 재단 보조금에 의해 지원되었다 1-002745-000 (R.S.로)

1. 단일 화학 펄스 실험을위한 미세 유체 장치 제조
<ol><li>CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 채널을 디자인하고 투명 필름에 인쇄하여 포토 마스크를만듭니다(그림 1A).</li>
	<li>부드러운 리소그래피로 마스터를 제작합니다(클린룸 조건하에서).<ol>
<li>실리콘 웨이퍼(4인치)를 아세톤, 메탄올 및 이소프로판올로 연속해서 세척한 다음 질소를 사용하여 ?...

<ol>
	<li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of the chemotactic response. , (1991).</li><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+structuring+of+marine+ecosystems.">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li><li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., Gonz&#225;lez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+recyclers:+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms.">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li><li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+diversity+modulates+population+performance.">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).</li><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients.">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+compounds:+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology.">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li><li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds:+New+tools+for+cellular+physiology.">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signal+integration+in+bacteria.">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li><li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal.">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li><li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus.">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li><li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes.">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985 (2015).</li><li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients.">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices.">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).</li><li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes.">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li><li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel,+fast+caged+neurotransmitters.">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li><li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm:+Photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li><li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T=298.15K.">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li><li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+properties+of+seawater:+a+review+of+existing+correlations+and+data.">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li><li>. Nikon depth of field calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019)</li><li>Ki&#248;rboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates:+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters.">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li><li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria.">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li><li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches.">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li><li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap.">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior.">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li><li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels.">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li></ol>

이 방법을 통해 연구원은 마이크로 및 밀리플루언스 장치에서 제어되고 동적 그라데이션하에서 세균 성 화학 요법을 연구하여 재현 가능한 데이터 수집을 가능하게합니다. 광분해에 의한 마이크로스케일에서 의한 화학펄스의 거의 즉각적인 생성은 박테리아가 다양한 소스로부터 야생에서 발생하는 영양소 펄스의 유형을 재현하는 것을 목표로 하며, 예를 들어, 가라앉는 해양입자(2...

미생물은 화학 적 구배를 감지하고 반응1에서운동성을 수정하는 과정인 화학 요법에 의존하여 화학 적 경관을 탐색하고 영양공급원과 숙성에 접근하고 유해 물질을 탈출합니다. 이러한 마이크로 스케일 프로세스는 미생물과 환경 간의 상호 작용의 거시 적 역학을 결정2,3. 최근 연질 리소그래피4를포함한 미세 유체학 및 미세 제조 기술의 발전은 미생물의 상호 작용을 연구할 수 있는 제어된 미세 환경을 만드는 우리의 능력에 혁명을 일으켰습니다. 예를 들어, 과거 실험에서는 중급에서 고영양농도의 고도로 조절되고 안정된 그라데이션을 생성하여 세균화학을 연구한5,6. 그러나 자연 환경에서는 미세 크기의 화학 그라데이션이 단명할 수 있으며 분자 확산에 의해 소멸될 수 있으며 배경 조건은 종종 매우희석되어 7. 불안정한 화학 환경에 처음 노출된 미생물 집단의 화학반응을 직접 측정하기 위해 미세 유체 기술과 광분해를 결합하여 야생 박테리아가 자연에서 마주치는 그라데이션을 모방하는 방법을 고안하고 여기에 설명했습니다.
Uncaging 기술은 생체 분자를 비활성 형태로 기능적으로 캡슐화하는 빛에 민감한 프로브를 사용합니다. 조사는 갇힌 분자를 방출하여 생물학적 과정의 표적 교란을허용8. 세포 화학의 신속하고 정밀한 제어로 인하여9,케이지 화합물의 광분석은 전통적으로 생물학자, 생리학자 및 신경과학자들에 의해 유전자10,이온 채널11,및 뉴런12의활성화를 연구하기 위해 사용되어 왔다. 최근 과학자들은화학요법(13)을연구하기 위해 광분해의 유의한 장점을 활용하고, 단계별 화학력 자극14,15에노출된 개별 세균 세포의 편동기 전환 역학을 결정하고, 3차원(3D) 그라데이션16에서단일 정자 세포의 운동성 패턴을 조사하였다.
우리의 접근에서는, 우리는 광유체 장치 내의 케이지된 아미노산의 광용해를 구현하여 광방출을 통해 거의 즉각적으로 이용 가능해지는 제어된 화학 펄스에 대한 세균 집단의 행동 반응을 연구합니다. 저배율(4x) 목적(NA = 0.13, 초점 깊이 약 40 μm)을 사용하면 넓은 시야(3.2 mm x 3.2 mm)에서 수천 개의 박테리아의 집단 수준 집계 반응을 관찰하고 단일 셀 수준에서 모션을 측정할 수 있습니다. 우리는이 방법의 두 가지 응용 프로그램을 제시: 1) 균일 한 조건에서 시작 하는 박테리아 축적-발산 역학을 연구 하는 단일 화학 펄스의 릴리스, 그리고 2i)시간 변화 하에서 세균 축적 역학을 특성화 하는 다중 펄스의 릴리스, 공간적으로 이질적인 화학 력 조건. 이 방법은 아미노산글루타메이트(17)를향한 화학탁증을 수행하는 해양 박테리아 비브리오 오르달리에 대해 시험되었지만, 이 방법은 화학적 화학요법(예를 들어, 영양 섭취, 항생제 노출, 쿼럼 센싱)을 넘어서는 생물학적 과정뿐만 아니라 종 및 화학유량의 상이한 조합에 광범위하게 적용가능하다. 이 접근법은 현실적인 환경에서 미생물의 생태와 행동을 해명하고 일시적인 동적 그라데이션을 탐색 할 때 개별 박테리아가 직면하는 숨겨진 절충을 밝히는 데 도움이 될 것을 약속합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>&#62;98% purity, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>to eliminate spent media from the bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubators Incu-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>390-0384</td>
			<td>to bake 3D master</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duster</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>16650-22</td>
			<td>to clean the wafer and microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>444-0601</td>
			<td>to bond the microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSafe micro centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688312</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>for image analysis and bacterial tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>631-1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon Eclipse TiE</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td>with motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNI-Glutamate</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1490</td>
			<td>&#62;98 % purity, photosensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing equipment</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Objet30 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing service</td>
			<td>3D Printing Studios</td>
			<td>Custom</td>
			<td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>to calibrate the uncaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscope Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven Venti-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>466-3516</td>
			<td>to bake PDMS (with forced convection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8-3050</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU8-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma chamber Zepto</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO-1</td>
			<td>to functionalize the surfaces before bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCT0447100</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size, 19 % open area, 24 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene microtubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>I.D. x O.D.: 0.015&#34; x 0.043&#34; / 0.38mm x 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>611-2605</td>
			<td>to weight PDMS mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Andor Zyla</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Product No. SS1-160p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2015</td>
			<td>Dassault Systemes SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td>Used to design the mold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencolor</td>
			<td></td>
			<td>for LED 395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>110-41-155</td>
			<td>PDMS Si Elastomer Kit; curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Luer-Lok)</td>
			<td>B Braun Omnifix</td>
			<td>4616308F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Needle</td>
			<td>Agani</td>
			<td>A228</td>
			<td>from 10 to 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump 11 Pico Plus Elite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroGrey</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Dual Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Mold Material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior

우리는 미생물 화학 변균 실험을위한 마이크로 환경을 만들기 위해 지역화 된 화학 력체가 마이크로 스케일에서 갑자기 사용할 수있는 제어 되고 역동적 인 화학 펄스의 생성 방법을 보여줍니다. 화학 적 펄스를 만들기 위해, 우리는 세균 현탁액을 포함하는 다디메틸실록산 (PDMS) 미세 유체 챔버 내에서 케이지 된 아미노산의 광분해에 의해 거의 즉각적으로 아미노산 소스를 소개하는 시스템을 개발했습니다. 우리는 비디오 현미경 검사법에 의해 추적되는 동안 적극적으로 이러한 동적 화학 그라데이션을 등반 할 수있는 화학 박테리아, Vibrio ordalii에이방법을 적용했습니다. 광이동식 보호기와 화학적 변형에 의해 생물학적으로 불활성('케이지')으로 렌더링된 아미노산은 현탁액에 균일하게 존재하지만, UV-A에 가까운 LED 빔을 통해 사용자가 정의한 시간과 공간에서 발생하는 갑작스런 방출까지 는 소비할 수 없습니다. 펄스에서 방출되는 분자의 수는 노출 시간과 분획 해제 분획 사이의 교정 관계에 의해 결정될 수 있으며, 여기서 광용해 후 흡수 스펙트럼은 UV-Vis 분광법을 사용하는 것이 특징입니다. 나노다공성 폴리카보네이트(PCTE) 멤브레인은 미유체 장치로 통합되어 미주된 화합물 및 소비된 매체의 흐름에 의해 연속적으로 제거할 수 있다. PCTE 멤브레인과 PDMS 미세유체 구조 사이의 강력하고 돌이킬 수 없는 결합은 결합될 표면의 플라즈마 활성화에 이어 3-아미노프로필리에톡실란(APTES)의 용액으로 멤브레인을 코팅함으로써 달성된다. 컴퓨터 제어 시스템은 서로 다른 위치와 다른 강도의 사용자 정의 펄스 시퀀스를 생성하여 규정된 공간 및 시간적 가변성을 가진 리소스 풍경을 생성할 수 있습니다. 각 화학 적 풍경에서, 개별 규모에서 세균 운동의 역학 및 인구 수준에서의 축적을 얻을 수 있습니다.

우리는 동적 영양소 조건 하에서 세균 축적 프로파일을 연구하기 위해 미세 유체 및 밀리유체 장치(그림 1)를사용했습니다. 세균 궤적은 광용해에 의해 방출된 화학적 맥박에 따른 세균 집단의 축적-소산 역학의 상 대비 현미경 검사법에 의해 획득된 기록된 비디오에서 추출되었다(도2 및 그림 3). 수백만 개의 궤적을 평균화함으?...

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Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

미세 유체 및 밀리유체 설정 내에서 광용해로 동적 화학 적 경관의 생성을위한 프로토콜이 제시된다. 이 방법론은 운동성 행동, 영양소 섭취 또는 미생물의 화학 물질에 대한 적응을 포함한 다양한 생물학적 과정을 단일 세포 및 집단 수준에서 연구하는 데 적합합니다.

미생물 행동을 연구하기 위한 제어된 동적 화학 적 경관 생성

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

이 방법을 사용하면 동적 화학 그라데이션을 탐색하는 미생물의 미생물 생태 및 행동을 해명하고 생태학적으로 관련된 미생물 환경에서 숨겨진 절충, 영양 역학 및 인구 역학을 발견 할 수 있습니다. 미세유체 기술과 포토리시스를 결합하여, 우리는 국소화된 화학 요법이 마이크로 스케일에서 갑자기 사용 가능해지는 제어된 화학 펄스를 생성하여 불안정한 화학 적 그라데이션에 처음 노출된 미생물 집단의 화학 적 반응을 측정합니다. CAD 소프트웨어를 사용하여 채널을 디자인하고 투명 필름에 인쇄하여 포토 마스크를 만듭니다.원고에 따르면 깨끗한 방에서 부드러운 리소그래피로 마스터를 제작하십시오. 40 밀리리터 비커에 10 대 1 비율로 양화제와 탄성동을 결합하여 PDMS 혼합물을 준비합니다. 플라스틱 나이프를 사용하면 액체가 균일할 때까지 힘차게 섞습니다.실온에서 45분 동안 진공 챔버에서 PDMS 혼합물을 즉시 분해합니다. 프로세스를 신속히 처리하려면 인터페이스에서 형성되는 기포를 파열하기 위해 주기적으로 진공을 해제합니다. 가압 청소기로 마스터 표면에서 먼지를 제거합니다.그런 다음 탈가스 PDMS 혼합물을 마스터에 붓고 2 시간 동안 섭씨 80도에서 오븐에 구워줍니다. 약 5밀리미터의 거리에서 미세 구조 주위에 블레이드로 PDMS를 잘라낸 다음 마스터에서 PDMS를 조심스럽게 벗깁니다. 마이크로 채널의 입구와 콘센트 역할을 하는 구멍을 펀치합니다.먼지의 축적을 방지하기 위해 접착제 테이프로 마이크로 채널을 밀봉. 3D 설계 소프트웨어를 사용하여 3D 형상을 설계하고 고해상도 3D 프린터로 PDMS 금형의 마스터를 인쇄합니다. 이전에 와 같이 PDMS 혼합물을 준비하고 탈퇴한 후 접착제 테이프로 데빙하여 마스터의 표면을 청소하십시오.마스터를 축척으로 놓습니다. 그런 다음, 마스터의 중앙 영역을 피하면서, 0.5 밀리미터에서 마스터의 높이를 일치시켜 PDMS의 원하는 높이를 얻기 위해 23.4 그램의 경화되지 않은 PDMS 혼합물을 부어. 압축 공기의 도움으로 남은 거품을 제거합니다.PDMS 캐스트를 오븐에 45도의 오븐에 놓아 최소 12시간 동안 굽습니다. 이어서, 경화 PDMS 층을 부드럽게 벗겨내고, 세균현탁액의 주입을 위해 입구와 출구 구멍을 펀치한다. 페트리 접시의 표면과 산소 플라즈마로 PDMS 금형을 2분 동안 활성화합니다.페트리 접시에 PDMS 금형을 부드럽게 눌러 페트리 접시에 결합합니다. 피처가 있는 위치를 누르지 마십시오. 페트리 접시를 PDMS 3D 금형에 접합한 페트리 접시를 최소 12시간 동안 섭씨 45도의 오븐에 넣고 화학 결합을 강화합니다.다음으로, 실온에서 1분 동안 산소 플라즈마 챔버에서 나노다공성 폴리카보네이트 멤브레인을 활성화한다. 화학 후드 하에서, 폴리 프로필렌 튜브를 사용하여 1 %로 분화 물에 3-아미노 프로필트리에톡실란의 상업적 용액을 희석. 희석된 3-아미노프로필트리에톡실란 용액을 페트리 접시에 옮기고, 활성멤브레인을 3-아미노프로필트리에톡실란 용액에 20분간 담급한다.그런 다음 핀셋으로 3-아미노 프로필트리에톡실틸레인 용액에서 멤브레인을 제거하고 깨끗한 방에 닦아 말리십시오. 멤브레인에 누워 세균 성 투기장의 세척을 허용하는 PDMS 미세 유체 채널의 제조를 위해, 이전과 같이 단일 화학 펄스 실험에 대한 미세 유체 장치의 제조를 반복한다. PDMS 세척 채널을 기능성 멤브레인에 결합하려면 먼저 PDMS 세척 채널과 폴리카보네이트 멤브레인을 산소 플라즈마 챔버와 2분 동안 활성화합니다.플라즈마 처리 직후, PDMS 세척 채널을 멤브레인에 부드럽게 눌러 기능화된 멤브레인과 PDMS 세척 채널을 접촉하게 한다. PDMS와 멤브레인을 부드럽게 누르거나 멤브레인이 200 마이크로미터 높이의 PDMS 마이크로 채널의 천장에 돌이킬 수 없이 결합될 수 있습니다. 이어서, 2분 동안 산소 플라즈마 챔버에 배치하여 이전에 페트리 접시에 결합된 접합 된 라미네이트 PDMS 세척 채널 폴리 카보네이트 멤브레인과 3D PDMS 금형을 모두 활성화합니다.두 PDMS 층 사이에 멤브레인을 샌드위치하고 함께 누릅니다. 페트리 접시를 오븐에 결합하여 최소 12시간 동안 오븐에 결합하여 화학 결합을 강화합니다. 시작하려면 진공 상태에서 밀리유체 챔버를 20분 동안 유지관리합니다.그런 다음 밀리유체 챔버를 함유한 페트리 접시를 현미경 단계에 놓습니다. 파이펫으로 인공 해수의 1밀리머 4-메톡시-7-니트로인돌리닐-케이지-L-글루타메이트 용액의 GFP 형광 비브리오 또는 달리의 희석세균 현탁액으로 멤브레인 아래 챔버를 채웁니다. 세균 현탁액으로 채널을 채운 후 종이 타월로 용액을 빨아들이고 PDMS 플러그로 입구와 콘센트를 부드럽게 구멍에 밀어 넣습니다.1밀리머 4-메톡시-7-니트로인돌리닐-케이지-L-글루타메이트의 인공 해수 용액으로 주사기를 채우고, 멤브레인 위의 세척 채널의 입구와 콘센트에 튜브를 부착합니다. 튜브를 폐기물 저장소에 연결하고 튜브가 유체 폐기물 저장소에 완전히 침수되어 압력 진동을 방지하도록 하십시오. 주사기 펌프의 유량을 분당 50 마이크로리터로 설정합니다.주사기 펌프를 시작하여 멤브레인 위의 세척 채널의 흐름을 설정합니다. LED 빔과 현미경 단계를 제어하는 소프트웨어를 시작하고 서로 다른 위치와 다른 강도로 사용자 정의 펄스 시퀀스를 생성합니다. 몇 시간 동안 여러 개의 연속 위치에 걸쳐 정규 시간 간격으로 4배 목표를 사용하여 비디오를 녹화하여 큰 표면을 덮습니다.이 연구에서는, 미세 유체 및 밀리 유체 장치는 동적 영양소 조건하에서 세균성 화학 반응 및 축적 프로파일을 연구하는 데 사용되었습니다. 최대 강도 투영은 펄스 방출 직후와 펄스 방출 후 40초 후에 0.5초 간격을 통해 흰색 흔적으로 표시된 세균 위치를 보여줍니다. 세균궤적 궤적도 펄스 방출 후 60초 후 검은색으로 나타났다.그늘진 영역은 시야 중간에 0초 의 사진 용해에 의해 방출된 화학 펄스를 나타내며, 이어서 확산된다. 세균 농도뿐만 아니라 방사형 드리프트 속도의 측두동체는 시야의 중심에 펄스 방출후 여기에 나와 있다. 드리프트 속도의 음수 값은 펄스의 중심을 향한 지시된 화학 운동에 해당합니다.수영 통계는 화학 그라데이션이없는 세균 성 인구를 위해 여기에 제시됩니다. 궤적은 마이크로 채널에서 3차원 세균 운동의 2차원 프로젝션을 나타낸다. 측정된 세균 수영 속도의 확률 분포는 감마 분포에 의해 적합했다.세균 궤적으로부터, 연속방향 방향 감각 사이의 시간의 확률 분포가 추출되었다. 방향 감각 방향 패턴, 수영 속도의 분포 및 유기체의 방향 감각 전환 통계가 개별 기반 모델을 알리는 데 사용되었습니다. 이 방법은 아미노산 글루타민산을 향한 항암제를 수행하는 해양 박테리아 Vibrio ordalii에 대해 테스트되었지만, 제안된 방법론은 생물과 화학요법제의 다른 조합뿐만 아니라 공간적으로 이질적이고 역동적인 조건에서 인구 및 지역 사회 역학과 같은 화학요법을 넘어 생물학적 과정에 광범위하게 적용된다.배치 배양이나 체모스타트의 성장과 같은 미생물 생태 및 미생물학의 고전적인 기술은 미생물 서식지의 현세오-측두성 특성을 크게 무시했습니다. 광분해에 의한 마이크로스케일에서 화학 펄스를 거의 즉각적으로 생성하는 것은 다양한 소스에서 해양 박테리아가 야생에서 만나는 영양소 펄스의 유형을 재현하는 것을 목표로 합니다. 아미노알란 용액은 급성 독성이 있으며 극도의 주의를 기울여 처리해야합니다.우리는 연기 후드 아래에서만 일하며 실험실 코트, 안전 고글 및 장갑과 같은 보호 장비를 착용합니다. 우리는 또한 우리가 생성 한 폐기물을 돌봅니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Micropatterned 표면은 암세포와 Hyaluronic 산성 상호 작용을 연구하기 위해

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

연구

생체공학

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

의 순환 압력 생물 반응기 설계 예 VIVO</em대동맥 심장 밸브> 학습

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

테인 매개 인공 단백질 히드로 겔의 합성

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

적혈구 집계 동적 조사를위한 미세 유체 제어 환경

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

다양한 미생물 커뮤니티의 고밀도 배양위한 새로운 생물 반응기

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

제어 약물 릴리스에 대한 자기장 응답 하이브리드 젤라틴 마이크로 겔을 교류

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

셀 동작의 Nanotopographical 변조를위한 나노 패턴 기판 사용 스티치 기법을 확장

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

동적 3D 복막의 마이크로 디바이스의 모델링 난소 암 다세포 회전 타원체 동작

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

신경 임 플 란 트의 연 화 행동을 예측 하기 위해 환경 동적 기계적인 분석

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

스테셀레이트 비계에 단계별 세포 파종하여 발아 혈관을 연구합니다.

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...