Name: generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

Forfatterne takker det første mikrofabrikasjonsanlegget på ETH Zürich. Dette arbeidet ble støttet av en Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (til D.R.B.), en Gordon og Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (til R.S.), og en Swiss National Science Foundation stipend 1-002745-000 (til R.S.).

1. Fabrikasjon av mikrofluidisk enhet for enkelt kjemisk puls eksperiment
<ol><li>Design kanalen ved hjelp av dataassistert design (CAD) programvare og skriv den ut på en gjennomsiktigfilm for å lage fotomasken (Figur 1A).</li>
	<li>Fremstille mesteren ved myk litografi (under rene rom).<ol>
<li>Rengjør en silisiumwafer (4 tommer) i rask rekkefølge med aceton, metanol og isopropanol, og tørk deretter ved hjelp av nitrogen. Stek waferen i ovnen ved 130 °C i 5 min.</li...

<ol>
	<li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of the chemotactic response. , (1991).</li><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+structuring+of+marine+ecosystems.">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li><li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., Gonz&#225;lez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+recyclers:+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms.">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li><li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+diversity+modulates+population+performance.">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).</li><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients.">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+compounds:+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology.">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li><li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds:+New+tools+for+cellular+physiology.">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signal+integration+in+bacteria.">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li><li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal.">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li><li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus.">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li><li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes.">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985 (2015).</li><li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients.">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices.">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).</li><li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes.">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li><li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel,+fast+caged+neurotransmitters.">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li><li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm:+Photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li><li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T=298.15K.">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li><li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+properties+of+seawater:+a+review+of+existing+correlations+and+data.">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li><li>. Nikon depth of field calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019)</li><li>Ki&#248;rboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates:+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters.">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li><li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria.">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li><li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches.">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li><li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap.">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior.">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li><li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels.">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li></ol>

Denne metoden gjør det mulig for forskere å studere bakteriell chemotaxis under kontrollerte, dynamiske gradienter i mikro- og millifluidiske enheter, noe som muliggjør reproduserbar datainnsamling. Den nesten øyeblikkelige etableringen av kjemiske pulser på mikroskalaen ved fotolyse har som mål å reprodusere de typer næringspulser som bakterier møter i naturen fra en rekke kilder, for eksempel diffus spredning av plommer bak synkende marine partikler25,eller næringsstoffet sprer seg fra...

Mikrober stole på chemotaxis, prosessen med å oppdage kjemiske gradienter og modifisere motilitet som svar1, for å navigere kjemiske landskap, tilnærming næringskilder og verter, og unnslippe skadelige stoffer. Disse mikroskalaprosessene bestemmer makroskaleretikken til interaksjoner mellom mikrober og deres miljø2,3. Nylige fremskritt innen mikrofluidikk og mikrofabrikasjonsteknologier, inkludert myk litografi4,har revolusjonert vår evne til å skape kontrollerte mikromiljøer der vi kan studere mikrober. For eksempel har tidligere eksperimenter studert bakteriell chemotaxis ved å generere svært kontrollerte, stabile gradienter av mellomliggende til høye næringskonsentrasjoner5,6. Men i naturlige miljøer kan mikroskala kjemiske gradienter kortvarige – forsvant av molekylær diffusjon – og bakgrunnsforholdene er ofte svært fortynnede7. For å måle den kjemotaktiske responsen fra mikrobielle populasjoner som først ble utsatt for ustødige kjemiske miljøer, utviklet vi og her beskriver metoder for å kombinere mikrofluidisk teknologi med fotolyse, og dermed etterligne gradienter som ville bakterier møter i naturen.
Uncaging teknologi benytter lysfølsomme sonder som funksjonelt innkapsle biomolekyler i en inaktiv form. Bestråling frigjør burmolekylet, slik at målrettet perturbasjon av en biologisk prosess8. På grunn av den raske og presise kontrollen av cellulær kjemi som uncaging gir9,har fotolyse av burforbindelser tradisjonelt vært ansatt av biologer, fysiologer og nevrologer for å studere aktivering av gener10, ion kanaler11, og nevroner12. Mer nylig har forskere utnyttet de betydelige fordelene med fotolyse for å studere chemotaxis13, for å bestemme flagella bytte dynamikken i individuelle bakterielle celler utsatt for en trinnvis kjemoattractant stimulus14,15, og for å undersøke motilitetmønstre av enkelt sædceller i tredimensjonale (3D) gradienter16.
I vår tilnærming implementerer vi fotolyse av buraminosyrer i mikrofluidiske enheter for å studere atferdsresponsen til en bakteriell populasjon til kontrollerte kjemiske pulser, som blir nesten øyeblikkelig tilgjengelig gjennom fotoutgivelse. Bruk av et mål for lav forstørrelse (4x) (NA = 0,13, fokusdybde ca. 40 μm) gjør det mulig å både observasjonen av befolkningsnivået aggregativ respons av tusenvis av bakterier over et stort synsfelt (3,2 mm x 3,2 mm), og måling av bevegelse på encellenivå. Vi presenterer to anvendelser av denne metoden: 1) utgivelsen av en enkelt kjemisk puls for å studere bakteriell akkumulering-spredningsdynamikk fra ensartede forhold, og 2i) frigjøring av flere pulser for å karakterisere bakterieakkumuleringsdynamikken under tidsvarierende, romlig heterogene kjemoattractantforhold. Denne metoden har blitt testet på de marine bakteriene Vibrio ordalii utfører chemotaxis mot aminosyreglutamat17, men metoden er bredt anvendelig for ulike kombinasjoner av arter og kjemoattractanter, samt til biologiske prosesser utover chemotaxis (f.eks næringsopptak, antibiotikaeksponering, quorumssensing). Denne tilnærmingen lover å bidra til å belyse økologiog oppførsel av mikroorganismer i realistiske miljøer og å avdekke de skjulte avveiningene som individuelle bakterier står overfor når du navigerer flyktige dynamiske gradienter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>&#62;98% purity, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>to eliminate spent media from the bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubators Incu-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>390-0384</td>
			<td>to bake 3D master</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duster</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>16650-22</td>
			<td>to clean the wafer and microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>444-0601</td>
			<td>to bond the microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSafe micro centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688312</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>for image analysis and bacterial tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>631-1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon Eclipse TiE</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td>with motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNI-Glutamate</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1490</td>
			<td>&#62;98 % purity, photosensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing equipment</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Objet30 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing service</td>
			<td>3D Printing Studios</td>
			<td>Custom</td>
			<td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>to calibrate the uncaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscope Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven Venti-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>466-3516</td>
			<td>to bake PDMS (with forced convection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8-3050</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU8-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma chamber Zepto</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO-1</td>
			<td>to functionalize the surfaces before bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCT0447100</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size, 19 % open area, 24 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene microtubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>I.D. x O.D.: 0.015&#34; x 0.043&#34; / 0.38mm x 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>611-2605</td>
			<td>to weight PDMS mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Andor Zyla</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Product No. SS1-160p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2015</td>
			<td>Dassault Systemes SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td>Used to design the mold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencolor</td>
			<td></td>
			<td>for LED 395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>110-41-155</td>
			<td>PDMS Si Elastomer Kit; curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Luer-Lok)</td>
			<td>B Braun Omnifix</td>
			<td>4616308F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Needle</td>
			<td>Agani</td>
			<td>A228</td>
			<td>from 10 to 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump 11 Pico Plus Elite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroGrey</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Dual Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Mold Material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior

Vi demonstrerer en metode for generering av kontrollerte, dynamiske kjemiske pulser – der lokalisert kjemoattractant plutselig blir tilgjengelig på mikroskalaen – for å skape mikromiljøer for mikrobielle akserieeksperimenter. For å skape kjemiske pulser utviklet vi et system for å introdusere aminosyrekilder nær øyeblikkelig ved fotolyse av buraminosyrer i et mikrofluidant polydimethylsiloxane (PDMS) mikrofluidisk kammer som inneholder en bakteriell suspensjon. Vi brukte denne metoden på kjemotaktisk bakterie, Vibrio ordalii, som aktivt kan klatre disse dynamiske kjemiske gradienter mens de spores av videomikroskopi. Aminosyrer, gjengitt biologisk inert ('bur') ved kjemisk modifikasjon med en fotoremovable beskyttende gruppe, er jevnt tilstede i suspensjonen, men ikke tilgjengelig for forbruk før deres plutselige utgivelse, som oppstår på brukerdefinerte punkter i tid og rom ved hjelp av en nær-UV-A fokusert LED-stråle. Antall molekyler som frigjøres i pulsen kan bestemmes av en kalibreringssammenheng mellom eksponeringstid og uncaging fraksjon, hvor absorpsjonsspekteret etter fotolyse er preget av bruk av UV-Vis spektroskopi. En nanoporøs polykarbonat (PCTE) membran kan integreres i mikrofluidisk enhet for å tillate kontinuerlig fjerning ved strømning av de uformede forbindelsene og de brukte mediene. Et sterkt, irreversibelt bånd mellom PCTE membranog PDMS mikrofluidisk struktur oppnås ved å dekke membranen med en løsning av 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) etterfulgt av plasmaaktivering av overflatene som skal bindes. Et datastyrt system kan generere brukerdefinerte sekvenser av pulser på forskjellige steder og med forskjellige intensiteter, for å skape ressurslandskap med foreskrevet romlig og tidsmessig variasjon. I hvert kjemisk landskap kan dynamikken i bakteriell bevegelse i den enkelte skala og deres akkumulering på befolkningsnivå oppnås, og dermed tillate kvantifisering av kjemotaktisk ytelse og dens effekter på bakterielle aggregasjoner i økologisk relevante miljøer.

Vi brukte mikrofluidiske og millifluidiske enheter (figur 1) til å studere bakterielle akkumuleringsprofiler under dynamiske næringsforhold. Bakterielle baner ble hentet fra innspilte videoer kjøpt av fasekontrastmikroskopi av akkumuleringsspredningsdynamikken til en bakteriell populasjon etter en kjemisk puls utgitt av fotolyse (figur 2 og figur 3). Ved å snitte millioner av baner ble den spatiotemporale dynamikken i radial dri...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

En protokoll for generering av dynamiske kjemiske landskap etter fotolyse innenfor mikrofluidiske og millifluidiske oppsett presenteres. Denne metoden er egnet til å studere ulike biologiske prosesser, inkludert motilatferd, næringsopptak eller tilpasning til kjemikalier av mikroorganismer, både på enkeltcelle- og befolkningsnivå.

Generere kontrollerte, dynamiske kjemiske landskap for å studere mikrobiell atferd

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Denne metoden gjør det mulig å belyse mikroskalaøkologien og oppførselen til mikroorganismer som navigerer dynamiskkjemiske gradienter og avdekker deres skjulte avveininger, næringskinetikk og befolkningsdynamikk i økologisk relevante mikromiljøer. Ved å kombinere mikrofluidisk teknologi med fotolyse genererer vi kontrollerte kjemiske pulser, hvor lokalisert kjemoattractant plutselig blir tilgjengelig på mikroskalaen, for å måle den kjemotaktiske responsen til mikrobielle populasjoner som først ble utsatt for ustø kjemiske gradienter. Design kanalen ved hjelp av CAD-programvare, og skriv den ut på en gjennomsiktig film for å lage fotomasken.Fremstille mesteren ved myk litografi i et rent rom, ifølge manuskriptet. Forbered en PDMS-blanding ved å kombinere elastomeren med herdingsmiddelet ved et 10-til-en-forhold i et 40-milliliter beger. Med en plastkniv, bland kraftig til væsken er homogen.Umiddelbart degas PDMS blandingen i et vakuumkammer i 45 minutter ved romtemperatur. For å fremskynde prosessen, frigjør du med jevne mellomrom vakuumet for å sprenge boblene som dannes i grensesnittet. Fjern støv fra overflaten av mesteren med en trykksatt renere.Hell deretter den avgassede PDMS-blandingen på mesteren, og stek den i en ovn ved 80 grader Celsius i to timer. Skjær PDMS med et blad rundt mikrostrukturene i en avstand på ca fem millimeter, og fjern deretter FORSIKTIG PDMS fra mesteren. Punch hull for å tjene som innløp og utløp av mikrokanal.Forsegle mikrokanal med tape for å hindre opphopning av støv. Utform 3D-figuren ved hjelp av 3D-designprogramvare, og skriv ut master for PDMS-formen med en høyoppløselig 3D-skriver. Etter å ha forberedt og avgassing av PDMS-blandingen som gjort tidligere, rengjør overflaten av mesteren ved å dabbing med tape.Sett mesteren på en skala. Deretter, mens du unngår den sentrale regionen av master, hell 23,4 gram uregistrert PDMS blanding for å oppnå ønsket høyde av PDMS ved å matche høyden på master på 0,5 millimeter. Fjern eventuelle gjenværende bobler ved hjelp av trykkluft.Plasser PDMS kastet på master i en ovn på 45 grader Celsius å bake i minst 12 timer. Deretter skreller du forsiktig av det herdede PDMS-laget, og stanser innløps- og utløpshull for injeksjon av bakteriesuspensjonen. Aktiver både overflaten av en petriskål og PDMS-formen med oksygenplasma i to minutter.Bind PDMS-formen på petriskålen ved å trykke forsiktig formen til petriskålen. Unngå å trykke på hvor funksjonene er plassert. Plasser petriskålen bundet til PDMS 3D-formen i en ovn ved 45 grader Celsius i minst 12 timer for å styrke den kjemiske bindingen.Deretter aktiverer du nanoporisk polykarbonatmembran i et oksygenplasmakammer i ett minutt ved romtemperatur. Under en kjemisk hette, fortynne en kommersiell løsning av 3-aminopropyltriethoxysilane i deionisert vann til 1% av volum ved hjelp av en polypropylen rør. Overfør den fortynnede 3-aminopropyltrietoksysilaneløsningen i en petriskål, og senk den aktiverte membranen i 3-aminopropyltrietoksysilanløsningen i 20 minutter.Fjern deretter membranen fra 3-aminopropyltrietoksysilaneløsningen med pinsett, og legg den på et rent rom tørke for å tørke. For fabrikasjon av PDMS mikrofluidiske kanaler som vil ligge på membranen og tillate vasking av bakteriearenaen, gjenta fabrikasjonen av mikrofluidisk enhet for enkelt kjemisk pulseksperiment som gjort tidligere. For å binde PDMS vaskekanaler til den funksjonaliserte membranen, må du først aktivere både PDMS vaskekanal og polykarbonatmembranen med et oksygenplasmakammer i to minutter.Umiddelbart etter plasmabehandlingen, ta den funksjonaliserte membranen og PDMS vaskekanalen i kontakt ved å trykke forsiktig på PDMS vaskekanal på membranen. Det er viktig å forsiktig presse sammen PDMS og membranen, eller membranen kan være irreversibelt bundet til taket av 200-mikrometerhøyde PDMS mikrokanal. Deretter aktiverer du både den limte laminat pdms vaskekanal polykarbonatmembranen og 3D PDMS-formen som tidligere var bundet til petriskålen ved å plassere dem i et oksygenplasmakammer i to minutter.Smør membranen mellom to PDMS-lag, og trykk sammen. Plasser petriskålen bundet til sandwichstrukturen i en ovn på 45 grader Celsius i minst 12 timer for å styrke den kjemiske bindingen. For å begynne, opprettholde millifluidisk kammer under vakuum i 20 minutter.Deretter plasserer du petriskålen som inneholder millifluidkammeret på et mikroskopstadium. Med en pipette fyller du kammeret under membranen med den fortynnede bakterielle suspensjonen av GFP-fluorescerende Vibrio ordalii i en millimolar 4-metoksy-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamat løsning i kunstig sjøvann. Etter å ha fylt kanalen med bakteriell suspensjon, suge løsningen i overkant med et papirhåndkle, og forsegle innløp og utløp med PDMS plugger ved å forsiktig trykke dem inn i hullene.Fyll en sprøyte med en kunstig sjøvannsløsning av en millimolar 4-metoksy-7-nitroindolinyl-bur-L-glutamat, og fest slangen til innløpet og utløpet av vaskekanalen over membranen. Koble slangen til et avfallsbeholder, og sørg for at slangen er helt nedsenket i væskeavfallsbeholderen for å unngå trykksvingninger. Sett strømningshastigheten på sprøytepumpen til 50 mikroliter per minutt.Start sprøytepumpen for å etablere strømmen i vaskekanalen over membranen. Start programvaren som styrer LED-strålen og mikroskopstadiet, og generer brukerdefinerte sekvenser av pulser på forskjellige steder og med forskjellige intensiteter. Ta opp video ved hjelp av et mål på 4x med jevne mellomrom over en periode på flere timer og over flere sammenhengende steder for å dekke en stor overflate.I denne studien ble mikrofluidiske og millifluidiske enheter brukt til å studere bakteriell chemotaktisk respons og akkumuleringsprofiler under dynamiske næringsforhold. Maksimal intensitetsprojeksjoner viser bakterieposisjonen, indikert av hvite spor, over et intervall på 0,5 sekunder umiddelbart etter pulsutgivelsen og 40 sekunder etter pulsutgivelsen. Bakteriebanene ble også vist i svart 60 sekunder etter pulsutgivelsen.Den skyggelagte regionen representerer den kjemiske pulsen utgitt av fotolyse på tid null sekund midt i synsfeltet, som senere diffuserte. Den bakterielle konsentrasjonen, samt den timelige dynamikken i den radiale drifthastigheten etter en pulsutgivelse i midten av synsfeltet, vises her. Negative verdier av drifthastigheten tilsvarer rettet chemotaktisk bevegelse mot midten av pulsen.Svømmestatistikk presenteres her for en bakteriell populasjon i fravær av kjemiske gradienter. Baner representerer de todimensjonale projeksjonene av den tredimensjonale bakterielle bevegelsen i mikrokanal. Sannsynlighetsfordeling av målt bakteriesvømmehastighet var egnet av en gammafordeling.Fra bakteriebanene ble sannsynligheten fordelingen av tiden mellom påfølgende reorienteringer ekstrahert. Reorienteringsmønsteret, fordelingen av svømmehastighet og reorienteringsstatistikken til organismene ble brukt til å informere en individuell basert modell. Denne metoden har blitt testet på de marine bakteriene Vibrio ordalii utfører chemotaxis mot aminosyreglutamat, men den foreslåtte metodikken er bredt anvendelig for ulike kombinasjoner av arter og kjemoattractants, samt biologiske prosesser utover chemotaxis, som befolkning og samfunnsdynamikk i romlig heterogene og dynamiske forhold.Klassiske teknikker i mikrobiell økologi og mikrobiologi, som vekster i batchkulturer eller kjemostater, har i stor grad ignorert de spatio-temporale egenskapene til mikrobielle habitater. Den nesten øyeblikkelige opprettelsen av kjemiske pulser på mikroskalaene ved fotolyse tar sikte på å reprodusere den type næringspulser som marine bakterier møter i naturen fra en rekke kilder, for eksempel den diffuse spredningen av plommer bak synkende organiske partikler eller næringsstoffet som sprer seg fra lysede planteplanktonceller. Aminosilanoppløsningen er akutt giftig og bør håndteres med ekstrem forsiktighet.Vi jobber utelukkende under røykhetten og bruker verneutstyr som laboratoriefrakk, vernebriller og hansker. Vi tar også vare på avfallet vi genererte.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Syntese av en Intein-mediert Kunstig Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Kontrollert mikrofluid Miljø for Dynamic Gransking av røde blodceller Aggregation

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A Novel bioreaktor for High Density Dyrking av Diverse mikrobielle samfunn

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Vekslende magnetfelt-Responsive Hybrid Gelatin mikrogeler for kontrollert legemiddeldosering

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Utvide Nanopatterned Underlag Bruke Stitch Technique for Nanotopographical Modulation av Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modellering Eggstokkreft Flercellede spheroid Opptreden i en dynamisk 3D Peritoneal Microdevice

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

Miljømessige dynamisk mekanisk analyse å forutsi mykgjørende virkemåten av nevrale implantater

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Trinnvis cellesåing på flislagte stillaser for å studere spirende blodårer

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...