Name: generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00
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Os autores agradecem a primeira instalação de microfabricação na ETH Zurique. Este trabalho foi apoiado por um Australian Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (to D.R.B.), um Gordon and Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (to R.S.), e uma bolsa da Fundação Nacional de Ciência da Suíça 1-002745-000 (para R.S.).

1. Fabricação do Dispositivo Microfluido para o Experimento Único de Pulso Químico
<ol><li>Projete o canal usando o software de design auxiliado por computador (CAD) e imprima-o em um filme de transparência para criar a máscara fotográfica (Figura 1A).</li>
	<li>Fabricar o mestre por litografia suave (em condições de sala limpa).<ol>
<li>Limpe um wafer de silício (4 polegadas) em rápida sucessão com acetona, metanol e isopropanol, depois seque usando nitrogêni...

<ol>
	<li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of the chemotactic response. , (1991).</li><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+structuring+of+marine+ecosystems.">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li><li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., Gonz&#225;lez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+recyclers:+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms.">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li><li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+diversity+modulates+population+performance.">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).</li><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients.">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+compounds:+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology.">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li><li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds:+New+tools+for+cellular+physiology.">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signal+integration+in+bacteria.">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li><li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal.">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li><li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus.">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li><li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes.">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985 (2015).</li><li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients.">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices.">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).</li><li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes.">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li><li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel,+fast+caged+neurotransmitters.">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li><li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm:+Photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li><li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T=298.15K.">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li><li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+properties+of+seawater:+a+review+of+existing+correlations+and+data.">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li><li>. Nikon depth of field calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019)</li><li>Ki&#248;rboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates:+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters.">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li><li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria.">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li><li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches.">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li><li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap.">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior.">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li><li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels.">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li></ol>

Esse método permite que os pesquisadores estudem quimotáxis bacterianos gradientes controlados e dinâmicos em dispositivos micro e milífluidos, permitindo a aquisição de dados reprodutíveis. A criação quase instantânea de pulsos químicos na microescala por fotolise visa reproduzir os tipos de pulsos de nutrientes que as bactérias encontram na natureza a partir de uma variedade de fontes, por exemplo, a disseminação difusiva de plumas atrás de partículas marinhas afundando25, ou o n...

Micróbios dependem de quimotáxis, processo de detecção de gradientes químicos e modificação da motilidade na resposta1, para navegar em paisagens químicas, abordar fontes de nutrientes e hospedeiros e escapar de substâncias nocivas. Esses processos de microescala determinam a cinética macroescala das interações entre micróbios e seu ambiente2,3. Os recentes avanços em microfluidos e tecnologias de microfabricação, incluindo alitografia4, revolucionaram nossa capacidade de criar microambientes controlados para estudar as interações dos micróbios. Por exemplo, experimentos anteriores estudaram quimiotáxibacteria susindo gerando gradientes altamente controlados e estáveis de concentrações intermediárias a altas de nutrientes5,6. No entanto, em ambientes naturais, gradientes químicos de microescala podem ser de curta duração — dissipados por difusão molecular — e as condições de fundo são muitas vezes altamente diluídas7. Para medir diretamente a resposta quimiotática de populações microbianas expostas pela primeira vez a ambientes químicos instáveis, criamos e aqui descrevemos métodos para combinar tecnologia microfluida com fotolise, imitando gradientes que as bactérias selvagens encontram na natureza.
A tecnologia uncing emprega sondas sensíveis à luz que encapsulam funcionalmente biomoléculas de forma inativa. A irradiação libera a molécula enjaulada, permitindo a perturbação direcionada de um processo biológico8. Devido ao rápido e preciso controle da química celular que o uncaging oferece9,a fotolise de compostos enjaulados tem sido tradicionalmente empregada por biólogos, fisiologistas e neurocientistas para estudar a ativação dos genes10, canais íons11e neurônios12. Mais recentemente, os cientistas aproveitaram as vantagens significativas da fotolise para estudar quimotaxe13, para determinar a dinâmica de troca de flagella de células bacterianas individuais expostas a um estímulo quimioatraidor depassos 14,15, e para investigar padrões de motilidade de células de esperma única em gradientes tridimensionais (3D)16.
Em nossa abordagem, implementamos a fotolise de aminoácidos enjaulados dentro de dispositivos microfluidos para estudar a resposta comportamental de uma população bacteriana a pulsos químicos controlados, que se tornam quase instantaneamente disponíveis através da foto-lançamento. O uso de um objetivo de baixa ampliação (4x) (NA = 0,13, profundidade de foco aproximadamente 40 μm) permite tanto a observação da resposta agregadora em nível populacional de milhares de bactérias sobre um grande campo de visão (3,2 mm x 3,2 mm), quanto a medição do movimento no nível unicelular. Apresentamos duas aplicações deste método: 1) a liberação de um único pulso químico para estudar a dinâmica de acumulação bacteriana-dissipação a partir de condições uniformes, e 2i) a liberação de pulsos múltiplos para caracterizar a dinâmica de acumulação bacteriana em condições de quimioterapia variadas e espacialmente heterogêneas. Este método foi testado na bactéria marinha Vibrio ordalii realizando quimioterapia em direção ao glutamato aminoácido17,mas o método é amplamente aplicável a diferentes combinações de espécies e quimioatraintes, bem como a processos biológicos além da quimotaxe (por exemplo, absorção de nutrientes, exposição a antibióticos, sensoriamento de quórum). Essa abordagem promete ajudar a elucidar a ecologia e o comportamento dos microrganismos em ambientes realistas e descobrir as trocas ocultas que as bactérias individuais enfrentam ao navegar por gradientes dinâmicos efêmeros.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>&#62;98% purity, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>to eliminate spent media from the bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubators Incu-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>390-0384</td>
			<td>to bake 3D master</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duster</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>16650-22</td>
			<td>to clean the wafer and microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>444-0601</td>
			<td>to bond the microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSafe micro centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688312</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>for image analysis and bacterial tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>631-1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon Eclipse TiE</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td>with motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNI-Glutamate</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1490</td>
			<td>&#62;98 % purity, photosensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing equipment</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Objet30 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing service</td>
			<td>3D Printing Studios</td>
			<td>Custom</td>
			<td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>to calibrate the uncaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscope Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven Venti-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>466-3516</td>
			<td>to bake PDMS (with forced convection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8-3050</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU8-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma chamber Zepto</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO-1</td>
			<td>to functionalize the surfaces before bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCT0447100</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size, 19 % open area, 24 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene microtubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>I.D. x O.D.: 0.015&#34; x 0.043&#34; / 0.38mm x 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>611-2605</td>
			<td>to weight PDMS mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Andor Zyla</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Product No. SS1-160p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2015</td>
			<td>Dassault Systemes SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td>Used to design the mold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencolor</td>
			<td></td>
			<td>for LED 395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>110-41-155</td>
			<td>PDMS Si Elastomer Kit; curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Luer-Lok)</td>
			<td>B Braun Omnifix</td>
			<td>4616308F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Needle</td>
			<td>Agani</td>
			<td>A228</td>
			<td>from 10 to 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump 11 Pico Plus Elite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroGrey</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Dual Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Mold Material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior

Demonstramos um método para a geração de pulsos químicos controlados e dinâmicos — onde o quimioatrativo localizado se torna subitamente disponível na microescala — para criar microambientes para experimentos microbiano de quimioterapia. Para criar pulsos químicos, desenvolvemos um sistema para introduzir fontes de aminoácidos quase instantaneamente por fotolise de aminoácidos enjaulados dentro de uma câmara microfluida de polimetilsiloxano (PDMS) contendo uma suspensão bacteriana. Aplicamos esse método à bactéria quimotática, Vibrio ordalii, que pode escalar ativamente esses gradientes químicos dinâmicos enquanto é rastreado por microscopia de vídeo. Os aminoácidos, tornados biologicamente inertes ('enjaulados') por modificação química com um grupo de proteção fotoremovível, estão uniformemente presentes na suspensão, mas não estão disponíveis para consumo até sua liberação repentina, que ocorre em pontos definidos pelo usuário no tempo e espaço por meio de um feixe LED focado em UV-A próximo. O número de moléculas liberadas no pulso pode ser determinado por uma relação de calibração entre o tempo de exposição e a fração incessante, onde o espectro de absorção após a fotolise é caracterizado pelo uso da espectroscopia UV-Vis. Uma membrana policarbonato nanoporosa (PCTE) pode ser integrada ao dispositivo microfluido para permitir a remoção contínua pelo fluxo dos compostos sem tampa e da mídia gasta. Uma ligação forte e irreversível entre a membrana PCTE e a estrutura microfluida PDMS é alcançada revestindo a membrana com uma solução de 3 aminopropidaltriethoxysilane (APTES) seguida pela ativação plasmática das superfícies a serem ligadas. Um sistema controlado por computador pode gerar sequências definidas pelo usuário de pulsos em diferentes locais e com diferentes intensidades, de modo a criar paisagens de recursos com variabilidade espacial e temporal prescrita. Em cada paisagem química, a dinâmica do movimento bacteriano na escala individual e seu acúmulo no nível populacional podem ser obtidas, permitindo assim a quantificação do desempenho quimotático e seus efeitos sobre as agregações bacterianas em ambientes ecologicamente relevantes.

Usamos os dispositivos microfluidos e milífluidos(Figura 1)para estudar perfis de acumulação bacteriana em condições dinâmicas de nutrientes. Trajetórias bacterianas foram extraídas de vídeos gravados adquiridos pela microscopia de contraste de fase da dinâmica de acumulação-dissipação de uma população bacteriana após um pulso químico liberado pela fotolise(Figura 2 e Figura 3). Com uma média de milhões de trajet...

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Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

É apresentado um protocolo para a geração de paisagens químicas dinâmicas por fotolise dentro de configurações microfluidas e milfluidas. Essa metodologia é adequada para estudar diversos processos biológicos, incluindo o comportamento motil, a absorção de nutrientes ou adaptação a produtos químicos de microrganismos, tanto no nível celular quanto populacional.

Gerando paisagens químicas controladas e dinâmicas para estudar comportamento microbiano

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Este método permite elucidar a ecologia de microescala e o comportamento dos microrganismos navegando em gradientes químicos dinâmicos e descobrir suas trocas ocultas, cinética de nutrientes e dinâmica populacional em microambientes ecologicamente relevantes. Ao combinar tecnologia microfluida com fotolise, geramos pulsos químicos controlados, onde o quimioattractant localizado se torna subitamente disponível na microescala, para medir a resposta quimotactica de populações microbianas primeiro expostas a gradientes químicos instáveis. Projete o canal usando o software CAD e imprima-o em uma película de transparência para criar a máscara fotográfica.Fabricar o mestre por litografia macia em uma sala limpa, de acordo com o manuscrito. Prepare uma mistura de PDMS combinando o elastômero com seu agente de cura a uma proporção de 10 para um em um béquer de 40 mililitros. Com uma faca de plástico, misture vigorosamente até que o líquido fique homogêneo.Imediatamente desgase a mistura PDMS em uma câmara de vácuo por 45 minutos à temperatura ambiente. Para acelerar o processo, solte periodicamente o vácuo para estourar as bolhas que se formam na interface. Remova o pó da superfície do mestre com um limpador pressurizado.Em seguida, despeje a mistura pdms desgaseada sobre o mestre, e asse-a em um forno a 80 graus Celsius por duas horas. Corte o PDMS com uma lâmina ao redor das microestruturas a uma distância de aproximadamente cinco milímetros e, em seguida, retire cuidadosamente o PDMS do mestre. Furos para servir como entrada e saída do microcanal.Sele o microcanal com fita adesiva para evitar o acúmulo de poeira. Projete a forma 3D usando software de design 3D e imprima o mestre para o molde PDMS com uma impressora 3D de alta resolução. Depois de preparar e desgasear a mistura PDMS como feito anteriormente, limpe a superfície do mestre, dabbing com fita adesiva.Coloque o mestre em uma escala. Em seguida, evitando a região central do mestre, despeje 23,4 gramas de mistura PDMS nãocurada, a fim de obter a altura desejada do PDMS, correspondendo à altura do mestre em 0,5 milímetros. Remova as bolhas restantes com a ajuda do ar comprimido.Coloque o PDMS no mestre em um forno a 45 graus Celsius para assar por pelo menos 12 horas. Em seguida, retire suavemente a camada PDMS endurecida e fure os orifícios de entrada e saída para a injeção da suspensão bacteriana. Ative a superfície de uma placa de Petri e o molde PDMS com plasma de oxigênio por dois minutos.Conecte o molde PDMS na placa de Petri pressionando suavemente o molde para a placa de Petri. Evite pressionar onde as características estão localizadas. Coloque a placa de Petri ligada ao molde PDMS 3D em um forno a 45 graus Celsius por pelo menos 12 horas para fortalecer a ligação química.Em seguida, ative a membrana de policarbonato nanoporoso em uma câmara de plasma de oxigênio por um minuto à temperatura ambiente. Sob uma capa química, diluir uma solução comercial de 3-aminopropyltrietooxysilane em água deionizada para 1% em volume usando um tubo de polipropileno. Transfira a solução diluída de 3-aminopropilyltrietoxisilane em uma placa de Petri e mergulhe a membrana ativada na solução de 3-aminopropyltrietotoxisilane por 20 minutos.Em seguida, remova a membrana da solução de 3-aminopropiltotoxisilano com pinças, e coloque-a em um limpador de quarto limpo para secar. Para a fabricação dos canais microfluidos PDMS que se deitarão sobre a membrana e permitirão a lavagem da arena bacteriana, repita a fabricação do dispositivo microfluido para o único experimento de pulso químico como feito anteriormente. Para ligar os canais de lavagem PDMS à membrana funcionalizada, primeiro ative o canal de lavagem PDMS e a membrana de policarbonato com uma câmara de plasma de oxigênio por dois minutos.Imediatamente após o tratamento plasmápico, coloque a membrana funcionalizada e o canal de lavagem PDMS em contato pressionando suavemente o canal de lavagem PDMS na membrana. É importante pressionar suavemente o PDMS e a membrana, ou a membrana pode ser irreversivelmente ligada ao teto do microcanal de 200 micrômetros de altura PDMS. Em seguida, ative tanto a membrana de policarbonato do canal de lavagem do canal de lavagem laminado ligado e o molde 3D PDMS anteriormente ligado à placa de Petri, colocando-os em uma câmara de plasma de oxigênio por dois minutos.Sanduiche a membrana entre duas camadas de PDMS e pressione juntas. Coloque a placa de Petri ligada à estrutura do sanduíche em um forno a 45 graus Celsius por pelo menos 12 horas para fortalecer a ligação química. Para começar, mantenha a câmara millifluidica sob vácuo por 20 minutos.Em seguida, coloque a placa de Petri contendo a câmara millifluidica em um estágio de microscópio. Com uma pipeta, encha a câmara abaixo da membrana com a suspensão bacteriana diluída de Víbelo ordalii fluorescente GFP em uma solução de um milimolar 4-metoxi-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamato em água do mar artificial. Depois de encher o canal com a suspensão bacteriana, suge a solução em excesso com uma toalha de papel, e veda a entrada e saída com plugues PDMS pressionando-os suavemente nos orifícios.Encha uma seringa com uma solução artificial de água do mar de um mililitro 4-metoxi-7-nitroindolinyl-caged-L-glutamato, e conecte tubos à entrada e saída do canal de lavagem acima da membrana. Conecte a tubulação a um reservatório de resíduos e garanta que a tubulação esteja totalmente submersa no reservatório de resíduos de fluidos para evitar oscilações de pressão. Defina a taxa de fluxo na bomba de seringa para 50 microliters por minuto.Inicie a bomba de seringa para estabelecer o fluxo no canal de lavagem acima da membrana. Inicie o software que controla o feixe led e o estágio do microscópio, e gere sequências de pulsos definidas pelo usuário em diferentes locais e com diferentes intensidades. Grave vídeo usando um objetivo de 4x em intervalos de tempo regulares durante um período de várias horas e em vários locais contíguos para cobrir uma grande superfície.Neste estudo, foram utilizados os dispositivos microfluidos e millifluidos para estudar perfis de resposta quimotactic bacteriana e acumulação em condições dinâmicas de nutrientes. As projeções de intensidade máxima mostram a posição bacteriana, indicada por traços brancos, durante um intervalo de 0,5 segundos imediatamente após a liberação do pulso e 40 segundos após a liberação do pulso. As trajetórias bacterianas também foram mostradas em preto 60 segundos após a liberação do pulso.A região sombreada representa o pulso químico liberado pela fotolise no momento zero segundo no meio do campo de visão, que posteriormente difundiu. A concentração bacteriana, bem como a dinâmica temporal da velocidade de deriva radial após uma liberação de pulso no centro do campo de visão são mostrados aqui. Os valores negativos da velocidade de deriva correspondem ao movimento quimotactico direcionado em direção ao centro do pulso.Estatísticas de natação são apresentadas aqui para uma população bacteriana na ausência de gradientes químicos. Trajetórias representam as projeções bidimensionais do movimento bacteriano tridimensional no microcanal. A distribuição da probabilidade de velocidade de natação bacteriana medida foi encaixada por uma distribuição gama.A partir das trajetórias bacterianas, foi extraída a distribuição de probabilidades do tempo entre reorientações sucessivas. O padrão de reorientação, a distribuição da velocidade da natação e as estatísticas de reorientação dos organismos foram utilizados para informar um modelo individual. Este método foi testado na bactéria marinha Vibrio ordalii realizando quimotaxis em direção ao glutamato de aminoácidos, mas a metodologia proposta é amplamente aplicável a diferentes combinações de espécies e quimioattractants, bem como a processos biológicos além da quimiotaxis, como a dinâmica populacional e comunitária em condições espacialmente heterogêneas e dinâmicas.Técnicas clássicas em ecologia microbiana e microbiologia, como crescimentos em culturas em lote ou quimiostatas, têm ignorado em grande parte as características espátulas-temporais dos habitats microbianos. A criação quase instantânea de pulsos químicos nas microescalas por fotolise visa reproduzir o tipo de pulsos de nutrientes que as bactérias marinhas encontram na natureza a partir de uma variedade de fontes, por exemplo, a propagação difusa de plumas por trás de partículas orgânicas afundando ou o nutriente que se espalha de células fitoplânctons lícitas. A solução de aminosilano é agudamente tóxica e deve ser tratada com extremo cuidado.Trabalhamos exclusivamente sob o capô da fumaça e usamos equipamentos de proteção como jaleco, óculos de segurança e luvas. Também cuidamos dos resíduos que geramos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Superfícies micropatterned para estudar as interações ácido hialurônico com células de câncer

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Bioengenharia

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Projeto de um biorreator de pressão cíclica para o Ex Vivo Estudo de válvulas cardíacas Aórtica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Síntese de uma proteína artificial intein mediada Hidrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Ambiente Microfluidic controlada de Investigação dinâmico de Agregação Glóbulo Vermelho

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

Um biorreator Novel de Cultivo de Alta Densidade de diversas comunidades microbianas

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Alternando microgéis de gelatina híbrido Campo-Responsive magnética para controlada de fármacos de libertação

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Expansão Nanopatterned Substratos usar a técnica do ponto de Nanotopographical modulação do comportamento celular

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modelagem do comportamento do cancro do ovário multicelular Spheroid em um microdispositivos 3D Peritoneal Dinâmico

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

Análise mecânica dinâmica ambiental para prever o comportamento de amaciamento de implantes neurais

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Semeadura de células stepwise em andaimes tesavendados para estudar vasos sanguíneos brotando

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...