Name: generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

Авторы благодарят первый объект микрофабрикации в ETH Цюрихе. Эта работа была поддержана Австралийский научно-исследовательский совет Discovery Ранняя карьера Исследователь премии DE180100911 (d.R.B.), Гордон и Бетти Мур морской микробной инициативы Следователь премии GBMF3783 (в Р.С.), и Швейцарский национальный научный фонд грант 1-002745-000 (до Р.С.).

1. Изготовление микрожидкости для однохимическо-импульсного эксперимента
<ol><li>Дизайн канала с помощью компьютерного дизайна (CAD) программного обеспечения и распечатать его на пленку прозрачности для создания фото маски (Рисунок 1A).</li>
	<li>Изготовить мастера с п...

<ol>
	<li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of the chemotactic response. , (1991).</li><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+structuring+of+marine+ecosystems.">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li><li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., Gonz&#225;lez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+recyclers:+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms.">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li><li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+diversity+modulates+population+performance.">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).</li><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients.">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+compounds:+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology.">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li><li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds:+New+tools+for+cellular+physiology.">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signal+integration+in+bacteria.">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li><li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal.">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li><li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus.">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li><li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes.">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985 (2015).</li><li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients.">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices.">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).</li><li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes.">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li><li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel,+fast+caged+neurotransmitters.">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li><li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm:+Photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li><li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T=298.15K.">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li><li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+properties+of+seawater:+a+review+of+existing+correlations+and+data.">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li><li>. Nikon depth of field calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019)</li><li>Ki&#248;rboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates:+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters.">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li><li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria.">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li><li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches.">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li><li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap.">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior.">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li><li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels.">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li></ol>

Этот метод позволяет исследователям изучать бактериальный хемотаксис под контролируемыми, динамическими градиентами в микро- и миллифлюидных устройствах, что позволяет воспроизводимое получение данных. Почти мгновенное создание химических импульсов на микромасштабе путем фотолиз?...

Микробы полагаются на хемотаксис, процесс обнаружения химических градиентов и изменения подвижности в ответ1, для навигации химических ландшафтов, подход источников питательных веществ и хостов, и избежать вредных веществ. Эти микромасштабные процессы определяют макромасштабную кинетику взаимодействий между микробами и их окружающей средой2,3. Последние достижения в области микрофлюитики и технологий микрофабрикации, включая мягкую литографию4,произвели революцию в нашей способности создавать управляемые микросреды, в которых можно изучать взаимодействие микробов. Например, прошлые эксперименты изучали бактериальный химиотаксис, генерируя высококонтролируемые, стабильные градиенты промежуточных и высоких концентраций питательных веществ5,6. Тем не менее, в естественной среде, микромасштабные химические градиенты могут быть недолговечными, рассеяны молекулярной диффузией, а фоновые условия часто сильно разбавляют7. Чтобы непосредственно измерить химиотаксическую реакцию микробных популяций, впервые подвергшихся воздействию нестационарной химической среды, мы разработали и здесь описали методы объединения микрофлюидной технологии с фотоизисом, тем самым имитируя градиенты, с которыми встречаются дикие бактерии в природе.
Технология uncaging использует светочувствительные зонды, которые функционально инкапсулируют биомолекулы в неактивной форме. Облучение высвобождает клетку молекулы, что позволяет целенаправленное возмущение биологического процесса8. Из-за быстрого и точного контроля клеточной химии, что uncaging дает9, фотолиза в клетке соединений традиционно используется биологами, физиологами и нейробиологами для изучения активации генов10, ионных каналов11, и нейронов12. Совсем недавно, ученые использовали значительные преимущества фотолиза для изучения химиотаксиса13, чтобы определить флагеллы переключения динамики отдельных бактериальных клеток подвергаются пошаговой химиоаттованта стимул14,15, и для изучения моделей подвижности одиночных клеток спермы в трехмерных (3D) градиентов16.
В нашем подходе мы внедряем фотоиз аминокислот в клетке в микрофлюидных устройствах для изучения поведенческой реакции бактериальной популяции на контролируемые химические импульсы, которые становятся почти мгновенно доступными с помощью фоторелиза. Использование цели с низким увеличением (4x) (NA 0.13, глубина фокусировки приблизительно 40 мкм) позволяет как наблюдать агрегационную реакцию тысяч бактерий на уровне населения на большом поле зрения (3,2 мм х 3,2 мм), так и измерение движения на одноклеточном уровне. Мы представляем два применения этого метода: 1) выпуск одного химического импульса для изучения бактериального накопления-динамики рассеивания, начиная с однородных условий, и 2i) выпуск нескольких импульсов, чтобы охарактеризовать динамику бактериального накопления в соответствии с временем-изменяющихся, пространственно неоднородных химиоаттантов условиях. Этот метод был протестирован на морских бактерий Vibrio ordalii выполнения химиотаксиса к аминокислоте глутамата17, но метод широко применим к различным комбинациям видов и хемоаттантов, а также к биологическим процессам за химиотаксис (например, поглощение питательных веществ, воздействие антибиотиков, кворум зондирования). Этот подход обещает помочь прояснить экологию и поведение микроорганизмов в реалистичной среде и раскрыть скрытые компромиссы, с которыми сталкиваются отдельные бактерии при навигации по эфемерным динамическим градиентам.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>&#62;98% purity, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>to eliminate spent media from the bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubators Incu-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>390-0384</td>
			<td>to bake 3D master</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duster</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>16650-22</td>
			<td>to clean the wafer and microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>444-0601</td>
			<td>to bond the microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSafe micro centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688312</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>for image analysis and bacterial tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>631-1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon Eclipse TiE</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td>with motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNI-Glutamate</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1490</td>
			<td>&#62;98 % purity, photosensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing equipment</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Objet30 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing service</td>
			<td>3D Printing Studios</td>
			<td>Custom</td>
			<td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>to calibrate the uncaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscope Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven Venti-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>466-3516</td>
			<td>to bake PDMS (with forced convection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8-3050</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU8-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma chamber Zepto</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO-1</td>
			<td>to functionalize the surfaces before bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCT0447100</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size, 19 % open area, 24 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene microtubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>I.D. x O.D.: 0.015&#34; x 0.043&#34; / 0.38mm x 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>611-2605</td>
			<td>to weight PDMS mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Andor Zyla</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Product No. SS1-160p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2015</td>
			<td>Dassault Systemes SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td>Used to design the mold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencolor</td>
			<td></td>
			<td>for LED 395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>110-41-155</td>
			<td>PDMS Si Elastomer Kit; curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Luer-Lok)</td>
			<td>B Braun Omnifix</td>
			<td>4616308F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Needle</td>
			<td>Agani</td>
			<td>A228</td>
			<td>from 10 to 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump 11 Pico Plus Elite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroGrey</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Dual Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Mold Material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior

Мы демонстрируем метод генерации контролируемых динамических химических импульсов, при котором локализованный хемоатантант внезапно становится доступным в микромасштабе для создания микро-сред для экспериментов по микробным химиотаксисам. Для создания химических импульсов мы разработали систему для введения аминокислотных источников почти мгновенно фотолиза клетчатых аминокислот в микрофлюидной камере полиметилсилоксана (PDMS), содержащей бактериальную суспензию. Мы применили этот метод к химиотаксической бактерии, Vibrio ordalii, которые могут активно подниматься эти динамические химические градиенты, будучи отслеживается видеомикроскопией. Аминокислоты, оформляемые биологически инертными ('клетками') химической модификацией с фоторедвижутой защитной группой, равномерно присутствуют в подвеске, но не доступны для потребления до их внезапного выброса, которое происходит в определенных пользователем точках во времени и пространстве с помощью почти УФ-А сфокусированного светодиодного луча. Количество молекул, выделяемых в пульсе, может быть определено путем калибровки между временем воздействия и нестыкающейся фракцией, где спектр поглощения после фотолиза характеризуется использованием УФ-Вис спектроскопии. Нанопоросая поликарбонатная (PCTE) мембрана может быть интегрирована в микрофлюидное устройство, чтобы позволить непрерывное удаление потоком неизлечимых соединений и отработанных носителей. Сильная, необратимая связь между мембраной PCTE и микрофлюидной структурой PDMS достигается путем покрытия мембраны раствором 3-аминопропилтриэтитоксилана (APTES), за которым следует плазменная активация поверхностей, которые должны быть связаны. Управляемая компьютером система может генерировать пользовательские последовательности импульсов в разных местах и с разной интенсивностью, с тем чтобы создать ресурсные ландшафты с предписанной пространственной и временной изменчивостью. В каждом химическом ландшафте можно получить динамику бактериального движения в индивидуальном масштабе и их накопление на уровне популяции, что позволяет количественно определить химиотаксическую эффективность и ее воздействие на бактериальные агрегаты в экологически значимых средах.

Мы использовали микрофлюидные и миллифлюдические устройства(рисунок 1)для изучения профилей накопления бактерий в динамических условиях питательных веществ. Бактериальные траектории были извлечены из записанных видео, полученных фазовой контрастной микроскопией ди...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Представлен протокол для генерации динамических химических ландшафтов с помощью фотолиза в микрофлюидных и миллифлюдических установках. Эта методология подходит для изучения различных биологических процессов, включая подвижное поведение, поглощение питательных веществ или адаптацию к химическим веществам микроорганизмов, как на уровне одной клетки, так и на уровне популяции.

Создание контролируемых, динамических химических ландшафтов для изучения микробного поведения

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Этот метод позволяет прояснить микромасштабную экологию и поведение микроорганизмов, перемещающих динамические химические градиенты, и выявить их скрытые компромиссы, кинетику питательных веществ и динамику популяции в экологически релевантных микроокружениях. Комбинируя микрофлюидные технологии с фотолизом, мы генерируем контролируемые химические импульсы, где локализованный химиоаттракант внезапно становится доступным на микромасштабе, чтобы измерить химиотаксическую реакцию микробных популяций, впервые подвергшихся воздействию нестационарных химических градиентов. Дизайн канала с помощью программного обеспечения CAD, и распечатать его на прозрачность фильма для создания фото маски.Изготовление мастера мягкой литографии в чистой комнате, в соответствии с рукописью. Подготовь смесь PDMS, объединив еластомер с его лечебным агентом в соотношении 10 к одному в 40-миллилитровом стакане. С пластиковым ножом, смесь энергично, пока жидкость однородна.Немедленно дегазации смеси PDMS в вакуумной камере в течение 45 минут при комнатной температуре. Чтобы ускорить процесс, периодически выпускайте вакуум, чтобы лопнуть пузырьки, которые образуются на интерфейсе. Удалите пыль с поверхности мастера с помощью герметичного очистителя.Затем залить дегазированную смесь PDMS на хозяина, и выпекать его в духовке при температуре 80 градусов по Цельсию в течение двух часов. Вырежьте PDMS лезвием вокруг микроструктур на расстоянии около пяти миллиметров, а затем тщательно очистить PDMS от мастера. Удар отверстия, чтобы служить в качестве входных и выход микроканал.Печать микроканал с клейкой лентой, чтобы предотвратить накопление пыли. Дизайн 3D-формы с использованием 3D-дизайна программного обеспечения, и распечатать мастер для формы PDMS с высоким разрешением 3D принтера. После подготовки и дегазации смеси PDMS, как это было сделано ранее, очистить поверхность мастера, dabbing с клейкой лентой.Поставь мастера на шкалу. Затем, избегая центральной области мастера, залить 23,4 грамма неохвечьей смеси PDMS для того, чтобы получить желаемую высоту PDMS путем сопоставления высоты мастера на 0,5 миллиметра. Удалите оставшиеся пузырьки с помощью сжатого воздуха.Поместите PDMS литые на мастера в духовке при температуре 45 градусов по Цельсию, чтобы испечь, по крайней мере 12 часов. Затем аккуратно снимите затвердевший слой PDMS и пробите входные и розетки отверстия для инъекции бактериальной суспензии. Активируйте поверхность чашки Петри и форму PDMS с кислородной плазмой в течение двух минут.Скрепление формы PDMS на чашке Петри, осторожно прижимая плесень к чашке Петри. Избегайте нажатия, где расположены объекты. Поместите чашку Петри, связанную с формой PDMS 3D, в духовку при температуре 45 градусов по Цельсию в течение по крайней мере 12 часов, чтобы укрепить химическую связь.Затем активируйте нанопорную поликарбонатную мембрану в кислородной плазменной камере в течение одной минуты при комнатной температуре. Под химическим капотом разбавить коммерческий раствор 3-аминопропилтриетоксисилана в деионизированной воде до 1%по объему с помощью полипропилетовой трубки. Перенесите разбавленный раствор 3-аминопропилтриэтоксиоксана в чашку Петри и погрузите активированную мембрану в 3-аминопропилтриетоксисилановый раствор на 20 минут.Затем снимите мембрану с 3-аминопропилтриетоксисилана раствором пинцетом и поместите его на чистую комнатную салфетку, чтобы высохнуть. Для изготовления микрофлюидных каналов PDMS, которые будут лежать на мембране и позволят мыть бактериальной арене, повторите изготовление микрофлюидного устройства для одного химического импульсного эксперимента, как это было сделано ранее. Чтобы сблизить каналы промывки PDMS с функциональной мембраной, сначала активируйте как канал промывки PDMS, так и поликарбонатную мембрану с кислородной плазменной камерой в течение двух минут.Сразу же после плазменной обработки, привести функциональной мембраны и КАНАЛА промывки PDMS в контакт, мягко нажав канал промывки PDMS на мембрану. Важно, чтобы мягко нажать вместе PDMS и мембраны, или мембрана может быть необратимо связаны с потолком 200-микрометровой высоты PDMS микроканал. Затем активируйте как кабенные ламинат PDMS стиральный канал поликарбонатной мембраны и 3D PDMS плесень ранее связаны с чашкой Петри, поместив их в кислородную плазменную камеру в течение двух минут.Сэндвич мембраны между двумя слоями PDMS, и нажмите вместе. Поместите чашку Петри, связанную со структурой сэндвича, в духовку при температуре 45 градусов по Цельсию в течение по крайней мере 12 часов, чтобы укрепить химическую связь. Для начала, поддерживать миллифлюидную камеру под вакуумом в течение 20 минут.Затем поместите чашку Петри, содержащую миллифлюидную камеру, на сцену микроскопа. С пипеткой, заполнить камеру под мембраной с разбавленной бактериальной суспензии GFP-флуоресцентных Vibrio ordalii в одномиллимоляной 4-methoxy-7-нитроиндолинил-клетчатый-L-глутамат раствор в искусственной морской воде. После заполнения канала бактериальной суспензией, сосать раствор в избытке с бумажным полотенцем, и печать вход и розетку с PDMS пробки, осторожно нажав их в отверстия.Заполните шприц искусственным раствором морской воды из одномиллимолярского 4-метокси-7-нитроиндолинила-клетки-L-глутамата, а также прикрепите трубки к входу и выходу стирального канала над мембраной. Подключите трубы к резервуару отходов и убедитесь, что трубы полностью погружены в резервуар жидких отходов, чтобы избежать колебаний давления. Установите скорость потока на насосе шприца до 50 микролитров в минуту.Запустите шприц-насос, чтобы установить поток в стиральном канале над мембраной. Запустите программное обеспечение, контролируя светодиодный луч и стадию микроскопа, и генерируйте пользовательские последовательности импульсов в разных местах и с разной итонией. Запись видео с использованием 4x цели на регулярной основе в течение нескольких часов и более нескольких смежных местах, чтобы покрыть большую поверхность.В этом исследовании, микрофлюидные и миллифлюидные устройства были использованы для изучения бактериальной химиотатической реакции и накопления профилей в динамических условиях питательных веществ. Максимальные проекции интенсивности показывают бактериальное положение, указанное белыми следами, в течение 0,5-секундного интервала сразу после высвобождения импульса и через 40 секунд после высвобождения импульса. Бактериальные траектории были также показаны черным через 60 секунд после высвобождения импульса.Затененная область представляет химический импульс, выпущенный фотолизом в то время нулевой секундой в середине поля зрения, который впоследствии рассеялся. Здесь показана бактериальная концентрация, а также височная динамика скорости радиального дрейфа после высвобождения импульса в центре поля зрения. Отрицательные значения скорости дрейфа соответствуют направленному хемотаксическому движению к центру пульса.Статистика плавания представлена здесь для бактериальной популяции при отсутствии химических градиентов. Траектории представляют собой двумерные проекции трехмерного бактериального движения в микроканале. Распределение вероятности измеренной скорости бактериального плавания было приспособлено гамма-распределением.Из бактериальных траекторий было извлечено распределение вероятности времени между последовательными переориентациями. Для информирования индивидуальной модели использовались модель переориентации, распределение скорости плавания и статистика переориентации организмов. Этот метод был протестирован на морских бактериях Vibrio ordalii, выполняющих хемотаксис по отношению к аминокислотному глутамату, но предлагаемая методология широко применима к различным сочетаниям видов и хемоаттрактанов, а также к биологическим процессам, выходящим за рамки хемотаксиса, таким как динамика популяции и сообщества в пространственно неоднородных и динамических условиях.Классические методы в микробной экологии и микробиологии, такие как рост в пакетных культурах или хемостаты, в значительной степени игнорируют пространственно-временные характеристики микробных мест обитания. Почти мгновенное создание химических импульсов на микромасштабах с помощью фотолиза направлено на воспроизведение типа питательных импульсов, с которыми морские бактерии сталкиваются в дикой природе из целого ряда источников, например, диффузного распространения шлейфов за тонущими органическими частицами или питательных веществ, распространяющихся из лищевых клеток фитопланктона. Раствор аминосилана является остро токсичным и должен быть обработан с крайней осторожностью.Мы работаем исключительно под капотом дыма и носим защитное оборудование, как лабораторное пальто, защитные очки и перчатки. Мы также заботимся об отходах, которые мы произвели.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Micropatterned Поверхности по изучению Гиалуроновая кислота Взаимодействие с раковыми клетками

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Синтез интеин-опосредованной искусственного белка гидрогеля

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Контролируемая Микрожидкостных Окружающая среда для динамического исследования эритроцитов агрегации

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

Роман биореактор для высокой плотности Выращивание разнородных микробных сообществ

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Переменное магнитное поле-Отзывчивый Hybrid желатиновых микрогелей для дозирования лекарственных препаратов

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Расширение наноструктурированных подложках с использованием стежка Техника для Nanotopographical модуляции клеточной поведения

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Моделирование рака яичников Многоклеточная Сфероид Поведение в микроустройство Dynamic 3D перитонеального

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

Экологические динамический механический анализ предсказать размягчения поведение нейронные имплантаты

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Пошаговый посев клеток на тесселлированных каркасах для изучения прорастающего кровеносного сосуда

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...