Name: generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

Författarna tackar den första mikrotillverkning anläggningen på ETH Zürich. Detta arbete stöddes av en australisk Research Council Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (till D.R.B.), en Gordon och Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (till RS), och en Swiss National Science Foundation bidrag 1-002745-000 (till R.S.).

1. Tillverkning av mikrofluidisk enhet för Single Chemical-pulse Experiment
<ol><li>Designa kanalen med hjälp av datorstödd design (CAD) programvara och skriv ut den på en genomskinlighetfilm för att skapa fotomask(figur 1A).</li>
	<li>Tillverka befälhavaren genom mjuk litografi (under renrumsförhållanden).<ol>
<li>Rengör en kisel wafer (4 inches) i snabb följd med aceton, metanol och isopropanol, torka sedan med kväve. Grädda wafer i ugnen vid 130 °C i 5 min....

<ol>
	<li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of the chemotactic response. , (1991).</li><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+structuring+of+marine+ecosystems.">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li><li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., Gonz&#225;lez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+recyclers:+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms.">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li><li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+diversity+modulates+population+performance.">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).</li><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients.">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+compounds:+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology.">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li><li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds:+New+tools+for+cellular+physiology.">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signal+integration+in+bacteria.">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li><li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal.">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li><li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus.">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li><li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes.">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985 (2015).</li><li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients.">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices.">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).</li><li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes.">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li><li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel,+fast+caged+neurotransmitters.">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li><li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm:+Photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li><li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T=298.15K.">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li><li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+properties+of+seawater:+a+review+of+existing+correlations+and+data.">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li><li>. Nikon depth of field calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019)</li><li>Ki&#248;rboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates:+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters.">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li><li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria.">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li><li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches.">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li><li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap.">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior.">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li><li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels.">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li></ol>

Denna metod gör det möjligt för forskare att studera bakteriell chemotaxis under kontrollerade, dynamiska gradienter i mikro- och millifluidiska enheter, vilket möjliggör reproducerbara datainsamling. Den nästan ögonblickliga skapandet av kemiska pulser på mikroskala genom fotolys syftar till att reproducera de typer av näringspulser som bakterier möter i naturen från en rad källor, till exempel diffusive spridning av plymer bakom sjunkande marina partiklar25,eller näringsämne spride...

Mikrober förlitar sig på chemotaxis, processen att upptäcka kemiska gradienter och ändra motilitet som svar1,att navigera kemiska landskap, närma sig näringskällor och värdar, och undkomma skadliga ämnen. Dessa mikroskala processer bestämma makroskala kinetik av interaktioner mellan mikrober och deras miljö2,3. De senaste framstegen inom mikrofluidik och mikrotillverkning teknik, inklusive mjuk litografi4,har revolutionerat vår förmåga att skapa kontrollerade mikromiljöer för att studera interaktioner av mikrober. Till exempel har tidigare experiment studerat bakteriell chemotaxis genom att generera mycket kontrollerade, stabila lutningar av mellanliggande till höga näringskoncentrationer5,6. I naturliga miljöer kan dock mikroskalakemiska gradienter vara kortlivade – skingras av molekylär diffusion – och bakgrundsförhållanden är ofta mycket utspädda7. För att direkt mäta chemotactic svar av mikrobiellpopulationer först utsätts för ostadiga kemiska miljöer, vi utarbetat och här beskriva metoder för att kombinera mikrofluidisk teknik med fotolys, vilket härmar gradienter som vilda bakterier möter i naturen.
Uncaging teknik sysselsätter ljuskänsliga sonder som funktionellt kapsla in biomolekyler i en inaktiv form. Bestrålning frigör burmolekylen, vilket möjliggör riktad störning av en biologisk process8. På grund av den snabba och exakta kontrollen av cellulär kemi som uncaging ger9, fotolys av bur föreningar har traditionellt använts av biologer, fysiologer och neuroforskare att studera aktivering av gener10, jon kanaler11, och nervceller12. På senare tid har forskare utnyttjat de betydande fördelarna med fotolys för att studera chemotaxis13, för att bestämma flagella växlingdynamiken hos enskilda bakterieceller utsätts för en stegvis kemoattractant stimulans14,15,och att undersöka motilitet mönster av enstaka spermieceller i tredimensionella (3D) lutningar16.
I vårt tillvägagångssätt genomför vi fotolys av bur aminosyror inom mikrofluidiska enheter för att studera beteendesvaret hos en bakteriepopulation till kontrollerade kemiska pulser, som blir nästan omedelbart tillgängliga genom photorelease. Användningen av ett mål med låg förstoring (4x) (NA = 0,13, fokusdjup som är cirka 40 μm) gör det möjligt att både observationen av befolkningsnivå aggregeringssvaret hos tusentals bakterier över ett stort synfält (3,2 mm x 3,2 mm) och mätning av rörelse på encellnivå. Vi presenterar två tillämpningar av denna metod: 1) frisättningen av en enda kemisk puls för att studera bakteriell ackumulering−avledning dynamik från enhetliga förhållanden, och 2i)frisättning av flera pulser för att karakterisera bakterieackumuleringdynamiken under tidsvarierande, rumsligt heterogena kemoattractant villkor. Denna metod har testats på de marina bakterierna Vibrio ordalii utför chemotaxis mot aminosyran glutamat17,men metoden är i stort sett tillämplig på olika kombinationer av arter och kemoattractants, liksom på biologiska processer bortom chemotaxis (t.ex. näringsupptag, antibiotikaexponering, kvorumavkänning). Detta tillvägagångssätt lovar att hjälpa belysa mikroorganismers ekologi och beteende i realistiska miljöer och att avslöja de dolda kompromisser som enskilda bakterier står inför när de navigerar efemära dynamiska gradienter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>&#62;98% purity, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>to eliminate spent media from the bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubators Incu-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>390-0384</td>
			<td>to bake 3D master</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duster</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>16650-22</td>
			<td>to clean the wafer and microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>444-0601</td>
			<td>to bond the microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSafe micro centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688312</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>for image analysis and bacterial tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>631-1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon Eclipse TiE</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td>with motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNI-Glutamate</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1490</td>
			<td>&#62;98 % purity, photosensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing equipment</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Objet30 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing service</td>
			<td>3D Printing Studios</td>
			<td>Custom</td>
			<td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>to calibrate the uncaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscope Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven Venti-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>466-3516</td>
			<td>to bake PDMS (with forced convection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8-3050</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU8-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma chamber Zepto</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO-1</td>
			<td>to functionalize the surfaces before bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCT0447100</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size, 19 % open area, 24 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene microtubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>I.D. x O.D.: 0.015&#34; x 0.043&#34; / 0.38mm x 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>611-2605</td>
			<td>to weight PDMS mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Andor Zyla</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Product No. SS1-160p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2015</td>
			<td>Dassault Systemes SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td>Used to design the mold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencolor</td>
			<td></td>
			<td>for LED 395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>110-41-155</td>
			<td>PDMS Si Elastomer Kit; curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Luer-Lok)</td>
			<td>B Braun Omnifix</td>
			<td>4616308F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Needle</td>
			<td>Agani</td>
			<td>A228</td>
			<td>from 10 to 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump 11 Pico Plus Elite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroGrey</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Dual Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Mold Material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior

Vi visar en metod för generering av kontrollerade, dynamiska kemiska pulser – där lokaliserade kemoattractant plötsligt blir tillgänglig på mikroskala – för att skapa mikromiljöer för mikrobiella chemotaxisexperiment. För att skapa kemiska pulser utvecklade vi ett system för att införa aminosyrakällor nästan omedelbart genom fotolys av buraminosyror i en polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidisk kammare som innehåller en bakteriell suspension. Vi tillämpade denna metod på chemotactic bakterien, Vibrio ordalii, som aktivt kan klättra dessa dynamiska kemiska gradienter samtidigt spåras av videomikroskopi. Aminosyror, som återges biologiskt inert ("bur") genom kemisk modifiering med en fotoflyttbar skyddsgrupp, är jämnt närvarande i suspensionen men inte tillgängliga för konsumtion fram till deras plötsliga utsläpp, som sker vid användardefinierade punkter i tid och rum med hjälp av en nästan UV-A fokuserad LED-balk. Antalet molekyler som frigörs i pulsen kan bestämmas av ett kalibreringsförhållande mellan exponeringstid och uncaging fraktion, där absorptionsspektrumet efter fotolys kännetecknas av användning av UV-Vis spektroskopi. Ett nanoporöst polykarbonatmembran (PCTE) kan integreras i den mikrofluidiska enheten för att möjliggöra kontinuerlig borttagning genom flöde av uncaged föreningar och de förbrukade medierna. Ett starkt, irreversibel bindning mellan PCTE-membranet och PDMS mikrofluidisk struktur uppnås genom beläggning av membranet med en lösning på 3-aminopropyltrietoxysilane (APTES) följt av plasmaaktivering av ytorna som ska bindas. Ett datorstyrt system kan generera användardefinierade pulssekvenser på olika platser och med olika intensiteter, för att skapa resurslandskap med föreskrivna rumsliga och tidsmässiga variationer. I varje kemiskt landskap kan dynamiken i bakterierörelsen i individskala och deras ackumulering på populationsnivå erhållas, vilket möjliggör kvantifiering av kemotaktiskprestanda och dess effekter på bakterieaggregeringar i ekologiskt relevanta miljöer.

Vi använde mikrofluidiska och millifluidiska enheter (figur 1) för att studera bakteriella ackumuleringsprofiler under dynamiska näringsförhållanden. Bakteriella banor extraherades från inspelade videor som förvärvats genom faskontrastmikroskopi av ackumuleringsavledningdynamiken hos en bakteriepopulation efter en kemisk puls som släpptes av fotolys (figur 2 och figur 3). Genom att i genomsnitt miljontals banor, spatiotempo...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Ett protokoll för generering av dynamiska kemiska landskap genom fotolys inom mikrofluidiska och millifluidiska uppställningar presenteras. Denna metod är lämplig att studera olika biologiska processer, inklusive motile beteende, näringsupptag, eller anpassning till kemikalier av mikroorganismer, både på encellig och befolkningsnivå.

Generera kontrollerade, dynamiska kemiska landskap för att studera mikrobiell beteende

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Denna metod gör det möjligt att belysa mikroskala ekologi och beteende mikroorganismer navigera dynamiska kemiska gradienter och att avslöja sina dolda kompromisser, näringsämnen kinetik, och populationsdynamik i ekologiskt relevanta mikromiljöer. Genom att kombinera mikrofluidisk teknik med fotolys genererar vi kontrollerade kemiska pulser, där lokaliserad kemoattractant plötsligt blir tillgänglig i mikroskala, för att mäta det chemotaktiska svaret hos mikrobiella populationer som först exponeras för ostadiga kemiska gradienter. Designa kanalen med hjälp av CAD-programvara, och skriv ut den på en genomskinlighet film för att skapa fotomasken.Fabricera mästaren genom mjuk litografi i ett rent rum, enligt manuskriptet. Förbered en PDMS-blandning genom att kombinera elastomeren med dess härdningsmedel vid ett 10-till-ett-förhållande i en 40-milliliter-bägare. Med en plastkniv, blanda kraftigt tills vätskan är homogen.Omedelbart avgasar PDMS blandningen i en vakuumkammare i 45 minuter vid rumstemperatur. För att påskynda processen, regelbundet släppa vakuum för att spränga bubblor som bildas vid gränssnittet. Ta bort damm från befälhavarens yta med ett trycksatt rengöringsmedel.Häll sedan den avgasade PDMS-blandningen på mästaren och grädda den i en ugn vid 80 grader Celsius i två timmar. Skär PDMS med ett blad runt mikrostrukturerna på ett avstånd av cirka fem millimeter, och skala sedan försiktigt PDMS från befälhavaren. Punch hål att fungera som inlopp och utlopp av mikrokanal.Täta mikrokanal med tejp för att förhindra ansamling av damm. Utforma 3D-formen med hjälp av 3D-designprogramvara, och skriv ut befälhavaren för PDMS-formen med en högupplöst 3D-skrivare. Efter att ha förberett och avgasat PDMS-blandningen som tidigare gjorts, rengör du masterns yta genom att dabbing med självhäftande tejp.Sätt befälhavaren på en skala. Häll sedan 23,4 gram ohärdad PDMS-blandning för att erhålla önskad höjd av PDMS genom att matcha befälhavarens höjd vid 0,5 millimeter. Ta bort eventuella kvarvarande bubblor med hjälp av tryckluft.Placera PDMS rösterna på befälhavaren i en ugn på 45 grader Celsius för att baka i minst 12 timmar. Sedan, försiktigt skala av den härdade PDMS lager, och stansa inlopp och utlopp hål för injektion av bakteriell suspension. Aktivera både ytan på en petriskål och PDMS-formen med syrgasplasma i två minuter.Bond PDMS mögel på Petriskålen genom att försiktigt trycka formen till Petri-skålen. Undvik att trycka på där funktionerna finns. Placera Petri-skålen bunden till PDMS 3D-mögel i en ugn på 45 grader Celsius i minst 12 timmar för att stärka den kemiska bindningen.Därefter aktiverar nanoporösa polykarbonatmembranet i en syre plasmakammare för en minut vid rumstemperatur. Under en kemisk huva, späd en kommersiell lösning av 3-aminopropyltriethoxysilane i avjoniserat vatten till 1%by volym genom att använda ett polypropylenrör. Överför den utspädda 3-aminopropyltriethoxysilanelösningen i en Petri-rätt, och sänk ner det aktiverade membranet i 3-aminopropyltriethoxysilanelösningen i 20 minuter.Sedan, ta bort membranet från 3-aminopropyltriethoxysilane lösning med pincett, och placera den på ett rent rum torka för att torka. För tillverkning av PDMS mikrofluidiska kanaler som kommer att ligga på membranet och tillåta tvättning av bakterien arenan, upprepa tillverkning av mikrofluidiska enheten för den enda kemiska puls experiment som gjort tidigare. För att binda PDMS-tvättkanalerna till det funktionaliserade membranet aktiverar du först både PDMS-tvättkanalen och polykarbonatmembranet med en syreplasmakammare i två minuter.Omedelbart efter plasmabehandlingen ska det funktionaliserade membranet och PDMS-tvättkanalen komma i kontakt genom att försiktigt trycka pdms-tvättkanalen på membranet. Det är viktigt att försiktigt trycka ihop PDMS och membranet, eller membranet kan vara oåterkalleligt bundna till taket på 200-mikrometer höjd PDMS mikrokanal. Aktivera sedan både det bundna laminatet PDMS tvättkanal polykarbonat membran och 3D PDMS mögel tidigare bundna till Petri-skålen genom att placera dem i en syre plasmakammare i två minuter.Sandwich membranet mellan två PDMS lager, och tryck ihop. Placera Petri-skålen bunden till smörgåsstrukturen i en ugn vid 45 grader Celsius i minst 12 timmar för att stärka den kemiska bindningen. För att börja, behålla den millifluidiska kammaren under vakuum i 20 minuter.Placera sedan petriskålen som innehåller den millifluidiska kammaren på ett mikroskopsteg. Med en pipett, fyll kammaren under membranet med den utspädda bakteriell suspensionen av GFP-fluorescerande Vibrio ordalii i en-millimolar 4-metoxi-7-nitroindolinyl-bur-L-glutamatlösning i konstgjord havsvatten. Efter att ha fyllt kanalen med bakterieupphängningen, sug lösningen i överskott med en pappershandduk, och täta in- och utlopp med PDMS-pluggar genom att försiktigt trycka in dem i hålen.Fyll en spruta med en konstgjord havsvattenlösning på en millimolar 4-metoxi-7-nitroindolinyl-burad-L-glutamat, och fäst slangar till inloppet och utloppet av tvättkanalen ovanför membranet. Anslut slangen till en avfallsreservoar och se till att slangen är helt nedsänkt i behållaren för vätskeavfall för att undvika trycksvängningar. Ställ in flödeshastigheten på sprutpumpen på 50 mikroliter per minut.Starta sprutpumpen för att upprätta flödet i tvättkanalen ovanför membranet. Starta programvaran som styr LED-strålen och mikroskopstadiet, och generera användardefinierade sekvenser av pulser på olika platser och med olika intensiteter. Spela in video med hjälp av en 4x mål med jämna tidsintervall under en period av flera timmar och över flera sammanhängande platser för att täcka en stor yta.I denna studie användes de mikrofluidiska och millifluidiska anordningarna för att studera bakteriellt chemotaktiskt svar och ackumuleringsprofiler under dynamiska näringsförhållanden. Maximala intensitetsprognoser visar bakteriepositionen, indikerad med vita spår, över ett 0,5 sekunders intervall omedelbart efter pulsfrigivningen och 40 sekunder efter pulsutlösningen. Bakteriebanorna visades också i svart 60 sekunder efter pulsutsättningen.Den skuggade regionen representerar den kemiska puls som frigörs av fotolys vid tid noll andra i mitten av synfältet, som därefter diffus. Bakteriekoncentrationen, liksom den tidsmässiga dynamiken i den radiella drifthastigheten efter en pulsavgivning i synfältets mitt visas här. Negativa värden av avdriftshastigheten motsvarar riktad chemotaktisk rörelse mot pulsens mitt.Här presenteras simstatistik för en bakteriepopulation i avsaknad av kemiska gradienter. Banor representerar de tvådimensionella projektionerna av den tredimensionella bakterierörelserna i mikrokanal. Sannolikhetsfördelning av uppmätt bakteriell simhastighet passades av en gammafördelning.Från bakteriebanorna extraherades sannolikhetsfördelningen av tiden mellan på varandra följande omorienteringar. Omorienteringsmönstret, fördelningen av simhastigheten och organismernas omorienteringsstatistik användes för att informera en individuell baserad modell. Denna metod har testats på de marina bakterierna Vibrio ordalii som utför kemotaxis mot aminosyran glutamat, men den föreslagna metodiken är i stort sett tillämplig på olika kombinationer av arter och kemoattrater, samt för biologiska processer bortom kemotaxis, såsom populations- och samhällsdynamik i rumsligt heterogena och dynamiska förhållanden.Klassisk teknik inom mikrobiell ekologi och mikrobiologi, såsom utsvedningar i satskulturer eller chemostats, har i stort sett ignorerat de spatio-tidsmässiga egenskaperna hos mikrobiella livsmiljöer. Den nästan ögonblickliga skapandet av kemiska pulser vid mikroskalorna genom fotolys syftar till att reproducera den typ av näringspulser som marina bakterier möter i naturen från en rad källor, till exempel den diffusiva spridningen av plymer bakom sjunkande organiska partiklar eller det näringsämne som sprider sig från lystna fytoplanktonceller. Aminosilanlösningen är akut giftig och bör hanteras med yttersta försiktighet.Vi arbetar uteslutande under rökhuven och bär skyddsutrustning som labbrock, skyddsglasögon och handskar. Vi tar också hand om det avfall vi genererade.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Micropatterned Ytor Study Hyaluronsyra Interaktioner med cancerceller

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Syntes av ett intein medierad Artificiell Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Kontrollerad Mikrofluidumanordning Miljö för Dynamic Undersökning av röda blodkroppar Sammanläggning

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

A Novel Bioreaktor för High Density Odling av olika mikrobiella samhällen

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Alternerande magnetfält-Responsive Hybrid Gelatin Mikrogeler för kontrollerad läkemedelsdosering

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Expanderande Nanopatterned Substrat Använda Stitch Teknik för Nanotopographical Modulering av cellbeteende

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Modellering äggstockscancer flercelliga Sfäroid Beteende i en dynamisk 3D Peritoneal mikroanordning

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

Dynamiska mekaniska miljöanalys att förutsäga beteendet mjukgörande med neurala implantat

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Stegvis cell sådd på tessellerade byggnadsställningar för att studera spirande blodkärl

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...