Name: generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior
Uploaded: 2020-01-31T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

Yazarlar ETH Zürih'te Ilk mikrofabrikasyon tesisi teşekkür ederim. Bu çalışma Avustralya Araştırma Konseyi Discovery Early Career Researcher Award DE180100911 (D.R.B.), Gordon ve Betty Moore Marine Microbial Initiative Investigator Award GBMF3783 (R.S.) ve İsviçre Ulusal Bilim Vakfı bursu ile desteklenmiştir. 1-002745-000 (R.S.'ye).

1. Tek Kimyasal-darbe Deneyi için Mikroakışkan Cihazın İmalatı
<ol><li>Bilgisayarı destekli tasarım (CAD) yazılımını kullanarak kanalı tasarlayın ve fotoğraf maskesi oluşturmak için şeffaflık filmine yazdırın(Şekil 1A).</li>
	<li>Ustayı yumuşak litografi ile (temiz oda koşullarında) üretin.<ol>
<li>Temiz bir silikon gofret (4 inç) aseton ile hızlı bir şekilde art arda, metanol ve izopropanol, sonra azot kullanarak kuru. 5 dk için 130 °C fı...

<ol>
	<li>Armitage, J. P., Lackie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The biology of the chemotactic response. , (1991).</li><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+structuring+of+marine+ecosystems.">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).</li><li>Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., Gonz&#225;lez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+recyclers:+features+and+functions+of+bacteria+associated+with+phytoplankton+blooms.">Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms.</a> Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).</li><li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry.">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li><li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis.">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).</li><li>Waite, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-genetic+diversity+modulates+population+performance.">Non-genetic diversity modulates population performance.</a> Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).</li><li>Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Microbes+See+a+sea+of+gradients.">Marine Microbes See a sea of gradients.</a> Science. 338 (6107), 628-633 (2012).</li><li>Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+compounds:+photorelease+technology+for+control+of+cellular+chemistry+and+physiology.">Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology.</a> Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).</li><li>Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds:+New+tools+for+cellular+physiology.">Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology.</a> Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).</li><li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA/DNA+in+zebrafish+embryos.">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).</li><li>England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific,+photochemical+proteolysis+applied+to+ion+channels+in+vivo.">Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).</li><li>Fino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RuBi-Glutamate:+Two-photon+and+visible-light+photoactivation+of+neurons+and+dendritic+spines.">RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines.</a> Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).</li><li>Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+signal+integration+in+bacteria.">Chemotactic signal integration in bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).</li><li>Sagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+E.+coli+Response+to+an+Instantaneously+Applied+Chemotactic+Signal.">Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal.</a> Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).</li><li>Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+Bacterial+Chemoresponse+to+a+Stepwise+Chemoattractant+Stimulus.">Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus.</a> Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).</li><li>Jikeli, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+navigation+along+helical+paths+in+3D+chemoattractant+landscapes.">Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes.</a> Nature Communications. 6, 7985 (2015).</li><li>Brumley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteria+push+the+limits+of+chemotactic+precision+to+navigate+dynamic+chemical+gradients.">Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).</li><li>Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Irreversible,+direct+bonding+of+nanoporous+polymer+membranes+to+PDMS+or+glass+microdevices.">Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices.</a> Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).</li><li>ZoBell, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cultural+requirements+of+heterotrophic+aerobes.">The cultural requirements of heterotrophic aerobes.</a> Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).</li><li>Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+and+pharmacological+evaluation+of+7-nitroindolinyl-and+4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino+acids+as+novel,+fast+caged+neurotransmitters.">Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters.</a> Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).</li><li>Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405nm:+Photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).</li><li>Ribeiro, A. C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutual+diffusion+coefficients+of+L-glutamic+acid+and+monosodium+L-glutamate+in+aqueous+solutions+at+T=298.15K.">Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K.</a> The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).</li><li>Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophysical+properties+of+seawater:+a+review+of+existing+correlations+and+data.">Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data.</a> Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).</li><li>. Nikon depth of field calculator Available from: <a target="_blank" href="https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield">https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield</a> (2019)</li><li>Ki&#248;rboe, T., Thygesen, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+motion+and+solute+distribution+around+sinking+aggregates:+II.+Implications+for+remote+detection+by+colonizing+zooplankters.">Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters.</a> Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).</li><li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nutrient+patches+in+planktonic+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria.">Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).</li><li>Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+chemotactic+response+enables+marine+bacteria+to+exploit+ephemeral+microscale+nutrient+patches.">Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).</li><li>Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+chemotaxis+in+an+optical+trap.">Bacterial chemotaxis in an optical trap.</a> PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency-Dependent+Escherichia+coli+Chemotaxis+behavior.">Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior.</a> Physical Review Letters. 108 (12), (2012).</li><li>Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotactic+behavior+of+catalytic+motors+in+microfluidic+channels.">Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels.</a> Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).</li></ol>

Bu yöntem, araştırmacıların mikro ve miliakışkan cihazlarda kontrollü, dinamik degradeler altında bakteriyel kemotaksileri incelemelerine olanak sağlayarak tekrarlanabilir veri toplamayı mümkün kılmasını sağlar. Fotolisis tarafından mikro ölçekte kimyasal darbelerin yakın anında oluşturulması, örneğin, batan deniz parçacıkları25arkasında tüylerin diffüzive yayılması, ya da lysed fitoplankton hücrelerinden yayılan besin sinyalleri bir dizi doğada karşılaşma b...

Mikroplar chemotaxis güveniyor, kimyasal degradeler tespit ve yanıt motilite değiştirme süreci1, kimyasal manzara gezinmek için, besin kaynakları ve konakları yaklaşım, ve zararlı maddeler kaçmak. Bu mikroölçekli süreçler mikroplar ve çevreleri arasındaki etkileşimlerin makroölçekli kinetik belirlemek2,3. Mikroakışkanlar ve mikrofabrikasyon teknolojilerinde son zamanlarda ki gelişmeler, yumuşak litografi4de dahil olmak üzere, mikropların etkileşimlerini incelemek için kontrollü mikroortamlar yaratma yeteneğimizi kökten leştirmektedir. Örneğin, geçmiş deneyler yüksek besin konsantrasyonları için yüksek kontrollü, kararlı degradeler üreterek bakteriyel kemotaksis inceledik5,6. Ancak, doğal ortamlarda, mikro ölçekli kimyasal degradeler moleküler difüzyon tarafından kısa ömürlü―dağılmış―ve arka plan koşulları genellikle yüksek seyreltik7. Mikrobiyal popülasyonların kemotaktik tepkisini doğrudan ölçmek için, mikroakışkan teknolojiyi fotolizle birleştirmek için yöntemler tasarladık ve burada tanımladık, böylelikle vahşi bakterilerin doğada karşılaştıkları degradeleri taklit ettik.
Uncaging teknolojisi, biyomolekülleri aktif olmayan bir biçimde işlevsel olarak kapsülleyen ışığa duyarlı problar kullanır. Işınlama kafesli molekülü serbest bırakır, biyolojik bir sürecin hedeflenen tedirginliği sağlar8. Hücresel kimyanın hızlı ve hassas kontrolü sayesinde 9,kafesli bileşiklerin fotolsisi geleneksel olarak biyologlar, fizyologlar ve nörologlar tarafından genlerin aktivasyonunu incelemek için kullanılmıştır10, iyon kanalları11, ve nöronlar12. Daha yakın zamanda, bilim adamları kemotaksis13çalışma fotoliz önemli avantajları kaldıraçlı var , bir adım adım kemoattractant uyarıcı maruz bireysel bakteri hücrelerinin flagella anahtarlama dinamiklerini belirlemek için14,15, ve üç boyutlu tek sperm hücrelerinin hareketlilik desenleri araştırmak için (3D) gradyanlar16.
Yaklaşımımızda, kafesli amino asitlerin fotolizisini mikroakışkan cihazlar içinde uygulayıp, bir bakteri popülasyonunun kontrollü kimyasal darbelere karşı davranışsal tepkisini incelemek için, fotosalınım yoluyla neredeyse anında kullanılabilir hale gelir. Düşük büyütme (4x) hedefinin (NA = 0,13, odak derinliği yaklaşık 40 μm) kullanımı, hem binlerce bakterinin geniş bir görüş alanı (3,2 mm x 3,2 mm) üzerinde popülasyon düzeyindeki toplama tepkisini gözlemlemenizi hem de tek hücre düzeyinde hareket ölçümü sağlar. Bu yöntemin iki uygulamasını salıyoruz: 1) tek tip koşullardan başlayarak bakteri birikimi−dağılım dinamiklerini incelemek için tek bir kimyasal darbenin serbest bırakılması ve 2i) zaman değişen, mekansal heterojen kemoattractant koşullar altında bakteri birikimi dinamiklerini karakterize etmek için birden fazla darbenin serbest bırakılması. Bu yöntem deniz bakterileri Vibrio ordalii amino asit glutamat doğru kemotaksis yapan test edilmiştir17, ama yöntem geniş tür ve kemoattractants farklı kombinasyonları için geçerlidir, yanı sıra kemotaksis ötesinde biyolojik süreçler için (örneğin, besin alımı, antibiyotik maruzkalma, çoğunluk algılama). Bu yaklaşım, mikroorganizmaların gerçekçi ortamlardaki ekoloji ve davranışlarını niçin açıklığa kavuşturmayı ve geçici dinamik degradelerde gezinirken tek tek bakterilerin karşılaştıkları gizli dengeleri ortaya çıkarmayı vaat eder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3648</td>
			<td>&#62;98% purity, highly toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>210261</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>to eliminate spent media from the bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Incubators Incu-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>390-0384</td>
			<td>to bake 3D master</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duster</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>16650-22</td>
			<td>to clean the wafer and microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>444-0601</td>
			<td>to bond the microchannels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightSafe micro centrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z688312</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>for image analysis and bacterial tracking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope glass slide</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>631-1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Nikon Eclipse TiE</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>MEA53100</td>
			<td>with motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNI-Glutamate</td>
			<td>Tocris Bioscience</td>
			<td>1490</td>
			<td>&#62;98 % purity, photosensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing equipment</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Objet30 3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mold printing service</td>
			<td>3D Printing Studios</td>
			<td>Custom</td>
			<td><a href="https://www.3dprintingstudios.com/" target="_blank">https://www.3dprintingstudios.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>to calibrate the uncaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS Elements</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microscope Imaging Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven Venti-Line</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>466-3516</td>
			<td>to bake PDMS (with forced convection)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist SU-8-3050</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU8-3050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma chamber Zepto</td>
			<td>Diener Electronic</td>
			<td>ZEPTO-1</td>
			<td>to functionalize the surfaces before bonding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate membrane</td>
			<td>Sterlitech</td>
			<td>PCT0447100</td>
			<td>0.4 &#181;m pore size, 19 % open area, 24 &#181;m thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene microtubing</td>
			<td>Scientific Commodities</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td>I.D. x O.D.: 0.015&#34; x 0.043&#34; / 0.38mm x 1.09mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene Petri dish</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>25373-100</td>
			<td>bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>VWR-CH</td>
			<td>611-2605</td>
			<td>to weight PDMS mixture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera Andor Zyla</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sea salt</td>
			<td>Instant Ocean</td>
			<td>Product No. SS1-160p</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks 2015</td>
			<td>Dassault Systemes SolidWorks</td>
			<td></td>
			<td>Used to design the mold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra X light engine</td>
			<td>Lumencolor</td>
			<td></td>
			<td>for LED 395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>110-41-155</td>
			<td>PDMS Si Elastomer Kit; curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (Luer-Lok)</td>
			<td>B Braun Omnifix</td>
			<td>4616308F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Needle</td>
			<td>Agani</td>
			<td>A228</td>
			<td>from 10 to 30 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump 11 Pico Plus Elite</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4506</td>
			<td>Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VeroGrey</td>
			<td>Stratasys</td>
			<td></td>
			<td>Dual Syringe Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td>Mold Material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generating controlled, dynamic chemical landscapes to study microbial behavior

Kontrollü, dinamik kimyasal darbelerin üretimi için bir yöntem gösteriyoruz―lokalize kemoattractant mikro ölçekte aniden kullanılabilir hale gelir―mikrobiyal kemotaksis deneyleri için mikro ortamlar oluşturmak için. Kimyasal darbeler oluşturmak için, bakteriyel süspansiyon içeren bir polidimethylsiloxane (PDMS) mikroakışkan odası içinde kafesli amino asitlerin fotolizi ile anında amino asit kaynaklarını yakın-anında tanıtmak için bir sistem geliştirdi. Bu yöntemi, video mikroskopi ile takip edilirken bu dinamik kimyasal degradelere aktif olarak tırmanabilen kemotaktik bakteri Vibrio ordalii'yeuyguladık. Fotoçıkarılabilir koruma grubu ile kimyasal modifikasyon ile biyolojik olarak inert ('kafesli') haline getirilen amino asitler, neredeyse UV-A odaklı LED ışını ile zaman ve mekanda kullanıcı tarafından tanımlanan noktalarda meydana gelen ani salınımına kadar süspansiyonda düzgün bir şekilde mevcut değildir, ancak tüketilemez. Darbede salınan molekül sayısı, fotoliz sonrası emilim spektrumunun UV-Vis spektroskopisi ile karakterize olduğu maruz kalma süresi ile uncaging fraksiyonu arasındaki kalibrasyon ilişkisi ile belirlenebilir. Bir nanogözenekli polikarbonat (PCTE) membran kafeslenmemiş bileşikler ve harcanan ortam akışı ile sürekli kaldırma sağlamak için mikroakışkan cihaza entegre edilebilir. PCTE membranı ile PDMS mikroakışkan yapısı arasında güçlü, geri dönüşü olmayan bir bağ, membranın 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) çözeltisi ile kaplanması ve ardından bağlanacak yüzeylerin plazma aktivasyonu ile elde edilir. Bilgisayar kontrollü bir sistem, farklı konumlarda ve farklı yoğunluklarda kullanıcı tanımlı bakliyat dizileri oluşturabilir, böylece öngörülen uzamsal ve zamansal değişkenlik ile kaynak manzaraları oluşturabilir. Her kimyasal ortamda, bireysel ölçekte bakteri hareketinin dinamiği ve popülasyon düzeyinde birikmesi elde edilebilir, böylece kemotaktik performans ve ekolojik olarak ilgili ortamlarda bakteriyel toplamalar üzerindeki etkilerinin ölçülmesi izin.

Dinamik besin koşulları altında bakteri birikimi profillerini incelemek için mikroakışkan ve miliakışkan cihazları(Şekil 1)kullandık. Bakteriyel yörüngeler fotoliz tarafından salınan kimyasal darbesonrasında bakteri popülasyonunun birikim-dağılma dinamiklerinin faz kontrast mikroskobu ile elde edilen kaydedilen videolardan elde edilmiştir(Şekil 2 ve Şekil 3). Ortalama milyonlarca yörünge ile radyal sürüklen...

Watch this Scientific Journal Video about Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior at JoVE.com

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

Mikroakışkan ve miliakışkan kurulumlar içinde fotolik tarafından dinamik kimyasal manzara üretimi için bir protokol sunulmaktadır. Bu metodoloji, hem tek hücre hem de popülasyon düzeyinde, hareketli davranış, besin alımı veya mikroorganizmaların kimyasallarına adaptasyon dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçleri incelemek için uygundur.

Mikrobiyal Davranışı İncelemek Için Kontrollü, Dinamik Kimyasal Manzaralar Üretmek

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Bu yöntem, mikroölçekli ekoloji ve dinamik kimyasal degradeler navigasyon mikroorganizmaların davranışını açıklamak ve ekolojik olarak ilgili mikroortamlarda gizli trade-off, besin kinetik ve nüfus dinamikleri ortaya çıkarmak için izin verir. Mikroakışkan teknolojiyi fotolizle birleştirerek, kontrol edilen kimyasal darbeler üretiyoruz, lokalize kemoattractant mikro ölçekte aniden kullanılabilir hale geliyor, mikrobiyal popülasyonların kemotaktik tepkisini ölçmek için ilk olarak kararsız kimyasal degradelere maruz kalarak. CAD yazılımını kullanarak kanalı tasarlayın ve fotoğraf maskesi oluşturmak için saydamlık filmine yazdırın.El yazmasına göre, temiz bir odada yumuşak litografi ile usta imalat. 40 mililitrelik bir kabın 10'a 1 oranında kürleme maddesi ile elastomerbirleştirerek bir PDMS karışımı hazırlayın. Plastik bir bıçakla, sıvı homojen olana kadar şiddetle karıştırın.PDMS karışımını oda sıcaklığında 45 dakika boyunca vakum odasında hemen gazdan arındırın. İşlemi hızlandırmak için, arabirimde meydana gelen kabarcıkları patlatmak için vakumu periyodik olarak bırakın. Basınçlı bir temizleyici ile ana yüzeyinin tozunu çıkarın.Sonra ana üzerine gazdan pdms karışımı dökün ve iki saat boyunca 80 derece santigrat bir fırında pişirin. PDMS'yi mikroyapıların etrafında ki bir bıçakla yaklaşık beş milimetre mesafeden kesin ve pdms'yi anadan dikkatlice soyun. Mikrokanalın giriş ve çıkışı olarak hizmet vermek için delik açar.Toz birikimini önlemek için mikro kanalı yapışkan bantla kapatın. 3B tasarım yazılımı kullanarak 3B şekli tasarla ve yüksek çözünürlüklü 3D yazıcıyla PDMS kalıbı için ana yı yazdırın. PDMS karışımını daha önce olduğu gibi hazırlayıp gazdan çıkardıktan sonra, yapıştırıcı bantla dabbing yaparak ustanın yüzeyini temizleyin.Ustayı bir ölçeğe koy. Daha sonra, ana merkezi bölge kaçınarak, 0,5 milimetre ana yüksekliği eşleştirerek PDMS istenilen yükseklik elde etmek için 23.4 gram unred PDMS karışımı dökün. Basınçlı hava yardımı ile kalan kabarcıkları çıkarın.PDMS döküm en az 12 saat pişirin 45 santigrat derece bir fırında master yerleştirin. Daha sonra, yavaşça sertleştirilmiş PDMS tabakası soyma ve bakteriyel süspansiyon enjeksiyonu için giriş ve çıkış delikleri yumruk. Bir Petri kabının yüzeyini ve PDMS kalıbını oksijen plazması ile iki dakika aktif hale getirin.PdMS kalıbını Petri kabına hafifçe bastırarak Petri kabına bağlayın. Özelliklerin bulunduğu yere basmaktan kaçının. PdMS 3D kalıbına bağlanmış Petri kabını, kimyasal bağı güçlendirmek için en az 12 saat boyunca 45 derecede bir fırında yerleştirin.Daha sonra, oda sıcaklığında bir dakika lığına oksijen plazma odasında nanogözenekli polikarbonat membranı etkinleştirin. Kimyasal bir başlık altında, bir polipropilen tüp kullanarak hacim olarak% 1 deiyonize su 3-aminopropyltriethoxysilane ticari bir çözelti seyreltmek. Seyreltilmiş 3-aminopropiltrietoksisilane çözeltisini petri kabına aktarın ve aktif membranı 3-aminopropiltriethoxysilane çözeltisinde 20 dakika batırın.Sonra, cımbız ile 3-aminopropyltriethoxysilane çözeltisi membran çıkarın ve kuruması için temiz bir oda silme yerleştirin. Membran üzerinde yer alacak ve bakteriyel arenanın yıkanması için pdms mikroakışkan kanalların imalatı için, daha önce yapıldığı gibi tek kimyasal darbe deneyi için mikroakışkan cihazın imalatını tekrarlayın. PDMS yıkama kanallarını fonksiyonel membrana bağlamak için, önce hem PDMS yıkama kanalını hem de polikarbonat membranı oksijen plazma haznesiyle iki dakika aktif hale getirin.Plazma tedavisinden hemen sonra, PDMS yıkama kanalına membranüzerine hafifçe basarak işlevsel membranı ve PDMS yıkama kanalını temasa getirin. PDMS ve membranı hafifçe birbirine bastırmak önemlidir veya membran 200 mikrometre yüksekliğindeki PDMS mikrokanalının tavanına geri dönülmez şekilde bağlanmış olabilir. Daha sonra, hem bağlı laminat PDMS yıkama kanalı polikarbonat membran ı etkinleştirin hem de daha önce Petri kabına bağlanmış 3D PDMS kalıbını iki dakika lığına oksijen plazma odasına yerleştirerek etkinleştirin.Membranı iki PDMS katmanı arasında sandviç ve birlikte bastırın. Petri kabını sandviç yapısına bağlı olarak 45 derecede, kimyasal bağı güçlendirmek için en az 12 saat fırında yerleştirin. Başlamak için, 20 dakika boyunca vakum altında miliakışkan oda korumak.Daha sonra, miliakışkan hazneiçeren Petri kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Bir pipet ile, yapay deniz suyunda bir milimolar 4-methoxy-7-nitroindolinyl-kafesli-L-glutamat çözeltisi GFP-floresan Vibrio ordalii seyreltik bakteriyel süspansiyon ile membran altında oda doldurun. Bakteri süspansiyon ile kanal doldurduktan sonra, bir kağıt havlu ile aşırı çözüm emmek ve yavaşça deliklere basarak PDMS fişleri ile giriş ve çıkış mühür.Bir şırıngayı bir milimolar 4-methoxy-7-nitroindolinyl-kafesli-L-glutamat yapay bir deniz suyu çözeltisi ile doldurun ve membran üzerinde yıkama kanalının giriş ve çıkış boru takın. Boruyu bir atık haznesine bağlayın ve basınç salınımlarını önlemek için borunun sıvı atık haznesine tamamen batırDığından emin olun. Şırınga pompasındaki akış hızını dakikada 50 mikrolitreye ayarlayın.Membran üzerinde yıkama kanalında akış kurmak için şırınga pompası başlatın. LED ışını ve mikroskop aşamasını kontrol eden yazılımı başlatın ve farklı konumlarda ve farklı yoğunluklarda kullanıcı tanımlı darbe dizileri oluşturun. Büyük bir yüzeyi kapsayacak şekilde birkaç saatlik bir süre boyunca ve birden fazla bitişik konum üzerinde düzenli zaman aralıklarında 4x hedefi kullanarak video kaydedin.Bu çalışmada, mikroakışkan ve miliakışkan cihazlar dinamik besin koşulları altında bakteriyel kemotaktik yanıt ve birikim profilleri çalışma için kullanılmıştır. Maksimum yoğunluklu projeksiyonlar, darbe nin salınımını hemen izleyen 0,5 saniyelik bir aralıkta ve nabız salınımını 40 saniye sonra, beyaz izlerle gösterilen bakteriyel pozisyonu gösterir. Bakteriyel yörüngeler de darbe nin serbest bırakılmasından 60 saniye sonra siyah olarak gösterilmiştir.Gölgeli bölge, görüntü alanının ortasında fotoiztarafından salınan kimyasal darbeyi temsil eder. Görüş alanının merkezinde nabız salınımını takiben radyal sürüklenme hızının zamansal dinamiği nin yanı sıra bakteri konsantrasyonu da burada gösterilmiştir. Sürüklenme hızının negatif değerleri, darbenin merkezine doğru yönlendirilmiş kemotaktik harekete karşılık gelir.Yüzme istatistikleri burada kimyasal degradelerin yokluğunda bir bakteri popülasyonu için sunulmaktadır. Yörüngeler mikrokanaldaki üç boyutlu bakteri hareketinin iki boyutlu projeksiyonlarını temsil eder. Ölçülen bakteriyel yüzme hızının olasılık dağılımı gama dağılımına uygundu.Bakteriyel yörüngelerden, ardışık yönlendirmeler arasındaki zamanın olasılık dağılımı ayıklanmıştır. Yeniden yönlendirme deseni, yüzme hızının dağılımı ve organizmaların yeniden yönlendirme istatistikleri bireysel tabanlı bir modeli bilgilendirmek için kullanıldı. Bu yöntem deniz bakterileri Vibrio ordalii amino asit glutamat doğru kemotaksis yapan üzerinde test edilmiştir, ancak önerilen metodoloji geniş türler ve kemoattractants farklı kombinasyonu için geçerlidir, yanı sıra kemotaksis ötesinde biyolojik süreçler için, mekansal heterojen ve dinamik koşullarda nüfus ve toplum dinamikleri gibi.Mikrobiyal ekoloji ve mikrobiyolojideki klasik teknikler, örneğin toplu kültürlerdeki büyümeler veya chemostatlar gibi, mikrobiyal habitatların spatio-zamansal özelliklerini büyük ölçüde göz ardı etmektedir. Fotolisis tarafından mikro ölçekte kimyasal darbelerin neredeyse anında oluşturulması, deniz bakterilerinin vahşi doğada karşılaştıkları besin bakliyatlarının türünü çeşitli kaynaklardan yeniden üretmeyi amaçlamaktadır, örneğin, batan organik parçacıkların arkasında tüylerin yayMası veya lysed fitoplankton hücrelerinden yayılan besin. Aminosilane çözeltisi akut toksik ve aşırı dikkatli ele alınmalıdır.Biz sadece duman kaputaltında çalışmak ve laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlüğü ve eldiven gibi koruyucu ekipman giymek. Ürettiğimiz atıkların da icabına bakarız.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Micropatterned Yüzeyler Kanser Hücreleri ile Hyaluronik Asit Etkileşimleri Eğitim

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

Bir Intein aracılı yapay protein Hidrojel sentezi

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Kırmızı Kan Hücresi Toplama Dinamik Soruşturma Kontrollü mikroakışkan Çevre

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

A Novel Bioreactor for High Density Cultivation of Diverse Microbial Communities

Çeşitli mikrobiyal Toplulukları Yüksek Yoğunluklu Yetiştirme için Yeni Bir Biyoreaktör

A novel reactor design, coined a high density bioreactor (HDBR), is presented for the cultivation and study of high density microbial communities. Past ...

Alternating Magnetic Field-Responsive Hybrid Gelatin Microgels for Controlled Drug Release

Kontrollü İlaç Release için Manyetik Alan-Duyarlı Hibrid Jelatin mikroj Alternatif

Magnetically-responsive nano/micro-engineered biomaterials that enable a tightly controlled, on-demand drug delivery have been developed as new types of ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Hücre Davranış Nanotopographical Modülasyon için nano Substratları kullanma Dikiş Tekniği Genişleyen

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Modeling Ovarian Cancer Multicellular Spheroid Behavior in a Dynamic 3D Peritoneal Microdevice

Dinamik 3D Periton microdevice Modelleme Yumurtalık Kanseri Multisellüler Sfero Davranış

Ovarian cancer is characterized by extensive peritoneal metastasis, with tumor spheres commonly found in the malignant ascites. This is associated with ...

Environmental Dynamic Mechanical Analysis to Predict the Softening Behavior of Neural Implants

Sinirsel implantları yumuşatma davranışını tahmin etmek için çevre dinamik mekanik analiz

When using dynamically softening substrates for neural implants, it is important to have a reliable in vitro method to characterize the softening behavior ...

Stepwise Cell Seeding on Tessellated Scaffolds to Study Sprouting Blood Vessels

Filizlenen Kan Damarlarını İncelemek için Mozaikli İskelelerde Stepwise Hücre Tohumlama

The cardiovascular system is a key player in human physiology, providing nourishment to most tissues in the body; vessels are present in different sizes, ...