Name: at-risk butterfly captive propagation programs to enhance life history knowledge and effective ex situ conservation techniques
Uploaded: 2020-02-11T13:00:00
Duration: 7 min 10 s
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Este trabalho foi apoiado por subsídios da Iniciativa de Recuperação de Conservação do Serviço de Pesca e Vida Selvagem dos EUA (F17AP00467) e do Disney Conservation Fund. O apoio adicional foi fornecido pelo Museu de História Natural da Flórida e pelo Departamento de Entomologia e Nematologia da Universidade da Flórida.

1. Garantir namoro adulto bem sucedido e acasalamento
<ol><li>Após a eclosão bem sucedida, libere borboletas adultas viáveis em uma gaiola de voo segura, acompanhada e exibida localizada em uma estufa controlada pela temperatura(Figura Suplementar 2). NOTA: Adultos podem ser marcados na superfície ventral das asas com marcadores de tinta permanentes se a identificação de indivíduos específicos for desejada para separação de linhas genéticas, origem do estoque ou para coleta específica de dados relacionadas à longevidade do organismo, comportamento, Etc.<ol>
<li>Embora as dimensões exatas da gaiola possam variar, certifique-se de que há amplo espaço para acomodar material adequado da planta de néctar necessário para suportar a densidade de borboletas adultas abrigadas e fornecer espaço para um humano ficar livremente em pé e girar ao redor.</li>
		<li>Além da regulação da temperatura, certifique-se de que a estufa esteja segura para que possa fornecer uma segunda camada de contenção, juntamente com proteção contra o tempo inclemente (por exemplo, chuva forte, vento).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Elevar o material da planta de néctar de vasos para que não haja mais de 30 cm de espaço desde o topo interno da gaiola até as flores mais altas florescendo(Figura Suplementar 2). Isso proporciona acesso ideal aos recursos de néctar disponíveis, oferece amplos poleiros adultos e minimiza a atividade de voo estranho.</li>
	<li>Coloque uma planta hospedeira em vasos na gaiola de voo. Isso garante que, mesmo que um par acasalado seja perdido, podem ser coletados ovos resultantes.</li>
	<li>Fornecer fluxo de ar consistente. Isso aumenta a atividade de namoro e o sucesso do acasalamento. Em um ambiente de estufa, sopradores e ventiladores de circulação de montagem fixa são melhor usados para ajudar a melhorar a ventilação e o movimento do ar. Uma ventilação portátil menor, como ventiladores de caixa ou mesa, também pode ser usada.</li>
	<li>Mantenha a temperatura interna do efeito estufa entre 27 °C e 32 °C para promover a atividade adulta ideal e o sucesso do acasalamento. A temperatura dentro da gaiola é monitorada usando um termômetro de monitoramento de memória rastreável.</li>
	<li>Misture a gaiola de voo exibida regularmente (aproximadamente uma vez a cada 2 h) com água usando uma bomba de mão, pulverizador de tanque de plástico ou mangueira de jardim.</li>
	<li>Colete suavemente pares individuais de acasalamento da gaiola de voo com tela usando um frasco de tampa de plástico transparente de 50 dram(Tabela de Materiais),colocando de um a dois pares por frasco, e transporte para uma sala de criação ou laboratório interno (Figura Complementar 3).</li>
</ol>2. Maximizando a produção de ovos
<ol><li>Montar câmara de oviposição.<ol>
<li>Pegue um copo de papel branco simples de 12 onças e use uma faca utilitário de lâmina de estalo, faça dois cortes horizontais em cada lado do copo em frente um ao outro. Cada corte deve ser aproximadamente 1 cm abaixo da borda.</li>
		<li>Corte um único cotonete de algodão ao meio e insira a extremidade da haste de cada um nos dois cortes horizontais em cada lado do copo de papel para que a porção de cotonete de algodão se estenda aproximadamente 2 cm em direção ao interior do copo.</li>
		<li>Usando uma faca de utilidade de lâmina de estalo, faça dois cortes "X" na parte inferior do copo de papel. Cada corte diagonal deve ter aproximadamente 1 cm de comprimento.</li>
		<li>Pegue um copo plástico de 9 onças e encha o fundo com aproximadamente 2 cm de água da torneira.</li>
		<li>Coloque um corte fresco, de aproximadamente 15 cm de comprimento, do crescimento da planta de hospedeiro sértero terminal no copo de papel, inserindo o caule através de um dos cortes "X" na parte inferior. Empurre a haste através do corte para que aproximadamente 4-5 cm se prostrutam para fora da parte inferior.</li>
		<li>Coloque o copo de papel com material hospedeiro no copo plástico, garantindo que o caule da planta esteja na água.</li>
		<li>Encha uma seringa sub-Q de 1 ml (0,45 mm x 16 mm) com uma bebida esportiva aromatizada e saqueie ambos os cotonetes de algodão no copo de papel. Estes agem como flores artificiais. NOTA: Melão e bebida esportiva sabor de ponche de frutas fornecem a melhor alternativa de néctar.</li>
		<li>Uma vez que cada par de acasalamento se separe, coloque 2-3 fêmeas gravid na configuração do copo montado (ou seja, a câmara de oviposição).</li>
		<li>Cubra o copo com um fragmento quadrado cortado de tule preto (aproximadamente 15 cm x 15 cm) e fixe-o com um elástico ao redor da tampa (Figura Suplementar 4). O tule preto fornece a melhor visibilidade no copo e a fácil identificação de quaisquer ovos que possam ocasionalmente ser colocados no tule.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estimular a atividade e a oviposição das borboletas adultas.<ol>
<li>Coloque cada câmara de oviposição em um banco de laboratório ou mesa aproximadamente 19 cm abaixo de uma luz de grampo de 21,59 cm com um refletor de alumínio que abriga uma lâmpada incandescente de 40 W (Figura Suplementar 5). NOTA: A luz incandescente fornece o calor radiante necessário para estimular a atividade e a oviposição adulta.</li>
		<li>Coloque um termômetro de monitoramento de memória rastreável adjacente às luzes e execute o sensor de temperatura para que ele repode em cima de uma câmara de oviposição localizada diretamente uma luz de grampo. NOTA: A faixa de temperatura-alvo é entre 27,5 °C-29 °C.</li>
		<li>Adicione luzes de fixação suplementar conforme necessário, dependendo do número total de câmaras oposicionais implantadas.</li>
		<li>Tampe as luzes de fixação em um temporizador mecânico de plug-in indoor programável de 15 Amp 24 h com duas tomadas (programável em intervalos cronometrados de 30 minutos).</li>
		<li>Coloque o temporizador para acender a luz do grampo por intervalos de 30 minutos (ou seja, um ciclo repetitivo de 30 min ligado, 30 min desligado). NOTA: Este ciclo de luz ajuda a maximizar a produção de ovos, proporcionando períodos repetitivos de iluminação para estimular a atividade e oviposição das borboletas adultas, seguido de curtos períodos de descanso escuro.</li>
		<li>Refrescar os cotonetes de algodão em cada xícara com bebida esportiva aromatizada através da seringa sub-Q e névoa regularmente com água usando uma garrafa de spray plástico aproximadamente a cada 2-3 h ou conforme necessário. NOTA: Isso fornece néctar artificial adequado e umidade para permitir que as borboletas se alimentem livremente conforme desejado. Assim, aumenta tanto a longevidade adulta quanto a produtividade da oposição em condições laboratoriais onde o material vegetal vivo e florescente não pode ser facilmente utilizado.</li>
		<li>Monitore os copos regularmente e substitua a planta hospedeira por cortes frescos conforme necessário.</li>
		<li>Quando os ovos começam a eclodir ou a densidade de ovos se torna alta, mova as fêmeas para uma nova xícara com hospedeiro fresco e comece o protocolo larvas com recém-nascidos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Cuidados e manutenção larval
<ol><li>Repita as etapas 2.3-2.6 para montar copos para larvas.</li>
	<li>Quando os ovos começam a eclodir, mova o material da planta hospedeira com ovos e larvas de neonato em um copo recém-montado, colocando o caule através do segundo "X" na parte inferior garantindo que o caule da planta esteja na água e deixe tocar o corte de hospedeiro fresco adjacente.</li>
	<li>Quando as larvas são jovens (onroto-2 instar), verifique copos larvais diariamente para frescor do material vegetal hospedeiro e presença de ou frass excessiva. NOTA: A remoção diária do material hospedeiro não é recomendada quando as larvas são jovens porque isso pode resultar em lesão no organismo devido ao manuseio e/ou desperdício desnecessário de material hospedeiro fresco.</li>
	<li>Se o material hospedeiro estiver murcho ou em condições precárias, coloque outro corte de material hospedeiro fresco em copo para que ele esteja tocando folhagens existentes e permita que larvas se movam para o novo hospedeiro por conta própria.</li>
	<li>Uma vez que as larvas cheguem ao3º instar, substitua o copo de papel e adicione material hospedeiro fresco diariamente.</li>
	<li>Use um pequeno pincel de tinta aquarela de camelo para mover suavemente as larvas do material antigo hospedeiro ou superfície do copo para material hospedeiro fresco no novo copo.</li>
	<li>Coloque o antigo material hospedeiro em um recipiente vazio de armazenamento de alimentos plásticos retangulares.</li>
	<li>Repita as etapas 3.5-3.7 diariamente e até que todos os copos com larvas tenham sido processados.</li>
	<li>Quando estiver completo, adicione uma pequena quantidade de material hospedeiro fresco em cima do lixo da planta no recipiente de armazenamento de alimentos e coloque livremente uma tampa por cima. NOTA: Isso serve como uma salvaguarda no caso de quaisquer larvas forem negligenciadas durante o processamento diário, pois elas rastejarão para o novo material hospedeiro em cima dos resíduos da planta e podem ser removidas no dia seguinte.</li>
	<li>Mantenha copos temperatura laboratorial entre 25 °C-28 °C para atividade e desenvolvimento larval ideal (Figura Complementar 6). NOTA: Para atingir as temperaturas de criação ótimas em condições internas, muitas vezes é necessário colocar copos luzes de fixação com refletores de alumínio que abrigam lâmpadas incandescentes de 40 W. As temperaturas podem então ser monitoradas ativamente usando um termômetro de monitoramento de memória rastreável e a altura da luz ajustada para atingir as melhores condições de criação.</li>
</ol>4. Construção da câmara de pupação
<ol><li>Corte um rolo de papel ondulado de rosto único em quadrados de 3,8 cm x 3,8 cm.</li>
	<li>Coloque um quadrado em um copo de porção de plástico transparente de 2 onças.</li>
	<li>Coloque o copo em uma bandeja de copo de plástico transparente (Figura Complementar 7).</li>
</ol>5. Preparando larvas para a pupação
<ol><li>Identifique larvas maduras prontas para pupato durante o processamento diário da colônia. NOTA: Tais larvas vão virar um uniforme maçante verde-marrom, perder seus chevrons, e muitas vezes vagar para fora do hospedeiro.</li>
	<li>Remova suavemente cada larva madura com um pequeno pincel de tinta aquarela de camelo ou fórceps e coloque uma em cada câmara de pupação.</li>
	<li>Firmemente estalo a tampa de plástico transparente na câmara de pupação.</li>
	<li>Repita as etapas 5.1-5.3 até que todas as larvas prontas para pupato tenham sido transferidas para câmaras de pupação adicionando novas bandejas de plástico conforme necessário (Figura Suplementar 8).</li>
</ol>6. Manutenção de pupas
<ol><li>Para cada bandeja de câmaras de pupação, registre a data da primeira pupação e quaisquer outras informações pertinentes necessárias (ou seja, linha genética, ensaio experimental, etc.).</li>
	<li>Organize bandejas por data e local em local seguro dentro do laboratório (Figura Suplementar 8).</li>
	<li>Monitore bandejas diariamente para eclosão adulta. NOTA: Condições laboratoriais como a temperatura influenciarão fortemente o tempo de desenvolvimento.</li>
	<li>Antes da eclosão adulta (tipicamente dentro de 10 dias da primeira pupação), remova as tampas das câmaras individuais de pupação e coloque a bandeja em uma gaiola de criação de malha dobrável de 34,29 cm x 34,29 cm x 60,96 cm de malha dobrável(Figura Suplementar 9). NOTA: Pupae presa seguramente dentro das ranhuras dos quadrados de papel ondulado facilitam a eclosão adulta bem sucedida (Figura Complementar 10).</li>
	<li>Repita todo o protocolo da etapa 1.1 para a geração em cativeiro subsequente.</li>
</ol>7. Avaliando o tempo de desenvolvimento das etapas imaturas e o número de estádios
<ol><li>Coloque uma única larva um microscópio dissecando. Use um pequeno pincel de tinta aquarela capilar de camelo para se mover cuidadosamente e isolar larvas para evitar lesões ao organismo.</li>
	<li>Mergulhe um único cabelo do pincel em tinta luminosa não tóxica (Tabela de Materiais)e coloque cuidadosamente uma pequena gota de tinta na parte de trás (dorsum) da larva. Use uma cor de tinta que se destaque da cor de fundo e da cor padrão da larva (Figura Complementar 11). Não deixe de colocar tinta na cabeça da larva.</li>
	<li>Uma vez que a tinta seca (cerca de 30 s ou mais), coloque cada larva individual em seu próprio copo de porção de plástico transparente de 2 onças contendo aproximadamente 1-3 pequenas folhas de material de hospedeiro terminal fresco e escreva um identificador único no copo e na tampa (Figura Complementar 12).</li>
	
	<li>Verifique cuidadosamente cada larva diariamente. Remova as folhas e coloque na superfície branca. Inspecione copos, limpe a tampa e examine as folhas um microscópio dissecando para a presença de exuviadas larvais (peles de molde) e/ou cápsulas de cabeça.</li>
	<li>Se uma exuvia larval for encontrada, remova-a do copo e coloque-a em um tubo de microcentrífuga rotulado com o número correspondente do copo e a data (veja os passos 8.1-8.6. abaixo).</li>
	<li>Repinte larvas após cada molt e registre datas de molt.</li>
	<li>Meça o comprimento total do corpo (cabeça a último segmento abdominal) de cada larva diariamente usando pinças digitais. Tome três medidas e registre a média das três, juntamente com a data e a hora. Para larvas instar precoces, deve-se utilizar uma lupa ou escopo dissecando ao medir para garantir medidas precisas.</li>
	<li>Retornasse a larva ao seu copo de porção de plástico correspondente.</li>
	<li>Adicione material de hospedeiro fresco conforme necessário e remova todos os frass e detritos antigos do hospedeiro. Se o molde for encontrado no copo, descarte e use um copo novo. Escreva o número de identificador único correto no novo copo.</li>
	<li>Repita as etapas 7.5-7.9 até que todas as larvas cheguem ao seu último instar e comecem a fase preparatória. Quando as larvas deixam de se alimentar, vire um uniforme de cor verde-marrom maçante, perca seus chevrons, e muitas vezes vagueiam pelo hospedeiro, minimizem perturbá-los.</li>
	<li>Coloque um pequeno pedaço de papel ondulado no copo (veja passo 4.1).</li>
	<li>Uma vez que cada larva tenha totalmente pupado, meça seu comprimento total como na etapa 7,8 acima e registre a data da pupação. Este será o molt final de cada indivíduo.</li>
	<li>Verifique diariamente a data de eclosão de pupas e registre data de eclosão e sexo de cada borboleta adulta resultante.</li>
	<li>Meça o comprimento do acorde de cada borboleta usando pinças digitais. Borboletas podem ser suavemente mantidas com fórceps para medição. Se a borboleta estiver muito ativa para medir facilmente, coloque-a temporariamente em uma geladeira por 30 s ou menos e tente novamente.</li>
</ol>8. Coleta de larvas exuviae
<ol><li>Quando uma exuvia larval é observada, encha um tubo de microcentrífuga com 0,2 μl de glicerina. Rotular a parte superior da tampa e o lado com o número da larva, data de molt e cápsula da cabeça (H.C.). NOTA: As larvas de algumas larvas lepidopteranas consomem regularmente seu exávia, mas a cápsula da cabeça deve permanecer.</li>
	<li>Coloque a exuvia larval e a cápsula da cabeça associada em uma tampa de copo de porção de plástico transparente e coloque algumas gotas de etanol nele.</li>
	<li>Examine a exuvia larval um microscópio dissecando colocando-o em uma tampa de copo de porção de plástico transparente e colocando algumas gotas de etanol sobre ele. Se a cápsula da cabeça larval já estiver separada da exuvia, coloque uma gota de glicerina na ponta dos fórceps entomológicos pontiagudos e toque suavemente na cápsula da cabeça para a glicerina. Coloque a cápsula da cabeça no tubo de microcentrífuga associado.</li>
	<li>Se a cápsula da cabeça ainda estiver presa à exuvia larval, use fórceps pontiagudos e um pino de inseto para separar a cápsula da cabeça da exuvia larval.</li>
	<li>Uma vez separado, use a técnica de glicerina para pegar a cápsula da cabeça. Se houver muito etanol, você pode usar uma toalha de papel pequena para remover alguns, mas tenha cuidado para não remover acidentalmente a cápsula da cabeça.</li>
	<li>Coloque a cápsula da cabeça em um frasco preenchido com glicerina rotulado e feche a tampa firmemente.</li>
</ol>

<ol>
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Version 2.0.</a> IUCN Species Survival Commission. , (2014).</li><li>Sutherland, W. J., Pullin, A. S., Dolman, P. M., Knight, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+evidence-based+conservation.">The need for evidence-based conservation.</a> Trends in Ecology &amp; Evolution. 19 (6), 305-308 (2004).</li><li>Daniels, J. C., Nordmeyer, C., Runquist, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+standards+for+at-risk+butterfly+translocations.">Improving standards for at-risk butterfly translocations.</a> Diversity. 10, 67 (2018).</li><li>Saarinen, E. 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D., Russell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Captive+rearing+of+Puget+blue+butterflies+(Icaricia+icarioides+blackmorei)+and+implications+for+conservation.">Captive rearing of Puget blue butterflies (Icaricia icarioides blackmorei) and implications for conservation.</a> Journal of Insect Conservation. 13 (3), 309-313 (2009).</li><li>Frankham, R., Loebel, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+problems+in+conservation+genetics+using+captive+Drosophila+populations:+Rapid+genetic+adaptation+to+captivity.">Modeling problems in conservation genetics using captive Drosophila populations: Rapid genetic adaptation to captivity.</a> Zoo Biology. 11 (5), 333-342 (1992).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, ilustramos a eficácia deste protocolo comprovado de reprodução de conservação ex situ para a produção em massa de borboletas em risco, e como ele pode ser adaptado para pesquisas científicas para ajudar a enfrentar as principais lacunas comportamentais, histórico de vida ou dados ecológicos. Maior compreensão do tempo médio de desenvolvimento total (ovo para adulto), duração média em cada fase de vida, e temperatura ideal para acasalamento, por exemplo, foram usados para ajudar a refinar o protocolo e melhorar o sucesso geral do programa. A grande maioria dos protocolos existentes detalha apenas métodos de criação de organismos e não discute coleta de dados, pesquisa científica ou o uso desses resultados para ajudar a informar e potencialmente adaptar métodos ex situ.
Este protocolo requer a criação diária do organismo. A saúde e a produtividade do organismo são maximizadas pelas condições de limpeza da criação, falta de superlotação de organismos e pela disponibilidade de material de planta de hospedeiro larval de alta qualidade. Na maioria das vezes, utilizamos suprimentos e recipientes descartáveis de criação (por exemplo, papel e copos plásticos), e normalmente os substitui regularmente, muitas vezes diariamente, e nunca reutilizamos o material. Isso é econômico e minimiza a necessidade de mais saneamento intensivo de materiais. Ferramentas comumente utilizadas, no entanto, como fórceps entomológicos, pincéis de tinta aquarela e pequenas gaiolas de voo pop-up, bem como todas as superfícies de criação, como mesas e topos de banco de laboratório, são regularmente higienizadas usando uma solução alvejante de 5%. O cronograma exato do saneamento é altamente dependente da frequência de uso, fenologia do organismo e outras variáveis, e deve ser adaptado às necessidades específicas de cada programa ex situ. Além disso, descobrimos que o papel de açougueiro branco é útil para cobrir todas as superfícies de criação. Ele fornece um substrato limpo barato e facilmente implantável, e a cor branca de fundo facilita o avistamento de quaisquer organismos perdidos. Para a criação diária, todo o pessoal do laboratório deve sempre usar luvas descartáveis de exame laboratorial para minimizar a contaminação e proteger o pessoal de qualquer potencial irritação da pele resultante do manuseio de plantas ou organismos. Isso é particularmente crítico se algum pessoal de laboratório tem animais domésticos que requerem tratamentos tópicos com pulgas. Mesmo uma pequena quantidade de resíduo de ingrediente ativo pode ser perigosa para o gado em cativeiro.
Além disso, deve-se tomar cuidado para minimizar a superlotação do organismo. A superlotação das larvas pode rapidamente levar à redução da saúde do organismo e até mesmo ao canibalismo em determinadataxa, particularmente Lycaenidae. Separar regularmente larvas para reduzir o número dentro da criação de recipientes e/ou mesmo isolar larvas individuais como descrito na parte do histórico de vida do protocolo pode ser necessário. Os números ideais por contêiner podem variar consideravelmente com base no imposto específico e várias restrições do programa ex situ, como orçamento disponível, instalações laboratoriais e número total de pessoal da pecuária. Da mesma forma, recomendamos deixar espaço adequado entre copos que abrigam larvas para minimizar o potencial de movimento do organismo entre os recipientes. Por fim, para populações maiores em cativeiro, recomenda-se fortemente separar o estoque entre uma ou mais instalações laboratoriais. Essa estratégia de salvaguarda pode ajudar a minimizar a perda catastrófica de toda a população devido a doenças ou outros impactos imprevistos.
A qualidade e a disponibilidade das plantas hospedeiras larvais impulsionam a produção e influencia fortemente tanto as taxas de desenvolvimento larval quanto a saúde geral da população. No entanto, poucos relatórios ou estudos publicados destacam essa exigência dos bastidores ou discutem as melhores práticas de berçário. O planejamento bem-sucedido do programa Ex Situ deve responder por quantidades adequadas, produção e manutenção da planta. Como muitas larvas também requerem ou preferem certas partes vegetais (por exemplo, novo crescimento terminal, botões de flores e inflorescências, frutas, etc.), uma encenação eficaz para garantir que a fenologia vegetal apropriada seja necessária.
Considerações adicionais incluem manejo demográfico e genético adequado, e a minimização de quaisquer potenciais efeitos negativos do cativeiro. Recomendamos o desenvolvimento de um plano de gestão genética. Isso pode incluir estratégias para incluir a infusão de novos materiais genéticos regularmente, maximizar a diversidade e prevenir a endogamia próxima, avaliar periodicamente as variáveis chave de aptidão do organismo e monitorar a genética em algum nível para permitir a comparação com populações existentes e verificar a saúde do estoque em cativeiro. A comparação periódica das características dos indivíduos cativos com indivíduos das populações fundadoras também é justificada34,35.
Esses protocolos representam as melhores práticas comprovadas. Eles devem ser benéficos para uma variedade de pesquisadores e praticantes de conservação que podem aplicar ou adaptar diretamente nossos métodos a seus próprios estudos e ex situ em risco programas de conservação e recuperação de insetos. O protocolo específico de reprodução cativa delineado é provavelmente mais aplicável a programas focados em outros Lycaenidae, taxa relacionada ou taxa de menor porte. No entanto, inúmeros componentes como aqueles que envolvem garantir namoro e cópula bem-sucedidos, manutenção adulta com néctar artificial, maximização da oviposição e cuidados larvais gerais poderiam, sem dúvida, ser mais amplamente aplicados ou adaptados a uma matriz mais ampla de taxa. Como mencionado anteriormente, embora a flexibilidade do protocolo deva ser enfatizada, o acesso a outras metodologias estabelecidas pode ajudar a fornecer uma visão valiosa e um ponto de partida viável para adaptação e inovação. Os métodos apresentados para avaliar várias características do histórico de vida, como o tempo de desenvolvimento larval e o número de estádios larvais, sem dúvida, tem ampla aplicabilidade a outros programas de conservação e taxa de risco. Encorajamos outros a ajudar a resolver as principais lacunas de dados ecológicos quando possível e a publicar protocolos e resultados do programa vetados.

Uma lista crescente de estudos indica declínios globais generalizados e graves nas populações de borboletas1,2,3,4,5. Isso inclui a grande maioria das espécies em risco. Programas de conservação projetados para mitigar tais declínios muitas vezes empregam uma mistura de estratégias, incluindo monitoramento populacional, gestão e restauração de habitats, pesquisa científica, propagação em cativeiro e translocação de organismos6. Apenas nos EUA e seus territórios, um total de 30 borboletas são listadas a Lei de Espécies Ameaçadas (ESA) como ameaçadas ou ameaçadas, com 21 deles tendo aprovado projetos ou planos finais de recuperação. Para tal taxa, mais da metade das estratégias de recuperação identificadas recomendam propagação em cativeiro ou afirmam que a propagação em cativeiro deve ser avaliada7. O uso de esforços de conservação ex situ para borboletas cresceu consideravelmente nos últimos anos8,9, e tem potencial para ser uma ferramenta crítica para ajudar os esforços de recuperação10. Numerosas instituições, organizações e agências estão atualmente envolvidas com esforços ex situ para pelo menos 11 taxas de borboleta listadas na ESA (ou seja, Cyclargus thomasi bethunebakeri, Euphydryas editha quino, Euphydryas editha taylori, Heraclides aristodemus, Hesperia dacotae, Lycaeides melissa samuelis, Oarisma poweshiek, Pyrgus ruralis lagunae, e Speryeria zerene hippolyta) e vários outros taxas em risco (por exemplo, Callophrys irus, Euphydryas phaeton, Speyeria idalia, e Eumaeus atala)11. Apesar do número de esforços robustos e bem-sucedidos, ainda há falta de comunicação regular entre programas e entre os praticantes de conservação que envolvem a troca de ideias, dados, metodologias efetivas e resultados. Esse compartilhamento de conhecimento é essencial, pois ajuda a minimizar a duplicação do esforço, melhora as melhores práticas gerais e melhora o impacto na conservação. Poucos protocolos publicados de criação, criação, reprodução ou criação estão prontamente disponíveis para taxa de borboleta sem risco, e aqueles que muitas vezes não têm detalhes narrativos suficientes e/ou ilustrações. Estes geralmente fornecem detalhes sumários com instruções limitadas passo a passo e imagens de acompanhamento, tornando a replicação desafiadora ou aplicação para outras taxas difíceis de avaliar12,13,14,15. Muitos dos protocolos disponíveis são limitados de alguma forma: existem apenas na literatura cinza, ou em diferentes níveis de detalhes, idade de publicação ou como componentes em processos de simpósio, relatórios de agência/financiador, ou manuais internos16,17,18,19,20,21,22,23,24.
Para a maioria dos programas de conservação, a propagação em cativeiro é conduzida principalmente para apoiar a translocação de conservação, que engloba reintrodução, reforço (ou seja, aumento) e introdução25,26. Tais atividades devem ser implementadas estrategicamente como componente da estratégia global de recuperação, a fim de ajudar a evitar a extinção de uma espécie listada, subespécie ou populações. Deve-se notar, no entanto, que este é um dos vários outros papéis potenciais que esses programas ex situ podem servir. Estes também podem incluir a manutenção de uma população de seguros (ou seja, refugia), resgate temporário de organismos, apoio à pesquisa e/ou treinamento relacionados à recuperação, e a promoção dos esforços de educação e conscientização relacionados à conservação27,28. Independentemente de os programas ex situ terem um único objetivo definido ou uma mistura de vários, os profissionais de conservação devem maximizar as oportunidades de coleta de dados, a fim de preencher lacunas de informações importantes quando possível. Isso é particularmente importante porque a grande maioria dos impostos em risco geralmente têm sido mal estudados antes de declínios substanciais da população selvagem. O conhecimento aprimorado resultante adquirido em vários aspectos comportamentais, ecológicos ou históricos de vida do taxon focal pode servir para ajudar a promover a conservação e o manejo efetivo de espécies29.
Aqui, descrevemos em detalhes o protocolo de propagação em cativeiro que foi desenvolvido para a borboleta azul miami ameaçada pelo governo federal(Cyclargus thomasi bethunebakeri)comoparte de um programa maior de conservação e recuperação. Neste caso, o programa de propagação em cativeiro atende a três funções específicas identificadas: 1) uma população de seguros caso a população selvagem existente seja perdida, 2) uma população de pesquisa projetada para preencher lacunas de conhecimento ecológicas e de história de vida identificadas que possam ajudar a informar a recuperação e/ou gestão, e 3) para produzir organismos viáveis para a translocação de conservação em locais dentro da faixa histórica do taxon. O protocolo resultante tem sido bem examinado e comprovado, tendo sido utilizado e melhorado por mais de uma década. Consequentemente, sentimos que as técnicas e metodologias descritas representam um modelo viável que pode ser aplicado ou prontamente adaptado para outros programas de borboletas ex situ em risco, particularmente aqueles que envolvem Lycaenidae ou taxa relacionada. Embora não sugiramos que o protocolo descrito seja superior aos outros, sentimos que há oportunidades para aplicar alguns dos métodos de forma mais ampla para ajudar a aumentar a produtividade, o cuidado ou a eficiência. Isso é particularmente verdade, pois grande parte de nossa criação é feita em condições laboratoriais internas com espaço limitado, semelhante aos programas de conservação envolvendo Euphydryas editha taylori e Speryeria zeree hippolyta17,23. Inúmeros outros protocolos geralmente utilizam material em vasos para oviposição ou criação larval, o que às vezes pode levar a maiores complexidades relacionadas ao controle predatório, controle ambiental (ou seja, umidade, temperatura), monitoramento da pecuária, coleta de dados, questões de pragas vegetais e espaço para citar alguns21,22. Por fim, o protocolo apresentado descreve os métodos de reprodução em cativeiro. Muitos outros programas de conservação de borboletas em risco envolvem a criação de cabeça ou em cativeiro com os protocolos representativos refletindo essas diferenças. Embora muitas vezes menores, sentimos que isso ajuda a ampliar o pool existente de informações disponíveis para outros programas revisarem. Isso é fundamental, pois a maioria dos programas ex situ representam esforços pioneiros para ajudar a facilitar a recuperação de taxas raras e muitas vezes mal estudadas. Os protocolos disponíveis podem servir como um excelente ponto de partida para ajudar a fornecer uma visão valiosa, reduzir a duplicação do esforço e promover a inovação. Devido à "extensa diversidade interespecífica de comportamentos de borboletas, traços de história da vida e requisitos ecológicos combinados com diferenças muitas vezes marcadas nas instalações do programa, orçamentos, experiência satistecida" e outras diferenças inerentes, a dependência de uma única metodologia, mesmo para taxas intimamente relacionadas, muitas vezes é limitante e injustificada30. A flexibilidade para refinar ou desenvolver novos protocolos adaptados às necessidades de taxas ou programas específicos é essencial para o sucesso e, portanto, deve ser enfatizada. Descrevemos além técnicas laboratoriais para coletar métricas sobre o desenvolvimento de organismos em condições cativas, incluindo o número de estrelas larvais, duração de estágios individuais de desenvolvimento, tempo total de desenvolvimento e comprimento larval e pupal. Essas técnicas têm ampla aplicabilidade para estudos de história da vida de Lepidoptera que podem ser usados para refinar protocolos ex situ ou informar dados de campo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 oz plain white paper cups (Karat)</td>
			<td>Lollicup</td>
			<td>C-KC16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-Amp 2-Outlet Mechanical Residential Plug-in Countdown Lighting Timer</td>
			<td>Lowes</td>
			<td>UTTNI2423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml sub-Q syringes (0.45 mm x 16 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 oz clear plastic portion cup lids</td>
			<td>Party City</td>
			<td>#791091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 oz Clear Plastic Portion Cups</td>
			<td>Party City</td>
			<td>#791088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34.29 cm x 34.29 cm x 60.96 cm collapsible mesh popup rearing cage</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1466BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8.5&#34; 1-Watt Incandescent Clamped Work Light</td>
			<td>Lowes</td>
			<td>PTC301L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adoric Electronic Digital Caliper</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>B07QX2SK2F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big Kid&#39;s Choice Arts &#38; Crafts Brush Set-12/Pkg, assorted sizes</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>#10965135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Plastic Cup Tray</td>
			<td>Frontier Scientific Services</td>
			<td>AG_9040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific traceable memory monitoring thermometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-077-8D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Straight Points, Swiss Style #4, Stainless</td>
			<td>BioQuip</td>
			<td>4531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humco Glycerin 6 oz</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>#303951037966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminous Paint Kit, Blue, Red, Yellow, 4 Dram</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1166A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Melon flavored Gatorade Fierce Thirst Quencher or fruit punch flavored Gatorade Thirst Quencher sports drink</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>#568456137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neoteck Digital 2 in 1 Hygrometer-Thermometer</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>NTK026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus 0.6 ml Microtubes, Clear, Polypropylene, Nonsterile</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>24-272C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Tank Sprayer</td>
			<td>Lowes</td>
			<td>#5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips Cotton swabs</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>#551398298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectangular plastic tupperware container with lid (Rubbermaid)</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>#554320171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Showgard 903 Stamp Tongs, 4 5/8 inch Spade Tip</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>#787793151378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single face corrugated paper roll</td>
			<td>Amazon.com</td>
			<td>BXSF12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snap blade utility knife</td>
			<td>OLFA</td>
			<td>#5023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solo 9 oz plastic cups</td>
			<td>Solo</td>
			<td>SQ950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thorton Plastics 50 dram clear plastic snap cap vial (6.25 oz.)</td>
			<td>Thorton Plastics</td>
			<td>#50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tulle Spool 9 inch x 150 feet - Black</td>
			<td>Jo Ann Fabrics</td>
			<td>#16029696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zep 32 oz Plastic Spray Bottle</td>
			<td>Lowes</td>
			<td>HDPRO36</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

at-risk butterfly captive propagation programs to enhance life history knowledge and effective ex situ conservation techniques

Melhorar o conhecimento das melhores práticas ex situ para borboletas em risco é importante para gerar resultados bem-sucedidos do programa de conservação e recuperação. Pesquisas sobre essas populações cativas também podem produzir dados valiosos para abordar lacunas de informações importantes sobre o comportamento, histórico de vida e ecologia do imposto alvo. Descrevemos um protocolo de propagação em cativeiro do Cyclargus thomasi bethunebakeri que pode ser usado como modelo para outros programas de ex situ borboleta em risco, especialmente aqueles da família Lycaenidae. Fornecemos ainda um protocolo simples e simples para o registro de várias métricas de histórico de vida que podem ser úteis para informar metodologias ex situ, bem como adaptadas para estudos laboratoriais de outras lepidopteras.

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At-Risk Butterfly Captive Propagation Programs to Enhance Life History Knowledge and Effective Ex Situ Conservation Techniques

Aqui, apresentamos protocolos para 1) a propagação em cativeiro laboratorial da borboleta azul miami ameaçada pelo governo federal(Cyclargus thomasi bethunebakeri) e 2) avaliando informações básicas da história da vida, como tempo de desenvolvimento imaturo e número de estádios larvais. Ambos os métodos podem ser adaptados para uso com outros programas de conservação ex situ.

Programas de propagação em cativeiro de borboletas em risco para melhorar o conhecimento da história da vida e técnicas eficazes de conservação ex situ

Improving knowledge of ex situ best practices for at-risk butterflies is important for generating successful conservation and recovery program outcomes. ...

Este método representa uma porção de um protocolo maior de reprodução de conservação ex situ usado para a produção em massa laboratorial de borboletas em risco. Ilustra como métodos básicos de criação podem ser adaptados para pesquisas científicas para ajudar a abordar as principais lacunas comportamentais, de vida ou de dados ecológicos. Os métodos específicos apresentados para avaliar o tempo de desenvolvimento larval e o número de estádios larvais têm ampla aplicabilidade a outros programas de conservação ou pesquisa de conservação de borboletas.Esta técnica é uma abordagem eficaz para documentar as métricas da história de vida de uma borboleta ameaçada, como número de instars larval, duração dos estágios de desenvolvimento e tamanho de todas as fases da vida. Simplificamos nosso protocolo para que a produtividade e a eficiência possam ser aumentadas no laboratório, o que é especialmente importante na coleta de dados em um curto espaço de tempo. Este método requer destreza e atenção aos detalhes para evitar danos ao organismo, já que as larvas de borboleta são muito pequenas especialmente como os recém-nascidos.Demonstrando o procedimento será Jacob Hornfeldt, um estudante do nosso laboratório. Para começar, use um pequeno pincel de aquarela de cabelo de camelo para mover cuidadosamente e isolar uma única larva e colocá-la sob um microscópio dissecando em uma placa de petri. Mergulhe um único cabelo da caneta de inseto em tinta luminosa nãotóxica de cor contrastante à da larva, e cuidadosamente coloque uma pequena gota de tinta na parte de trás da larva.Depois de 30 segundos, a tinta seca. Com a ajuda de um pequeno pincel de aquarela de cabelo de camelo, coloque cada larva individual em seu próprio copo de porção de plástico transparente de duas onças contendo aproximadamente uma a três pequenas folhas de material hospedeiro terminal fresco, e escreva um identificador único no copo e na tampa. Segure firmemente a tampa.Verifique cuidadosamente cada larva diariamente. Com fórceps, remova as folhas e coloque-as em uma superfície branca. Inspecione o copo e a tampa clara.Examine as folhas sob um microscópio dissecando para a presença de exuviae larval e cápsulas da cabeça. Quando uma exuvia larval for observada, remova-a do copo e coloque-a em um frasco cheio de 0,2 microliters de glicerina. Rotule a parte superior da tampa e o lado com o número da larva, data de molt e cápsula da cabeça.Coloque a exuvia larval e a cápsula da cabeça associada em uma tampa de copo de porção de plástico transparente, e coloque algumas gotas de etanol nela. Observe a exuvia larval sob um microscópio dissecando. Se a cápsula da cabeça larval já estiver separada da exuvia, coloque uma gota de glicerina na ponta de fórceps enticológicos pontiagudos e toque suavemente na cápsula da cabeça para a glicerina.Coloque a cápsula da cabeça no tubo de microcentrifuuagem associado. Se a cápsula da cabeça ainda estiver presa à exuvia larval, use fórceps pontiagudos e um pino de inseto para separar a cápsula da cabeça da exuvia larval. Uma vez separados use a técnica de glicerina para pegar a cápsula da cabeça.Após cada molt, repine as larvas e regise as datas de molt. Todos os dias, use pinças digitais para medir o comprimento total do corpo da cabeça até o último segmento abdominal de cada larva. Faça três medições e regise a média dos três junto com a data e a hora.Verifique o copo de plástico correspondente para ter certeza de que não há nele. Remova todos os detritos frass e antigos do hospedeiro e adicione material hospedeiro fresco conforme necessário. Devolva a larva para o copo.Mantenha os copos sob temperatura laboratorial entre 27 e 32 graus Celsius para atividade e desenvolvimento larval ideal. Mantenha a condição até que todas as larvas atinjam sua instar final e iniciem a fase prepupal. Quando as larvas pararem de se alimentar, vire uma cor marrom-esverdeada uniforme, perca seus chevrons, e muitas vezes vagueie fora do hospedeiro, coloque um pequeno pedaço de papel ondulado no copo.Uma vez que cada larva tenha totalmente filhotes, meça seu comprimento total e regise a data da pupação. Este é o último molt de cada indivíduo. Verifique a pupae diariamente.Quando crescerem em borboletas, use fórceps para segurar a borboleta adulta e golpear suavemente as asas para revelar a cor da superfície da asa superior. Os machos parecem ter azul por todas as asas e as fêmeas reduziram o azul e uma mancha de olhos laranja na asa traseira. Regisso tempo de eclosão e sexo de cada borboleta adulta resultante.Para medir o comprimento do acorde da asa de cada borboleta segure suavemente a borboleta com fórceps e use pinças digitais. Caso a borboleta esteja muito ativa para ser medida coloque-a em uma geladeira por 30 segundos ou menos e tente novamente. Este protocolo permitiu pesquisas direcionadas e ampla coleta de dados sobre inúmeras lacunas de dados importantes para melhorar as melhores práticas de criação e criação de laboratórios.Aqui estão as quatro cápsulas de cabeça coletadas para um indivíduo. A maioria das larvas tinha quatro molts a cada estágio de vida imaturo em menos de cinco dias. As fêmeas tipicamente se desenvolveram mais rapidamente em todos os estágios imaturos em comparação com os machos.Embora este não tenha sido um efeito significativo com um valor p em 0,625. Este passo é muito meticuloso, especialmente quando as larvas são recém-eclodidas recém-eclodidas. É importante lembrar de usar um microscópio durante esta etapa para garantir que a tinta seja aplicada no lugar apropriado na parte de trás da lagarta.Esses métodos podem ser expandidos para ajudar a avaliar as taxas de sobrevivência em estágio de desenvolvimento, o desempenho diferencial em vários hospedeiros larvais, bem como ajudar os pesquisadores a interpretar melhor os dados do campo. Este método simples ilustra como com um pouco de planejamento as práticas básicas de criação de organismos podem ser prontamente adaptadas para pesquisas científicas. Os resultados podem então ser usados para ajudar a informar e, potencialmente, adaptar métodos ex situ para melhorar o sucesso.

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Ca2+ imaging of isolated cells or specific types of cells within intact tissues often reveals complex patterns of Ca2+ signaling. This activity requires ...

Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Complexes in Cultured Human Cells using Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Immunoblotting

Análise dos complexos de cadeia respiratória mitocondrial em células humanas cultivadas usando electroforese em Gel de poliacrilamida nativo azul e Immunoblotting

Mitochondrial respiration is performed by oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes within mitochondria. Internal and environmental factors can perturb ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Crescimento glomerular como um ensaio ex vivo para analisar caminhos envolvidos na ativação de células epiteliais parietal

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Nucleofection and In Vivo Propagation of Chicken Eimeria Parasites

Nucleofection e In Vivo Propagação de Parasitas de Eimeria de Frango

Transfection is a technical process through which genetic material, such as DNA and double-stranded RNA, are delivered into cells to modify the gene of ...