Name: visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging
Uploaded: 2020-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging at JoVE.com

我们感谢潘文杰、J.Livet和Z.托比亚斯在技术和智力方面的贡献。这项工作得到了国家科学基金会（1553764奖）和M.J.默多克慈善信托基金的支持。

涉及动物主题的程序已获得刘易斯和克拉克学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 斑马鱼胚胎的微注射
<ol><li>设置野生类型，成年斑马鱼在性别分离的交配池前，下午进行微注射39，40。39,</li>
	<li>在微注射的早晨准备DNA溶液。稀释hsp：Zebrabow11质粒DNA浓度为±10 ng/μL，浓度为0.1 mM KCl，以及2.5%...

该协议描述了一种方法，可视化在发育中的斑马鱼后脑中，前祖细胞和神经元的克隆，并跟随它们在体内使用B彩虹和延时共聚焦显微镜11。与体外或活体研究相比，该协议的主要优点是能够长期直接观察脊椎动物大脑的自然环境中的增殖区。这项技术建立在以前使用逆转录病毒载体标记单个克隆的研究的基础上。相反，使用hsp：Zebrabow 同时构造了许多克隆的颜色代码，允?...

在发育的早期阶段，专门的祖细胞池在增殖区反复分裂，产生不同的子细胞阵列。然后，在这个发育期出生的细胞将分化和旅行，形成新生的器官。在神经系统中，前视像状胶质在心室区产生不成熟的神经元。当神经元从心室迁移并成熟时，膨胀的组织最终形成大脑高度复杂的结构1,21，2，3，4，5，6。,3,4,5,6前祖的分裂与神经元的分化和迁移之间的协调将决定大脑的最终大小、形状和功能，直接影响行为77、8、9、10。8,9,10虽然严格控制这些过程显然对于正常的大脑发育至关重要，但监管这些动力学的全球机制并不十分了解。在这里，我们描述了一个工具，以细胞分辨率研究神经系统的发展，允许研究人员可视化在发育中的斑马鱼大脑中与B彩虹的祖细胞和神经元，并通过延时共聚焦显微镜11跟踪他们的行为随着时间的推移。该方法也可以适应可视化发育中的胚胎的其他部分。
为了观察和区分正在发育中的斑马鱼大脑中的细胞，我们采用了"彩虹细胞标记技术11"。Brainbow利用随机确定的三种不同荧光蛋白（FPs）的组合表达来标记细胞群。虽然Brainbow表达式的默认表达式是红色FP dTomato，但由酶Cre重组酶的重组导致mCerulean（青色荧光蛋白，CFP）或黄色荧光蛋白（YFP）12，1312,13的表达。单元格中表达的每个 FP 的总量使其具有独特的色调，从而允许从相邻单元格中明确的视觉区别。此外，当一个祖细胞分裂时，每个子细胞将继承其母细胞的颜色，产生颜色编码的克隆，并允许研究人员追踪细胞系11，14。11,虽然最初用于分析小鼠12的神经元回路，但此后，Brainbow已在各种模型生物中表达，包括斑马鱼15。
我们的技术基于以前的多色标签和成像方法，在活斑马鱼中直接成像多个颜色编码的克隆。由于斑马鱼作为胚胎的光学透明度，非常适合成像实验16，而以前的研究已经利用斑马鱼中的B彩虹来研究各种组织，包括神经系统11、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25。11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26，,27.直接成像生物体的能力，以及它们的快速外生发育，使斑马鱼成为脊椎动物发展的宝贵模型。与哺乳动物的大脑相比，斑马鱼后脑的整个增殖区随时可供成像，而不会破坏其内源环境6。这允许在活的有机体中进行实验，而不是在体外或固定组织制剂中进行。与固定成像实验相比，体内研究允许纵向设计，生成数小时的数据，可以分析模式，从而增加观察相对罕见事件的可能性。根据感兴趣的事件的速度和长度，研究人员可以选择进行短（1⁄2 小时）或长（高达 ±16 h）的延时成像实验。通过使用斑马鱼热冲击促进剂70（hsp70，hsp），B彩虹表达可以暂时控制28，29。28,此外，由这个启动器诱导的马赛克表达式非常适合标记和跟踪许多克隆11。
直观地识别活脑中的多个克隆的能力是这种方法的一个优点。以前研究克隆在神经系统发育中的作用的重要研究利用逆转录病毒载体使用单个FP或其他易于可视化的蛋白质标记单个祖细胞及其后代。这种标签允许研究人员观察一个克隆随着时间的推移，无论是体外或体内22，30，31，32，33，34，35，36，37，38。,30,31,32,33,34,35,36,37,38与跟踪一个克隆细胞行为的方法不同，Brainbow的不同颜色允许研究人员观察克隆之间的动态。此外，通过使用Brainbow标记大脑中的许多克隆，根据标记单个克隆11的技术，收集了有关克隆行为的其他数据。重要的是，这里描述的方法可以扩大，以产生发育比较之间的鱼经历了不同的遗传或药理操纵18。总体而言，这些优势使表达蓝彩虹的斑马鱼的体内共聚焦成像的延时技术成为探索脊椎动物神经系统发展的理想研究人员，特别是那些对克隆人作用感兴趣的人。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>134020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06690</td>
			<td>Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 lb nylon fishing line</td>
			<td>SecureLine</td>
			<td>NMT250</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>867-WC NO GLUE</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0298M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>490016-616</td>
			<td>Used to store LMA at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence dissection scope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3158</td>
			<td>To maintain embryos at 28&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection plate molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2320</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0395</td>
			<td>For E3 and for DNA solution for injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E3120</td>
			<td>To create agarose injection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (LMA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks</td>
			<td>Aquaneering, Inc.</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9397</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4058-01</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (90 mm, 60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>To house embryos and create imaging chamber (60 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft stitch ring markers</td>
			<td>Clover Needlecraft, Inc.</td>
			<td>354</td>
			<td>For creating imaging chamber with Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue (Ultra gel control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>BD329412</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging

脊椎动物神经系统的发展需要复杂的细胞行为和相互作用的精确协调。在体内使用高分辨率成像技术可以为活生物体中的这些过程提供一个清晰的窗口。例如，在神经系统形成时，分裂细胞及其后代可以实时跟踪。近年来，多色技术的进步扩大了可以调查的问题类型。多色Brainbow方法不仅可用于区分像细胞一样，还可用于对相关细胞的多个不同克隆进行颜色编码，每个克隆来自一个祖细胞。这允许在开发期间同时对许多不同的克隆及其行为进行多路复用线分析。在这里，我们描述了一种技术，使用延时共聚焦显微镜在发展中的斑马鱼神经系统中实时可视化大量多色彩虹标记细胞。这对于关注细胞之间的细胞相互作用特别有用，因为细胞很难使用传统的启动器驱动颜色进行差异标记。我们的方法可用于同时跟踪多个不同克隆之间的系系关系。使用此技术生成的大型数据集提供了丰富的信息，可以定量地比较基因或药理学操作。最终，所产生的结果有助于回答有关神经系统如何发育的系统问题。

本节演示了使用本文描述的体内多色延时成像方法可以获得的结果示例。我们显示，在发育中的斑马鱼后脑14的增殖心室区，B彩虹颜色编码的细胞克隆（图1）。
通常，当B彩虹标记的细胞排列在特定的径向光纤上时，它们共享相同的颜色（图1D），可以量化为相对RGB通道权重（图1E）。这表?...

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Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

体内成像是一种强大的工具，可用于研究神经系统发育背后的细胞机制。在这里，我们描述了一种技术，使用延时共聚焦显微镜，以可视化大量的多色彩虹标记细胞在发展中的斑马鱼神经系统实时。

使用"彩虹"和"延时共聚焦成像"可视化活斑马鱼中发育中的脑

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

这种方法可以帮助回答关于神经祖细胞及其祖学的动力学的基本问题，这些基因是脊椎动物大脑发育的根据。这种技术的主要优点是能够在许多小时的发育中直接可视化活脑中与克隆相关的细胞的多个集群。该协议还可用于研究斑马鱼胚胎其他发育系统中的克隆和祖体动力学。使用此方法的可视化对于直接观察神经发育过程中发生的基本过程特别有用。在进行微注射前的下午，在性别隔离交配罐中设置野生型成年斑马鱼。第二天早上，根据手稿指示准备DNA溶液，并在受精后45分钟内将大约4.2升的DNA溶液注入一个细胞斑马鱼胚胎。将注射的胚胎保持在E三培养和28摄氏度的培养箱中24小时，然后从组调用死亡和畸形的胚胎。将多达20个健康胚胎移植到50毫升的管子中，用10毫升的E三填充，并在每个管上盖上一顶帽子。将 50 毫升管直立放在 37 摄氏度水浴中的机架上，80 至 90 分钟，确保浴池中的水位高于管中的 E 三。从水浴中取出管架，将其放在 28 摄氏度的培养箱中。允许一个小时让E三冷却，胚胎重新适应温度。然后将它们转移到培养皿与0.2毫摩尔PTU和E三保持温暖在28摄氏度的培养箱。在热冲击后两到四小时，在标准荧光解剖显微镜下检查胚胎，以表达CFP或YFP，这表明脑弓重组成功。在整个过程中选择具有健壮的FP表达的胚胎，然后将它们转移到一个带PTU的单独培养皿中。给他们成像一、二、三天后受精。在荧光显微镜下显得暗淡的表达实际上可以在共声延时成像中很好地可视化。在实验前，准备成像室和胚胎操作工具。要准备成像室，请小心地将塑料环粘在60毫米培养皿的中心。通过将一小段尼龙钓鱼线粘到四英寸木拭子的末尾来构造操纵器。如有必要，在安装前在解剖显微镜下对胚胎进行脱光。要安装胚胎，请将鱼转移到成像室中的塑料环中心，用细尖的移液器去除尽可能多的多余的E三。使用干净的转移移液器用百分之一的低熔加糖和 E 三覆盖鱼，用一层加糖填充整个塑料环。然后轻轻地将胚胎拉入移液器尖端，然后回到气管中，而不引入任何气泡。使用胚胎操纵器快速定向鱼和红糖之前，它硬化。如果使用直立显微镜进行成像，请将胚胎尽可能靠近红糖的上表面，确保胚胎与成像室底部平行，其尾部是直的。等待红糖硬化，然后用E三填充成像室，尽可能多地添加，以解释成像过程中蒸发的原因。将带鱼和 E 三的成像室放在共合显微镜上。然后选择具有高数值孔径和长工作距离的目标的物。查找具有适当密集和明亮标记的细胞区域，并设置采集参数。这是使用 Zen 软件的示例，但设置会因可用的显微镜和激光线而异。准备三个轨道，按顺序对每个 FP 通道进行图像。使用 argon 激光在 458 纳米时激发 CFP，在 514 纳米时使用 YFP 激发，并使用 DPSS 561 纳米激光器激发 dTomato。以适当的波长收集三个任务。选择要图像的 Z 堆栈范围和 10 到 30 分钟之间的时间间隔，以跟踪线粒体和凋亡事件。最后，选择成像会话的长度并运行实验。成像完成后，如果使用 Zen 或其他与斐济兼容的格式，则以 CZI 格式保存原始数据，然后使用生物格式导入将图像导入斐济。体内多色延时成像用于显示脑弓彩色编码的细胞克隆在发育中的斑马鱼后脑的增殖心室区。脑弓标记的细胞排列在特定的径向纤维上，颜色相同。可量化为相对 RGB 通道权重。这表明，这些无线电组是分裂细胞的克隆，其相似的颜色可以用来识别它们与克隆有关。定量颜色分析表明，子细胞的表达颜色与母细胞的颜色相同。但是，相邻的无线电细胞集群可以彼此区分。在体内，相关细胞的多个克隆可以同时进行数小时，从而允许进行多路复用血统分析和比较。在两个克隆体中对颜色表达进行量化，然后在受精后三天再次量化，表明脑弓表达在两到三天之间保持相对恒定。延时成像显示，许多细胞在受精后一天到两天内进行运动间核迁移和细胞分裂，因此可以研究细胞周期。计算的平均细胞周期为8.4小时，与之前的斑马鱼测量结果相当。此外，这种成像技术用于观察单个细胞，这些细胞正经历着与凋亡相关的陈规定型形态变化，如膜出血和细胞分裂。由于此方法在体内执行，因此可以从成像室中救出斑马鱼，并在以后的点进行成像或其他实验。这种技术的使用使我们能够探索有关克隆相关细胞在神经发育过程中作用的新问题。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

测量生活中的斑马鱼胚胎蛋白质稳定性使用荧光衰减光转化后（FDAP）

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

科研

发育生物学

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

捕获组织修复的斑马鱼幼虫与时间推移明视立体显微镜

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

在活斑马鱼胚胎成像的亚细胞结构

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

在GFP-转基因斑马鱼使用Photoconvertible PSmOrange系统追踪单元

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

分析<em&gt;在体内</em&gt;细胞迁移使用细胞移植和时间推移成像在斑马鱼胚胎

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

配备了光学切片与成像定时使用解剖显微镜斑马鱼肾脏发展分析

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

可视化Interrenal类固醇合成组织及其血管微环境斑马鱼

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

住发展拟南芥花的共焦成像

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

诱导生活青蛙和斑马鱼胚胎缺氧

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

多光子时间推移成像实时可视化发展： 迁移神经嵴细胞在斑马鱼胚胎中的可视化

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...