Name: visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging
Uploaded: 2020-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging at JoVE.com

Vi takker Y. A. Pan, J. Livet og Z. Tobias for tekniske og intellektuelle bidrag. Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation (Award 1553764) og MJ Murdock Charitable Trust.

Procedurer, der involverer dyreforsøg er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Lewis & Clark College.
1. Mikroinjektion af zebrafiskembryoner
<ol><li>Opsæt vilde type, voksne zebrafisk i kønsopdeltparring tanke om eftermiddagen før udførelse af mikroinjektioner39,40.</li>
	<li>Klargør DNA-opløsningen om morgenen for mikroinjektionerne. Fortyndes hsp:Zebrabow11</su...

Denne protokol beskriver en metode til at visualisere kloner af stamcelleceller og neuroner i den udviklende zebrafisk baghjerne og følge dem in vivo ved hjælp af Brainbow og time-lapse konfokal mikroskopi11. Den største fordel ved denne protokol i forhold til in vitro- eller ex vivo-undersøgelser er evnen til direkte at observere hvirveldyrhjernens proliferativzone i dens naturlige miljø over tid. Denne teknik bygger på tidligere undersøgelser, der mærkede en enkelt klon ved hjælp af ret...

I de tidlige faser af udviklingen, puljer af specialiserede sogenitor celler deler gentagne gange i proliferativ zoner, der producerer forskellige arrays af datter celler. Cellerne født i denne udviklingsperiode vil derefter differentiere og rejse til at danne de spirende organer. I nervesystemet, progenitors såsom radial glia give anledning til umodne neuroner i ventrikulære zoner. Som neuroner migrere væk fra hjertekamrene og modne, den ekspanderende væv i sidste ende danner meget komplekse strukturer i hjernen1,2,,3,4,5,6. Koordineringen mellem opdeling af sformere og differentiering og migration af neuroner vil bestemme den endelige størrelse, form, og dermed funktion af hjernen, direkte påvirker adfærd7,8,9,10. Mens stram kontrol over disse processer er klart afgørende for normal hjerneudvikling, de globale mekanismer, der regulerer disse dynamikker er ikke godt forstået. Her beskriver vi et værktøj til at studere nervesystemet udvikling på en cellulær opløsning, så forskerne til at visualisere stamcelleceller og neuroner in vivo i udviklingslandene zebrafisk hjernen med Brainbow og spore deres adfærd over tid via time-lapse konfokal mikroskopi11. Tilgangen kan også tilpasses til at visualisere andre dele af det udviklende embryo.
At observere og skelne mellem celler i den udviklende zebrafisk hjerne, har vi tilpasset Brainbow celle-mærkning teknik11. Brainbow udnytter tilfældigt bestemt, kombinatorisk udtryk af tre forskellige fluorescerende proteiner (FPs) til at mærke en population af celler. Mens standardudtrykket for Brainbow-ekspression er den røde FP dTomato, resulterer rekombination af enzymet Cre recombinase i udtryk for mCerulean (cyan fluorescerende protein, CFP) eller gult fluorescerende protein (YFP)12,13. Den samlede mængde af hver FP udtrykt i en celle giver det en unik nuance, så klar visuel skelnen fra tilstødende celler. Derudover, når en stamcelle deler sig, vil hver dattercelle arve farven fra sin modercelle, der producerer farvekodede kloner og giver forskerne mulighed for at spore celleafstamning11,14. Mens oprindeligt bruges til at analysere neuronal kredsløb i mus12, Brainbow er siden blevet udtrykt i en bred vifte af model organismer, herunder zebrafisk15.
Vores teknik bygger på tidligere flerfarvede mærknings- og billedbehandlingsmetoder til direkte at afbilde flere farvekodede kloner over tid i levende zebrafisk. På grund af deres optiske gennemsigtighed som embryoner er zebrafisk velegnede til billeddiagnostiske eksperimenter16, og tidligere undersøgelser har udnyttet Brainbow i zebrafisk til at studere en række væv, herunder nervesystemet11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Evnen til direkte billede i den levende organisme, sammen med deres hurtige ex utero udvikling, gør zebrafisk en værdifuld model for hvirveldyr udvikling. I modsætning til pattedyr hjernen, hele spredningzone zebrafisk baghjernen er let tilgængelige for billeddannelse uden afbrydelse af dens endogene miljø6. Dette gør det muligt at udføre forsøg i den levende organisme i stedet for i in vitro- eller faste vævspræparater. I modsætning til faste billeddiagnostiske eksperimenter giver in vivo-undersøgelser mulighed for et langsgående design, der producerer timevis af data, der kan analyseres for mønstre, hvilket øger sandsynligheden for at observere relativt sjældne hændelser. Afhængigt af hastigheden og længden af de begivenheder af interesse, kan forskerne vælge at udføre korte (1-2 h) eller lang (op til ~ 16 h) time-lapse billeddannelse eksperimenter. Ved at bruge zebrafisk varmechok promotor 70 (hsp70, hsp), Brainbow udtryk kan være tidsmæssigt kontrolleret28,29. Derudover mosaik udtryk induceret af denne promotor er velegnet til mærkning og sporing mange kloner11.
Evnen til visuelt at identificere flere kloner i den levende hjerne er en fordel ved denne metode. Vigtige tidligere undersøgelser, der undersøgte den rolle, kloner inden for udvikling af nervesystemet udnyttet retrovirale vektorer til at mærke en enkelt progenitor celle og dens afkom ved hjælp af en enkelt FP eller andre let visualiseret protein. En sådan mærkning gør det muligt for forskere at observere en enkelt klon over tid, enten in vitro eller in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. I modsætning til metoder til at spore adfærd celler inden for en klon, de forskellige farver Brainbow giver forskerne mulighed for at observere dynamik blandt kloner. Derudover, ved hjælp af Brainbow at mærke mange kloner i hjernen, yderligere data om klonale adfærd indsamles i forhold til teknikker, der etiketten en enkelt klon11. Det er vigtigt, at de metoder, der er beskrevet her, kan udvides til at generere udviklingssammenligninger mellem fisk, der har gennemgået forskellige genetiske eller farmakologiske manipulationer18. Samlet set disse fordele gør time-lapse i vivo konfokale billeddannelse af Brainbow-udtrykke zebrafisk ideel til forskere udforske udviklingen af hvirveldyr nervesystem, især dem interesseret i den rolle, kloner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>134020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06690</td>
			<td>Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 lb nylon fishing line</td>
			<td>SecureLine</td>
			<td>NMT250</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>867-WC NO GLUE</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0298M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>490016-616</td>
			<td>Used to store LMA at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence dissection scope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3158</td>
			<td>To maintain embryos at 28&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection plate molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2320</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0395</td>
			<td>For E3 and for DNA solution for injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E3120</td>
			<td>To create agarose injection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (LMA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks</td>
			<td>Aquaneering, Inc.</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9397</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4058-01</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (90 mm, 60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>To house embryos and create imaging chamber (60 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft stitch ring markers</td>
			<td>Clover Needlecraft, Inc.</td>
			<td>354</td>
			<td>For creating imaging chamber with Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue (Ultra gel control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>BD329412</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging

Udvikling af hvirveldyr nervesystemet kræver en præcis koordinering af komplekse cellulære adfærd og interaktioner. Brugen af in vivobilledteknikker med høj opløsning kan give et klart vindue ind i disse processer i den levende organisme. For eksempel kan dividere celler og deres afkom følges i realtid som nervesystemet former. I de seneste år har tekniske fremskridt inden for flerfarvede teknikker udvidet de typer af spørgsmål, der kan undersøges. Den flerfarvede Brainbow tilgang kan bruges til ikke kun at skelne mellem lignende celler, men også til farvekode flere forskellige kloner af relaterede celler, der hver stammer fra en progenitor celle. Dette giver mulighed for en multiplex afstamning analyse af mange forskellige kloner og deres adfærd samtidig under udviklingen. Her beskriver vi en teknik til at bruge time-lapse konfokal mikroskopi til at visualisere et stort antal flerfarvede Brainbow-mærkede celler over realtid inden for udviklingen zebrafisk nervesystem. Dette er især nyttigt til at følge cellulære interaktioner mellem lignende celler, som er vanskelige at mærke differentieret ved hjælp af traditionelle promotor-drevne farver. Vores tilgang kan bruges til sporing afstamning relationer mellem flere forskellige kloner samtidigt. De store datasæt, der genereres ved hjælp af denne teknik, giver omfattende oplysninger, der kan sammenlignes kvantitativt på tværs af genetiske eller farmakologiske manipulationer. I sidste ende de genererede resultater kan bidrage til at besvare systematiske spørgsmål om, hvordan nervesystemet udvikler sig.

Dette afsnit illustrerer eksempler på resultater, der kan opnås ved hjælp af in vivo multicolor time-lapse imaging tilgang beskrevet her. Vi viser, at Brainbow farvekodede kloner af celler i den proliferative ventrikelzone af den udviklende zebrafisk baghjernen14 (Figur 1).
Typisk, når Brainbow-mærket celler var arrangeret langs en bestemt radial fiber, de delte den samme farve (Figur 1D), som kunne kvanti...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging at JoVE.com

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

In vivo imaging er et kraftfuldt værktøj, der kan bruges til at undersøge de cellulære mekanismer underliggende nervesystem udvikling. Her beskriver vi en teknik til at bruge time-lapse konfokal mikroskopi til at visualisere et stort antal flerfarvede Brainbow-mærkede celler i realtid inden for udviklingen zebrafisk nervesystem.

Visualisere den udviklende hjerne i levende zebrafisk ved hjælp af Brainbow og Time-lapse Konfokal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare grundlæggende spørgsmål om dynamikken i neurale progenitor celler og deres afkom, som ligger til grund for hvirveldyr hjernens udvikling. Den største fordel ved denne teknik er evnen til direkte at visualisere flere klynger af klonisk relaterede celler i den levende hjerne over mange timers udvikling. Protokollen kan også anvendes til at studere kloning og progenitor dynamik i andre udviklende systemer af zebrafisk embryo.Visualisering ved hjælp af denne metode er især nyttig til direkte at observere grundlæggende processer, der opstår under neurale udvikling. Om eftermiddagen før udførelse af mikro injektioner, oprette vilde type voksen zebrafisk i sex adskilt parring tanke. Næste morgen klargør DNA-opløsningen i henhold til manuskriptretninger og indsprøjt ca. 4,2 nanokæk af denne opløsning i en celle zebrafisk embryoner inden for 45 minutter efter befrugtning.Vedligehold de injicerede embryoner i E tre medium og en 28 grader Celsius inkubator i 24 timer, derefter kalde de døde og deforme embryoner fra gruppen. Overfør op til 20 sunde embryoner i et 50 milliliterrør, fyld det med 10 milliliter E tre og læg en hætte oven på hvert rør. Placer en rack med 50 milliliter rør oprejst i en 37 grader Celsius vandbad i 80 til 90 minutter, og sørg for, at vandstanden i badet er højere end E tre i røret.Fjern rørholderen fra vandbadet og læg den i 28 grader Celsius-inkubatoren. Der skal gå op til en time, før E tre afkøles, og embryonerne kan reaklimere til temperaturen. Derefter overføre dem til petriskåle med 0,2 millimolar PTU og E tre holdes varme i 28 grader Celsius inkubator.Efter varmechoket skal embryonerne undersøges under et standardinfluorescensdissektionsmikroskop for udtryk for fFP eller YFP, hvilket indikerer vellykket Brainbow-rekombination. Vælg embryoner med et robust FP-udtryk hele vejen igennem, og overfør dem til en separat skål med PTU. Billede dem en, to eller tre dage efter befrugtning.Udtryk, der vises svagt under et fluorescensmikroskop, kan faktisk være godt visualiseret i konfokal time-lapse-billeddannelse. Før forsøgsdagen skal billeddannelseskammeret og embryomanipulationsværktøjet forberedes. For at forberede billeddannelse kammer, omhyggeligt superlim en plastik ring til midten af en 60 millimeter petriskål.Konstruere manipulator ved super limning en lille længde af nylon fiskesnøre til slutningen af en fire tommer træ podning stick. Om nødvendigt dechorionate embryonerne under en dissektion mikroskop før montering. At montere embryoner, overføre fisken til midten af plast ringen i billeddannelse kammer og fjerne så meget overskydende E tre som muligt med en fin tippet overførsel pipette.Brug en ren overførsel pipette til at dække fisk med en procent lav smelte agarose og E tre, fylde hele plastringen med et lag af agarose. Træk derefter forsigtigt fosteret op i pipettespidsen og tilbage i agarose uden at indføre luftbobler. Brug en embryo manipulator til hurtigt at orientere fisk og agarose før det hærder.Hvis der billeddannelse med et opretstående mikroskop, skal embryonet placeres så tæt på agarosens overside som muligt, og sørg for, at de er parallelle med bunden af billedkammeret med halen lige. Vent på agarose at hærde, derefter fylde billedbehandling kammer med E tre, tilføjer så meget som muligt for at tage højde for fordampning i løbet af billeddannelse. Anlæt billedkammeret med fisken og E tre på det konfokale mikroskop.Vælg derefter målet med en høj numerisk blænde og en lang arbejdsafstand. Find et område med passende tæt og lys mærkning af celler, og konfigurer anskaffelsesparametrene. Dette er et eksempel ved hjælp af Zen software, men indstillingerne vil variere afhængigt af mikroskop og laser linjer til rådighed.Forbered tre spor til at afbilde hver FP-kanal fortløbende. Brug en argon laser til at ophidse CFP på 458 nanometer og YFP på 514 nanometer, og bruge en DPSS 561 nanometer laser til at ophidse dTomato. Indsamle missioner for de tre på de relevante bølgelængder.Vælg Z-stakområdet til billede og et tidsinterval på mellem 10 og 30 minutter for at spore mitotiske og apoptotiske hændelser. Endelig skal du vælge længden af billedbehandlingssessionen og køre eksperimentet. Når billeddannelse er færdig, gemme de rå data i CZI-format, hvis du bruger Zen eller et andet format kompatibel med Fiji, og derefter importere billederne til Fiji ved hjælp af bio formater importør.In vivo flerfarvet time-lapse imaging blev brugt til at vise Brainbow farvekodede kloner af celler i den proliferative ventrikulære zone af den udviklende zebrafisk hindhjern. Brainbow mærkede celler arrangeret langs en bestemt radial fiber delte samme farve. Som kan kvantificeres som den relative RGB kanal vægte.Dette tyder på, at disse radiogrupper var kloner af dividere celler, og at deres lignende farve kan bruges til at identificere dem som værende klonisk relateret. En kvantitativ farveanalyse viste, at datterceller udtrykker samme farve som deres mors celle. Men at tilstødende radioklynger af celler kan skelnes fra hinanden.Talrige kloner af relaterede celler kan følges samtidigt over timer in vivo, giver mulighed for en multiplex afstamning analyse og sammenligning. Kvantificering af farveudtryk i kloner på to og derefter igen på tre dage efter befrugtning viste, at Brainbow udtryk forblev relativt konstant fra to til tre dage. Time-lapse imaging afslørede mange celler under interkinetisk nuklear migration og celledeling fra en til to dage efter befrugtning, hvilket gør det muligt at studere cellecyklussen.Der blev beregnet en gennemsnitlig cellecyklus på 8,4 timer, hvilket kan sammenlignes med tidligere målinger i zebrafisk. Desuden blev denne billeddannelsesteknik brugt til at observere individuelle celler, der gennemgår de stereotype morfologiske ændringer forbundet med apoptose, såsom membransnæring og cellefragmentering. Fordi denne metode udføres in vivo, zebrafisk kan reddes fra billeddannelse kammer og vedligeholdes til billeddannelse eller andre eksperimenter på senere tidspunkt punkter.Brugen af denne teknik giver os mulighed for at udforske nye spørgsmål om rollerne af klonalt relaterede celler under neurale udvikling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Måling Protein Stabilitet i Living zebrafisk embryoner anvendelse af fluorescens Decay Efter fotoomdannelse (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Optagelse Tissue Repair i zebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikroskopi

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging Subcellulære Strukturer i Living Zebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Sporing Celler i GFP-transgene zebrafisk Brug af Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; In vivo</em&gt; Cell Migration hjælp Cell transplantationer og Time-lapse Imaging i zebrafisk embryoner

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse af zebrafisk Kidney Udvikling med Time-lapse Imaging Ved hjælp af en dissektionsmikroskop Udstyret til Optical Sektionsinddeling

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

Visualisere Interrenal steroidogeniske Tissue og dens Vaskulær mikromiljø i Zebrafisk

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Lev Konfokal Imaging af Udvikling Arabidopsis Blomster

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion af hypoxi i levende frø og zebrafiskembryoner

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi Photon tid bortfalder Imaging til at visualisere udvikling i realtid: visualisering af overflytning neurale Crest celler i zebrafisk embryoner

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...