Name: visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging
Uploaded: 2020-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging at JoVE.com

Nous remercions Y. A. Pan, J. Livet et Z. Tobias pour leurs contributions techniques et intellectuelles. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (Award 1553764) et le M.J. Murdock Charitable Trust.

Les procédures relatives aux sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du Lewis and Clark College.
1. Microinjection d’embryons de poissons zèbres
<ol><li>Installez le type sauvage, le poisson zèbre adulte dans les cuves d’accouplement sex-ségréguées l’après-midi avant d’effectuer des microinjections39,40.</li>
	<li>Préparer la solution d’ADN l...

Ce protocole décrit une méthode pour visualiser les clones de cellules progénitrices et de neurones dans le cerveau postérieur du poisson zèbre en développement et les suivre in vivo à l’aide de Brainbow et de microscopie confocale en time-lapse11. Le principal avantage de ce protocole par rapport aux études in vitro ou ex vivo est la capacité d’observer directement la zone de prolifération du cerveau vertébré dans son milieu naturel au fil du temps. Cette technique s’appuie sur ...

Dans les premières phases du développement, les pools de cellules progénitrices spécialisées se divisent à plusieurs reprises dans les zones de prolifération, produisant divers éventails de cellules filles. Les cellules nées au cours de cette période de développement se différencieront alors et se déplaceront pour former les organes naissants. Dans le système nerveux, les ancêtres tels que les gliales radiales donnent lieu à des neurones immatures dans les zones ventriculaires. Comme les neurones migrent loin des ventricules et mûrissent, le tissu en expansion forme finalement les structures très complexes du cerveau1,2,3,4,5,6. La coordination entre la division des progéniteurs et la différenciation et la migration des neurones déterminera la taille, la forme et donc la fonction éventuelle du cerveau, ayant un impact direct sur le comportement7,8,9,10. Bien qu’un contrôle serré sur ces processus soit clairement crucial pour le développement normal du cerveau, les mécanismes mondiaux qui régulent ces dynamiques ne sont pas bien compris. Ici, nous décrivons un outil pour étudier le développement du système nerveux à une résolution cellulaire, permettant aux chercheurs de visualiser les cellules progénitrices et les neurones in vivo dans le cerveau du poisson zèbre en développement avec Brainbow et suivre leur comportement au fil du temps via la microscopie confocale en time-lapse11. L’approche peut également être adaptée pour visualiser d’autres parties de l’embryon en développement.
Pour observer et distinguer entre les cellules du cerveau du poisson zèbre en développement, nous avons adapté la technique d’étiquetage cellulaire Brainbow11. Brainbow utilise l’expression combinatoire déterminée au hasard de trois protéines fluorescentes distinctes (FPs) pour étiqueter une population de cellules. Tandis que l’expression par défaut pour l’expression de Brainbow est le dTomato rouge de FP, la recombinaination par l’enzyme Cre recombinase résulte dans l’expression du mcerulean (protéine fluorescente cyane, CFP) ou protéine fluorescente jaune (YFP)12,13. La quantité combinée de chaque FP exprimée dans une cellule lui donne une teinte unique, permettant une distinction visuelle claire des cellules voisines. En outre, quand une cellule progénitrice se divise, chaque cellule de fille héritera de la couleur de sa cellule mère, produisant des clones à code couleur et permettant aux chercheurs de tracer la lignée cellulaire11,14. Bien qu’à l’origine utilisé pour analyser les circuits neuronaux chez la souris12, Brainbow a depuis été exprimé dans une grande variété d’organismes modèles, y compris le poisson zèbre15.
Notre technique s’appuie sur les méthodes précédentes d’étiquetage et d’imagerie multicolores pour imager directement plusieurs clones à code couleur au fil du temps dans les poissons zèbres vivants. En raison de leur transparence optique en tant qu’embryons, le poisson zèbre sont bien adaptés aux expériences d’imagerie16, et des études précédentes ont utilisé Brainbow dans le poisson zèbre pour étudier une variété de tissus, y compris le système nerveux11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. La capacité d’imager directement dans l’organisme vivant, avec leur développement ex-utérus rapide, font du poisson zèbre un modèle précieux de développement des vertébrés. Contrairement au cerveau des mammifères, toute la zone de prolifération du cerveau postérieur du poisson zèbre est facilement disponible pour l’imagerie sans perturber son environnement endogène6. Cela permet de mener des expériences dans l’organisme vivant, plutôt que dans les préparations de tissus in vitro ou fixes. Contrairement aux expériences d’imagerie fixe, les études in vivo permettent une conception longitudinale, produisant des heures de données qui peuvent être analysées pour les modèles, augmentant ainsi la probabilité d’observer des événements relativement rares. Selon la vitesse et la durée des événements d’intérêt, les chercheurs peuvent choisir d’effectuer des expériences d’imagerie courte (1 à 2 h) ou longues (jusqu’à 16 h). En utilisant le promoteur de choc thermique du poisson zèbre 70 (hsp70, hsp), l’expression Brainbow peut être contrôlé temporellement28,29. En outre, l’expression mosaïque induite par ce promoteur est bien adaptée à l’étiquetage et le suivi de nombreux clones11.
La capacité d’identifier visuellement plusieurs clones dans le cerveau vivant est un avantage de cette méthode. D’importantes études antérieures qui ont étudié le rôle des clones dans le développement du système nerveux ont utilisé des vecteurs rétroviraux pour étiqueter une seule cellule progénitrice et sa progéniture à l’aide d’un seul FP ou d’une autre protéine facilement visualisée. Un tel étiquetage permet aux chercheurs d’observer un seul clone au fil du temps, in vitro ou in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. Contrairement aux méthodes de suivi du comportement des cellules au sein d’un clone, les couleurs distinctes de Brainbow permettent aux chercheurs d’observer la dynamique parmi les clones. En outre, en utilisant Brainbow pour étiqueter de nombreux clones dans le cerveau, des données supplémentaires sur le comportement clonal sont recueillies par rapport aux techniques qui étiquetent un seul clone11. Fait important, les approches décrites ici peuvent être élargies pour générer des comparaisons de développement entre les poissons qui ont subi différentes manipulations génétiques ou pharmacologiques18. Dans l’ensemble, ces avantages rendent l’imagerie confocale en vivo du poisson zèbre Brainbow-exprimant idéal pour les chercheurs explorant le développement du système nerveux vertébré, en particulier ceux qui s’intéressent au rôle des clones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>134020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06690</td>
			<td>Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 lb nylon fishing line</td>
			<td>SecureLine</td>
			<td>NMT250</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>867-WC NO GLUE</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0298M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>490016-616</td>
			<td>Used to store LMA at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence dissection scope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3158</td>
			<td>To maintain embryos at 28&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection plate molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2320</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0395</td>
			<td>For E3 and for DNA solution for injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E3120</td>
			<td>To create agarose injection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (LMA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks</td>
			<td>Aquaneering, Inc.</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9397</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4058-01</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (90 mm, 60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>To house embryos and create imaging chamber (60 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft stitch ring markers</td>
			<td>Clover Needlecraft, Inc.</td>
			<td>354</td>
			<td>For creating imaging chamber with Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue (Ultra gel control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>BD329412</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging

Le développement du système nerveux vertébré nécessite une coordination précise des comportements cellulaires complexes et des interactions. L’utilisation de techniques d’imagerie in vivo à haute résolution peut fournir une fenêtre claire sur ces processus dans l’organisme vivant. Par exemple, la division des cellules et de leur progéniture peut être suivie en temps réel au fur et à mesure que le système nerveux se forme. Ces dernières années, les progrès techniques dans les techniques multicolores ont élargi les types de questions qui peuvent être étudiées. L’approche multicolore Brainbow peut être utilisée non seulement pour distinguer entre les cellules comme, mais aussi pour code couleur plusieurs clones différents de cellules connexes que chacun dérive d’une cellule progénitrice. Cela permet une analyse de lignée multiplexe de nombreux clones différents et leurs comportements simultanément pendant le développement. Ici, nous décrivons une technique pour utiliser la microscopie confocale en time-lapse pour visualiser un grand nombre de cellules multicolores étiquetées Brainbow sur le temps réel dans le système nerveux du poisson zèbre en développement. Ceci est particulièrement utile pour suivre les interactions cellulaires entre les cellules comme, qui sont difficiles à étiqueter différentiellement en utilisant des couleurs traditionnelles axées sur les promoteurs. Notre approche peut être utilisée pour suivre les relations de lignée entre plusieurs clones différents simultanément. Les grands ensembles de données générés à l’aide de cette technique fournissent des informations riches qui peuvent être comparées quantitativement à travers les manipulations génétiques ou pharmacologiques. En fin de compte, les résultats générés peuvent aider à répondre à des questions systématiques sur la façon dont le système nerveux se développe.

Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus à l’aide de l’approche d’imagerie multicolore in vivo décrite ici. Nous montrons que Brainbow clones codés en couleur de cellules dans la zone ventriculaire proliférée de l’arrière-poisson zèbre en développement14 (figure 1).
Typiquement, lorsque les cellules étiquetées Brainbow ont été disposées le long d’une fibre radiale particulière, elle...

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Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

L’imagerie in vivo est un outil puissant qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes cellulaires sous-jacents au développement du système nerveux. Ici, nous décrivons une technique pour utiliser la microscopie confocale en time-lapse pour visualiser un grand nombre de cellules multicolores étiquetées Brainbow en temps réel dans le système nerveux du poisson zèbre en développement.

Visualiser le cerveau en développement dans le poisson zèbre vivant à l’aide de Brainbow et Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales sur la dynamique des cellules progénitrices neurales et leur progéniture qui sous-tendent le développement du cerveau vertébré. Le principal avantage de cette technique est la capacité de visualiser directement plusieurs amas de cellules liées à la clonally dans le cerveau vivant pendant de nombreuses heures de développement. Le protocole peut également être appliqué à l’étude de la dynamique clonale et progénitrice dans d’autres systèmes en développement de l’embryon de poisson zèbre.La visualisation utilisant cette méthode est particulièrement utile pour observer directement les processus fondamentaux qui se produisent pendant le développement neuronal. L’après-midi précédant l’exécution des micro-injections, installez du poisson zèbre adulte de type sauvage dans des réservoirs d’accouplement séparés par sexe. Le lendemain matin, préparez la solution ADN selon les directives manuscrites et injectez environ 4,2 nano litres de cette solution dans des embryons de poisson zèbre à cellules dans les 45 minutes suivant la fécondation.Maintenir les embryons injectés dans E trois moyens et un incubateur de 28 degrés Celsius pendant 24 heures, puis appeler les embryons morts et déformés du groupe. Transférer jusqu’à 20 embryons en bonne santé dans un tube de 50 millilitres, le remplir de 10 millilitres de E trois et placer un bouchon sur le dessus de chaque tube. Placez une grille avec les tubes de 50 millilitres droit dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 80 à 90 minutes, en vous assurant que le niveau d’eau dans le bain est plus élevé que le E trois dans le tube.Retirez la grille du tube du bain d’eau et placez-la dans l’incubateur de 28 degrés Celsius. Laisser refroidir jusqu’à une heure pour que les trois E refroidissent et que les embryons se réacclimatent à la température. Ensuite, transférez-les dans des boîtes de Pétri avec 0,2 millimolar PTU et E trois maintenus au chaud dans l’incubateur de 28 degrés Celsius.À deux à quatre heures après le choc thermique, examiner les embryons sous un microscope standard de dissection de fluorescence pour l’expression de CFP ou YFP qui indique la recombinaison réussie de Brainbow. Sélectionnez les embryons avec une expression FP robuste partout et transférez-les dans un plat séparé avec PTU. Imagez-les un, deux ou trois jours après la fécondation.L’expression qui apparaît faible sous un microscope de fluorescence peut effectivement être bien visualisée dans l’imagerie confocale de time-lapse. Avant le jour de l’expérience, préparez la chambre d’imagerie et l’outil de manipulation d’embryons. Pour préparer la chambre d’imagerie, supergluez soigneusement un anneau en plastique au centre d’une boîte de Pétri de 60 millimètres.Construisez le manipulateur en collant super une petite longueur de ligne de pêche en nylon à l’extrémité d’un bâton d’écouvillon en bois de quatre pouces. Si nécessaire, déchorionner les embryons au microscope à dissection avant de monter. Pour monter les embryons, transférez le poisson au centre de l’anneau en plastique dans la chambre d’imagerie et enlevez autant d’excès de E trois que possible avec une pipette de transfert à pointe fine.Utilisez une pipette de transfert propre pour couvrir le poisson avec un pour cent d’agarose de faible fonte et E trois, remplissant l’anneau en plastique entier avec une couche d’agarose. Puis tirez doucement l’embryon vers le haut dans la pointe de pipette et de nouveau dans l’agarose sans introduire de bulles d’air. Utilisez un manipulateur d’embryons pour orienter rapidement le poisson et l’agarose avant qu’il ne durcisse.Si vous faites l’imagerie au microscope droit, placez l’embryon le plus près possible de la surface supérieure de l’agarose, en vous assurant qu’il est parallèle au fond de la chambre d’imagerie avec la queue droite. Attendez que l’agarose durcisse, puis remplissez la chambre d’imagerie avec E trois, en ajoutant autant que possible pour tenir compte de l’évaporation au cours de l’imagerie. Placez la chambre d’imagerie avec le poisson et E trois sur le microscope confocal.Sélectionnez ensuite l’objectif avec une ouverture numérique élevée et une longue distance de travail. Trouvez une région avec un étiquetage suffisamment dense et lumineux des cellules et configurez les paramètres d’acquisition. Il s’agit d’un exemple utilisant le logiciel Zen, mais les paramètres varient en fonction des lignes de microscope et laser disponibles.Préparez trois pistes pour imager chaque canal FP séquentiellement. Utilisez un laser argon pour exciter le CFP à 458 nanomètres et YFP à 514 nanomètres, et utilisez un laser nanométrique DPSS 561 pour exciter dTomato. Recueillir les missions pour les trois aux longueurs d’onde appropriées.Sélectionnez la plage de pile Z à l’image et un intervalle de temps entre 10 et 30 minutes pour suivre les événements mitotiques et apoptotiques. Enfin, sélectionnez la durée de la session d’imagerie et exécutez l’expérience. Une fois l’imagerie terminée, enregistrez les données brutes au format CZI si vous utilisez zen ou un autre format compatible avec fidji, puis importez les images aux Fidji en utilisant l’importateur de formats biologiques.La formation image multicolore in vivo de time-lapse a été employée pour montrer des clones codés de couleur de Brainbow des cellules dans la zone ventriculaire proliférante de l’hindbrain en développement de zebrafish. Les cellules étiquetées Brainbow disposées le long d’une fibre radiale particulière partageaient la même couleur. Qui peut être quantifié comme les poids relatifs du canal RVB.Ceci suggère que ces groupes radio étaient des clones des cellules de division et que leur couleur semblable pourrait être employée pour les identifier comme étant clonally connexes. Une analyse quantitative des couleurs a montré que les cellules des filles expriment la même couleur que la cellule de leur mère. Mais que les grappes radio voisines de cellules peuvent être distinguées les unes des autres.De nombreux clones de cellules apparentées peuvent être suivis simultanément pendant des heures in vivo, permettant une analyse et une comparaison de la lignée multiplexe. Quantification de l’expression des couleurs chez les clones à deux, puis à nouveau à trois jours après la fécondation a montré que l’expression Brainbow est resté relativement constant de deux à trois jours. La formation image de time-lapse a indiqué de nombreuses cellules subissant la migration nucléaire intercinétique et la division cellulaire d’un à deux jours après fertilisation, ce qui permet d’étudier le cycle cellulaire.Un cycle cellulaire moyen de 8,4 heures a été calculé, ce qui est comparable aux mesures précédentes chez le poisson zèbre. En outre, cette technique d’imagerie a été utilisée pour observer les cellules individuelles subissant les changements morphologiques stéréotypés associés à l’apoptose, tels que le saignement de membrane et la fragmentation cellulaire. Parce que cette méthode est effectuée in vivo, le poisson zèbre peut être sauvé de la chambre d’imagerie et maintenu pour l’imagerie ou d’autres expériences à des moments ultérieurs.L’utilisation de cette technique nous permet d’explorer de nouvelles questions sur les rôles des cellules clonally connexes pendant le développement neuronal.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mesure de la stabilité des protéines dans le salon embryons de poissons zèbres en utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Recherche

Biologie du développement

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Capture réparation des tissus chez le poisson zèbre larves avec Time-lapse Brightfield stéréomicroscopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

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Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

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Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse des Zebrafish Kidney Development avec Time-lapse d&#39;imagerie utilisant un microscope à dissection équipé pour sectionner optique

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