Name: visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging
Uploaded: 2020-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging at JoVE.com

Wir danken Y. A. Pan, J. Livet und Z. Tobias für ihre technischen und intellektuellen Beiträge. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (Preis 1553764) und dem M.J. Murdock Charitable Trust unterstützt.

Verfahren, an denen tiertierische Personen beteiligt sind, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Lewis & Clark College genehmigt.
1. Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryonen
<ol><li>Richten Sie wilde Art, erwachsene Zebrafische in sex-getrennten Paarungtanks am Nachmittag vor der Durchführung von Mikroinjektionen39,40.</li>
	<li>Bereiten Sie die DNA-Lösung am Morgen der Mikroinjektionen vor. Verdünnung <...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Visualisierung von Klonen von Vorläuferzellen und Neuronen im sich entwickelnden Zebrafisch-Hindbrain und folgt ihnen in vivo mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalmikroskopie11. Der große Vorteil dieses Protokolls im Vergleich zu In-vitro- oder Ex-vivo-Studien ist die Fähigkeit, die proliferative Zone des Wirbeltierhirns in seinem natürlichen Milieu im Laufe der Zeit direkt zu beobachten. Diese Technik baut auf früheren Studien auf, die einen einzel...

In den frühen Entwicklungsphasen teilen sich Pools spezialisierter Vorläuferzellen wiederholt in proliferativeZonen und produzieren verschiedene Arrays von Tochterzellen. Die Zellen, die während dieser Entwicklungsperiode geboren werden, werden sich dann differenzieren und reisen, um die entstehenden Organe zu bilden. Im Nervensystem führen Vorläufer wie radiale Glia zu unreifen Neuronen in ventrikulären Zonen. Wenn Neuronen von Ventrikeln wegwandern und reifen, bildet das expandierende Gewebe schließlich die hochkomplexen Strukturen des Gehirns1,2,3,4,5,6. Die Koordination zwischen Derliganundierung und Differenzierung und Migration von Neuronen wird die endgültige Größe, Form und damit Funktion des Gehirns bestimmen, direkt beeinflussenverhalten7,8,9,10. Während eine strenge Kontrolle über diese Prozesse eindeutig entscheidend für die normale Gehirnentwicklung ist, sind die globalen Mechanismen, die diese Dynamik regulieren, nicht gut verstanden. Hier beschreiben wir ein Werkzeug, um die Entwicklung des Nervensystems mit einer zellulären Auflösung zu untersuchen, so dass Forscher Progenitorzellen und Neuronen in vivo im sich entwickelnden Zebrafischhirn mit Brainbow visualisieren und ihr Verhalten im Laufe der Zeit über die Zeitraffer-Konfokalmikroskopie11verfolgen können. Der Ansatz kann auch angepasst werden, um andere Teile des sich entwickelnden Embryos zu visualisieren.
Um zellenimimim entwickelnden Zebrafischhirn zu beobachten und zu unterscheiden, haben wir die Brainbow-Zellbeschriftungstechnik11angepasst. Brainbow verwendet die zufällig ermittelte, kombinatorische Expression von drei verschiedenen fluoreszierenden Proteinen (FPs), um eine Population von Zellen zu kennzeichnen. Während die Standardexpression für brainbow Expression die rote FP dTomato ist, führt die Rekombination durch das Enzym Cre recombinase zur Expression von mCerulean (Cyan fluoreszierendes Protein, CFP) oder gelbem fluoreszierendem Protein (YFP)12,13. Die kombinierte Menge jedes FP, die in einer Zelle ausgedrückt wird, verleiht ihm einen einzigartigen Farbton, der eine klare visuelle Unterscheidung von benachbarten Zellen ermöglicht. Wenn sich eine Vorläuferzelle teilt, erbt jede Tochterzelle die Farbe von ihrer Mutterzelle, erzeugt farbcodierte Klone und ermöglicht es Forschern, die Zelllinie11,14nachzuverfolgen. Während ursprünglich verwendet, um neuronale Schaltkreise bei Mäusen12zu analysieren, Brainbow wurde seitdem in einer Vielzahl von Modellorganismen exprimiert, einschließlich Zebrafisch15.
Unsere Technik baut auf früheren mehrfarbigen Etikettierungs- und Bildgebungsmethoden auf, um mehrere farbcodierte Klone im Laufe der Zeit direkt in lebenden Zebrafischen abzubilden. Aufgrund ihrer optischen Transparenz als Embryonen eignen sich Zebrafische gut für bildgebende Experimente16, und frühere Studien haben Brainbow in Zebrafischen verwendet, um eine Vielzahl von Geweben zu studieren, einschließlich des Nervensystems11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Die Fähigkeit, sich direkt in den lebenden Organismus einbilden zu können, zusammen mit ihrer schnellen Ex-Utero-Entwicklung, machen Zebrafische zu einem wertvollen Modell der Wirbeltierentwicklung. Im Gegensatz zum Säugetierhirn ist die gesamte proliferative Zone des Zebrafisch-Hinterhirns leicht für die Bildgebung ohne Störung seiner endogeneUmgebung6 verfügbar. Dies ermöglicht Experimente im lebenden Organismus, anstatt in vitro oder festen Gewebepräparaten. Im Gegensatz zu festen bildgebenden Experimenten ermöglichen In-vivo-Studien ein Längsdesign, das stundenlange Datenergebnisse erzeugt, die auf Muster analysiert werden können, wodurch die Wahrscheinlichkeit erhöht wird, relativ seltene Ereignisse zu beobachten. Je nach Geschwindigkeit und Länge der Ereignisse von Interesse können die Forscher kurze (1-2 h) oder lange (bis zu 16 h) Zeitraffer-Bildgebungsexperimente durchführen. Durch die Verwendung des Zebrafisch-Wärmeschockpromotors 70 (hsp70, hsp) kann der Brainbow-Ausdruck zeitlich gesteuert werden28,29. Darüber hinaus eignet sich der von diesem Promotor induzierte Mosaikausdruck gut zum Etikettieren und Verfolgen vieler Klone11.
Die Fähigkeit, mehrere Klone im lebenden Gehirn visuell zu identifizieren, ist ein Vorteil dieser Methode. Wichtige frühere Studien, die die Rolle von Klonen in der Entwicklung des Nervensystems untersuchten, nutzten retrovirale Vektoren, um eine einzelne Vorläuferzelle und ihre Nachkommen mit einem einzigen FP oder einem anderen leicht visualisierten Protein zu kennzeichnen. Eine solche Kennzeichnung ermöglicht es Forschern, einen einzelnen Klon im Laufe der Zeit zu beobachten, entweder in vitro oder in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. Im Gegensatz zu Methoden, um das Verhalten von Zellen innerhalb eines Klons zu verfolgen, ermöglichen die unterschiedlichen Farben von Brainbow forschern, die Dynamik zwischen Klonen zu beobachten. Darüber hinaus werden durch die Verwendung von Brainbow, um viele Klone im Gehirn zu kennzeichnen, zusätzliche Daten über das klonale Verhalten im Verhältnis zu Techniken gesammelt, die einen einzelnen Klon11kennzeichnen. Wichtig ist, dass die hier beschriebenen Ansätze erweitert werden können, um Entwicklungsvergleiche zwischen Fischen zu erzeugen, die unterschiedliche genetischen oder pharmakologischen Manipulationen unterzogen wurden18. Insgesamt machen diese Vorteile die Zeitraffer-in-vivo-Konfokalbildgebung von Brainbow-exprimierenden Zebrafischen ideal für Forscher, die die Entwicklung des Wirbeltiernervensystems erforschen, insbesondere für diejenigen, die an der Rolle von Klonen interessiert sind.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>134020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06690</td>
			<td>Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 lb nylon fishing line</td>
			<td>SecureLine</td>
			<td>NMT250</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>867-WC NO GLUE</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0298M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>490016-616</td>
			<td>Used to store LMA at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence dissection scope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3158</td>
			<td>To maintain embryos at 28&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection plate molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2320</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0395</td>
			<td>For E3 and for DNA solution for injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E3120</td>
			<td>To create agarose injection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (LMA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks</td>
			<td>Aquaneering, Inc.</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9397</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4058-01</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (90 mm, 60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>To house embryos and create imaging chamber (60 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft stitch ring markers</td>
			<td>Clover Needlecraft, Inc.</td>
			<td>354</td>
			<td>For creating imaging chamber with Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue (Ultra gel control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>BD329412</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging

Die Entwicklung des Wirbeltiernervensystems erfordert eine präzise Koordination komplexer zellulärer Verhaltensweisen und Wechselwirkungen. Der Einsatz hochauflösender in vivo-Bildgebungstechniken kann ein klares Fenster in diese Prozesse im lebenden Organismus geben. Zum Beispiel können zellteilungsmittelteilungende Zellen und ihre Nachkommen in Echtzeit verfolgt werden, wenn sich das Nervensystem bildet. In den letzten Jahren haben technische Fortschritte in multicolor-Techniken die Arten von Fragen erweitert, die untersucht werden können. Der mehrfarbige Brainbow-Ansatz kann nicht nur verwendet werden, um zwischen gleichartigen Zellen zu unterscheiden, sondern auch mehrere verschiedene Klone verwandter Zellen, die jeweils aus einer Vorläuferzelle stammen, zu kodieren. Dies ermöglicht eine Multiplex-Linienanalyse vieler verschiedener Klone und deren Verhalten gleichzeitig während der Entwicklung. Hier beschreiben wir eine Technik zur Verwendung von Zeitraffer-Konfokalmikroskopie, um eine große Anzahl von mehrfarbigen Brainbow-markierten Zellen in Echtzeit innerhalb des sich entwickelnden Zebrafischnervensystems zu visualisieren. Dies ist besonders nützlich für die Verfolgung zellulärer Wechselwirkungen zwischen ähnlichen Zellen, die mit traditionellen, von Einem Promoter angetriebenen Farben nur schwer differenziell zu kennzeichnen sind. Unser Ansatz kann verwendet werden, um Linienbeziehungen zwischen mehreren verschiedenen Klonen gleichzeitig zu verfolgen. Die großen Datensätze, die mit dieser Technik generiert werden, liefern umfangreiche Informationen, die quantitativ über genetische oder pharmakologische Manipulationen hinweg verglichen werden können. Letztlich können die generierten Ergebnisse helfen, systematische Fragen zu beantworten, wie sich das Nervensystem entwickelt.

In diesem Abschnitt werden Beispiele für Ergebnisse veranschaulicht, die mit dem hier beschriebenen mehrfarbigen Zeitraffer-Bildgebungsansatz in vivo erzielt werden können. Wir zeigen, dass Brainbow farbcodierte Klone von Zellen in der proliferativen ventrikulären Zone des sich entwickelnden Zebrafisch-Hinterhirns14 (Abbildung 1).
Wenn Brainbow-markierte Zellen entlang einer bestimmten radialen Faser angeordnet waren, teilten sie in der ...

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Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

In vivo Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das verwendet werden kann, um die zellulären Mechanismen zugrunde liegenden Entwicklung des Nervensystems zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Verwendung von Zeitraffer-Konfokalmikroskopie, um eine große Anzahl von mehrfarbigen Brainbow-markierten Zellen in Echtzeit innerhalb des sich entwickelnden Zebrafischnervensystems zu visualisieren.

Visualisierung des sich entwickelnden Gehirns bei lebenden Zebrafischen mit Brainbow und Zeitraffer-Konfokalbildnis

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Diese Methode kann helfen, grundlegende Fragen über die Dynamik der neuronalen Vorläuferzellen und ihre Nachkommen zu beantworten, die der Entwicklung des Wirbeltierhirns zugrunde liegen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, mehrere Cluster von klonal verwandten Zellen innerhalb des lebenden Gehirns über viele Stunden der Entwicklung direkt zu visualisieren. Das Protokoll kann auch auf die Untersuchung der Clonal- und Vorläuferdynamik in anderen sich entwickelnden Systemen des Zebrafisch-Embryos angewendet werden.Die Visualisierung mit dieser Methode ist besonders nützlich, um grundlegende Prozesse, die während der neuronalen Entwicklung auftreten, direkt zu beobachten. Am Nachmittag vor der Durchführung von Mikroinjektionen, richten Sie wilde Typ erwachsene Zebrafische in Sex getrennten Paarungtanks. Am nächsten Morgen bereiten Sie die DNA-Lösung nach Manuskriptanweisungen vor und injizieren Sie innerhalb von 45 Minuten nach der Befruchtung etwa 4,2 Nanoliter dieser Lösung in eine Zelle Zebrafisch-Embryonen.Halten Sie die injizierten Embryonen in E drei Medium und einem 28 Grad Celsius Inkubator für 24 Stunden, dann rufen Sie die toten und deformierten Embryonen aus der Gruppe. Übertragen Sie bis zu 20 gesunde Embryonen in ein 50-Milliliter-Rohr, füllen Sie es mit 10 Milliliter E drei und legen Sie eine Kappe auf jede Röhre. Legen Sie ein Rack mit den 50 Milliliter Röhren aufrecht in einem 37 Grad Celsius Wasserbad für 80 bis 90 Minuten, um sicherzustellen, dass der Wasserstand im Bad höher ist als die E drei in der Röhre.Entfernen Sie das Rohrgestell aus dem Wasserbad und legen Sie es in den 28 Grad Celsius Inkubator. Bis zu einer Stunde für die E drei abkühlen lassen und die Embryonen auf die Temperatur reakklimatisieren. Dann übertragen Sie sie auf Petri-Gerichte mit 0,2 Millimolar PTU und E drei warm gehalten in der 28 Grad Celsius Inkubator.Zwei bis vier Stunden nach dem Hitzeschock untersuchen Sie die Embryonen unter einem Standard-Fluoreszenz-Sezierenmikroskop auf expression von GFP oder YFP, das auf eine erfolgreiche Brainbow-Rekombination hinweist. Wählen Sie Embryonen mit einem robusten FP-Ausdruck durch und übertragen Sie sie auf eine separate Schale mit PTU. Stellen Sie sich ein, zwei oder drei Tage nach der Befruchtung vor.Expression, die unter einem Fluoreszenzmikroskop verdsimiert erscheint, kann in der konfokalen Zeitraffer-Bildgebung tatsächlich gut visualisiert werden. Bereiten Sie vor dem Tag des Experiments die Bildgebungskammer und das Werkzeug zur Embryonenmanipulation vor. Um die Bildkammer vorzubereiten, überlagern Sie vorsichtig einen Kunststoffring in die Mitte einer 60-Millimeter-Petrischale.Konstruieren Sie den Manipulator, indem Sie eine kleine Länge Nylon-Angelschnur super an das Ende eines vier Zoll großen Holztupferstabs kleben. Falls erforderlich, dechorieren Sie die Embryonen unter einem Seziermikroskop vor der Montage. Um die Embryonen zu montieren, übertragen Sie die Fische in die Mitte des Kunststoffrings in der Bildkammer und entfernen Sie so viel überschüssiges E drei wie möglich mit einer fein gekippten Transferpipette.Verwenden Sie eine saubere Transferpipette, um den Fisch mit einem Prozent niedriger Schmelze-Agarose und E drei zu bedecken und den gesamten Kunststoffring mit einer Agaroseschicht zu füllen. Ziehen Sie den Embryo dann vorsichtig in die Pipettespitze und zurück in die Agarose, ohne Luftblasen einzuschleusen. Verwenden Sie einen Embryo-Manipulator, um den Fisch und die Agarose schnell zu orientieren, bevor sie verhärtet.Wenn Sie die Bildgebung mit einem aufrechten Mikroskop machen, positionieren Sie den Embryo so nah wie möglich an der oberen Oberfläche der Agarose, um sicherzustellen, dass sie parallel zur Unterseite der Bildkammer mit ihrem Geraden Schwanz sind. Warten Sie, bis die Agarose aushärtet, füllen Sie dann die Bildgebungskammer mit E drei, so viel wie möglich hinzugefügt, um die Verdunstung im Laufe der Bildgebung zu berücksichtigen. Legen Sie die Bildkammer mit dem Fisch und E drei auf das konfokale Mikroskop.Wählen Sie dann das Objektiv mit einer hohen numerischen Blende und einem langen Arbeitsabstand aus. Suchen Sie einen Bereich mit entsprechend dichter und heller Beschriftung von Zellen, und richten Sie die Erfassungsparameter ein. Dies ist ein Beispiel für die Verwendung von Zen-Software, aber die Einstellungen variieren je nach verfügbaren Mikroskop- und Laserlinien.Bereiten Sie drei Spuren vor, um jeden FP-Kanal sequenziell abzubilden. Verwenden Sie einen Argonlaser, um CFP mit 458 Nanometern und YFP mit 514 Nanometern zu begeistern, und verwenden Sie einen DPSS 561 Nanometer Laser, um dTomato zu begeistern. Sammeln Sie die Missionen für die drei auf den entsprechenden Wellenlängen.Wählen Sie den zu abbildenden Z-Stack-Bereich und ein Zeitintervall zwischen 10 und 30 Minuten aus, um mitotische und apoptotische Ereignisse nachzuverfolgen. Wählen Sie schließlich die Länge der Imaging-Sitzung aus, und führen Sie das Experiment aus. Nachdem die Bildgebung abgeschlossen ist, speichern Sie die Rohdaten im CZI-Format, wenn Sie Zen oder ein anderes Format verwenden, das mit Fidschi kompatibel ist, und importieren Sie die Bilder dann mit dem Importvon Bioformaten nach Fidschi.In vivo multicolor Zeitraffer-Bildgebung wurde verwendet, um Brainbow farbcodierte Klone von Zellen in der proliferativen ventrikulären Zone des sich entwickelnden Zebrafisch-Hinterhirns zu zeigen. Brainbow beschriftete Zellen, die entlang einer bestimmten radialen Faser angeordnet sind, teilten sich die gleiche Farbe. Das kann als relative RGB-Kanalgewichtungen quantifiziert werden.Dies deutet darauf hin, dass diese Funkgruppen Klone von teilenden Zellen waren und dass ihre ähnliche Farbe verwendet werden könnte, um sie als klonal verwandt zu identifizieren. Eine quantitative Farbanalyse zeigte, dass Tochterzellen die gleiche Farbe wie die Zelle ihrer Mutter ausdrücken. Aber dass benachbarte Funkcluster von Zellen voneinander unterschieden werden können.Zahlreiche Klone verwandter Zellen können gleichzeitig über Stunden in vivo verfolgt werden, was eine Multiplex-Linienanalyse und einen Vergleich ermöglicht. Die Quantifizierung des Farbausdrucks in Klonen bei zwei und dann wieder an drei Tagen nach der Befruchtung zeigte, dass der Brainbow-Ausdruck von zwei bis drei Tagen relativ konstant blieb. Die Zeitraffer-Bildgebung zeigte zahlreiche Zellen, die sich einer interkinetischen Kernmigration und Zellteilung von einem bis zwei Tagen nach der Befruchtung unterziehen, was es ermöglicht, den Zellzyklus zu untersuchen.Es wurde ein durchschnittlicher Zellzyklus von 8,4 Stunden berechnet, der mit früheren Messungen bei Zebrafischen vergleichbar ist. Darüber hinaus wurde diese bildgebende Technik verwendet, um einzelne Zellen zu beobachten, die den stereotypen morphologischen Veränderungen im Zusammenhang mit Apoptose unterzogen wurden, wie Zwierblessur und Zellfragmentierung. Da diese Methode in vivo durchgeführt wird, können Zebrafische aus der Bildkammer gerettet und zu späteren Zeitpunkten für Bildgebung oder andere Experimente aufrechterhalten werden.Der Einsatz dieser Technik ermöglicht es uns, neue Fragen über die Rollen klonal verwandter Zellen während der neuronalen Entwicklung zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Erfassen von Gewebereparatur in Zebrafisch-Larven mit Zeitrafferhellstereomikroskopie

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing<em&gt; In Vivo</em&gt; Zellmigration unter Verwendung von Zelltransplantationen und Zeitraffer-Imaging in Zebrafischembryonen

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

Visualisierung der Interrenal- Steroidogenic Gewebe und seine Vascular Mikromilieu in Zebrabärbling

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Live-konfokale Bildgebung Entwicklung Arabidopsis Blumen

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion von Hypoxie im lebenden Frosch und Zebrafisch Embryonen

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Multi-Photonen-Time Lapse Imaging Entwicklung in Echtzeit zu visualisieren: Visualisierung der Migration Neuralleisten-Zellen in den Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...