Name: visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging
Uploaded: 2020-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging at JoVE.com

हम तकनीकी और बौद्धिक योगदान के लिए वाई ए पैन, जे Livet और जेड Tobias का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन (अवार्ड 1553764) और एमजे मुर्डॉक चैरिटेबल ट्रस्ट ने सपोर्ट किया।

लुईस एंड क्लार्क कॉलेज में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा पशु विषयों से जुड़ी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई है।
1. जेब्राफिश भ्रूण का माइक्रोइंजेक्शन
<ol><li>माइक्रोइंजेक्...

यह प्रोटोकॉल विकासशील जेब्राफिश हिंदब्रेन में जनक कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के क्लोन की कल्पना करने की एक विधि का वर्णन करता है और बोइंद्रधनुष और समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी11का उपयोग करके व?...

विकास के प्रारंभिक चरणों में, विशेष जनक कोशिकाओं के पूल बार-बार प्रजनक क्षेत्रों में विभाजित होते हैं, जिससे बेटी कोशिकाओं की विविध सरणी का उत्पादन होता है। इस विकास अवधि के दौरान पैदा हुई कोशिकाएं तब अंतर करेंगी और नवजात अंगों के रूप में यात्रा करेंगी। तंत्रिका तंत्र में, रेडियल ग्लिया जैसे जनक वेंट्रिकुलर क्षेत्रों में अपरिपक्व न्यूरॉन्स को जन्म देते हैं। जैसे ही न्यूरॉन्स वेंट्रिकल्स और परिपक्व से दूर चले जाते हैं, विस्तार ऊतक अंततः मस्तिष्क की अत्यधिक जटिल संरचनाएं1,,2,,3,,4,,5,,6बनाता है। जनकों के विभाजन और न्यूरॉन्स के भेदभाव और प्रवास के बीच समन्वय अंतिम आकार, आकार, और इस प्रकार मस्तिष्क के कार्य को निर्धारित करेगा, जो सीधे व्यवहार7,8,8,9,,10को प्रभावित करता है। जबकि इन प्रक्रियाओं पर तंग नियंत्रण सामान्य मस्तिष्क के विकास के लिए स्पष्ट रूप से महत्वपूर्ण है, इन गतिशीलता को विनियमित करने वाले वैश्विक तंत्र को अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है। यहां हम एक सेलुलर संकल्प पर तंत्रिका तंत्र के विकास का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण का वर्णन करते हैं, जिससे शोधकर्ताओं को बोरेन के साथ विकसित जेब्राफिश मस्तिष्क में वीवो में जनक कोशिकाओं और न्यूरॉन्स की कल्पना करने की अनुमति मिल जाती है और समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी11के माध्यम से समय के साथ उनके व्यवहार को ट्रैक किया जा सकता है। दृष्टिकोण को विकासशील भ्रूण के अन्य हिस्सों की कल्पना करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।
विकासशील जेब्राफिश मस्तिष्क में कोशिकाओं के बीच निरीक्षण और भेद करने के लिए, हमने ब्रैनबोसेल-लेबलिंग तकनीक11को अनुकूलित किया है। Brainbow कोशिकाओं की आबादी लेबल करने के लिए तीन अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) की बेतरतीब ढंग से निर्धारित, संयोजन अभिव्यक्ति का उपयोग करता है । जबकि ब्रैनइंद्रधनुष अभिव्यक्ति के लिए डिफ़ॉल्ट अभिव्यक्ति लाल एफपी dTomato है, एंजाइम क्रे द्वारा पुनर्संयोजन के परिणामस्वरूप मैसेरूलन (सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन, सीएफपी) या येलो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी)12,,13की अभिव्यक्ति होती है। एक सेल में व्यक्त प्रत्येक एफपी की संयुक्त राशि इसे एक अनूठा रंग देती है, जिससे पड़ोसी कोशिकाओं से स्पष्ट दृश्य भेद होता है। इसके अतिरिक्त, जब एक जनक कोशिका विभाजित होती है, तो प्रत्येक बेटी सेल अपनी मदर सेल से रंग का वारिस होगा, रंग-कोडित क्लोन का उत्पादन करेगा और शोधकर्ताओं को सेल वंश11,,14का पता लगाने की अनुमति देगा। जबकि मूल रूप से चूहों12में न्यूरोनल सर्किटरी का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है, इसके बाद से ब्रैनरेन को जेब्राफिश15सहित विभिन्न प्रकार के मॉडल जीवों में व्यक्त किया गया है।
हमारी तकनीक पिछले मल्टीकलर लेबलिंग और इमेजिंग तरीकों पर बनाता है सीधे ज़ेब्राफ़िश रहने में समय के साथ कई रंग कोडित क्लोन छवि । भ्रूण के रूप में उनकी ऑप्टिकल पारदर्शिता के कारण, जेब्राफिश इमेजिंग प्रयोगों के लिए अच्छी तरह से अनुकूलहैं,और पिछले अध्ययनों ने तंत्रिका तंत्र11,,15,,17,18,,19,,20, 21,,,21,22,,23,,24,,25सहित विभिन्न ऊतकों का अध्ययन करने के लिए जेब्राफिश में ब्रून का उपयोग कियाहै, 26,27. जीवित जीव में सीधे छवि बनाने की क्षमता, उनके तेजी से पूर्व गर्भाशय विकास के साथ, जेब्राफिश को कशेरुकी विकास का एक मूल्यवान मॉडल बनाती है। स्तनधारी मस्तिष्क के विपरीत, जेब्राफिश हिंदब्रेन का पूरा प्रसारक्षेत्र अपने एंडोजेनस वातावरण6में व्यवधान के बिना इमेजिंग के लिए आसानी से उपलब्ध है। यह इन विट्रो या निश्चित ऊतक तैयारी के बजाय जीवित जीव में प्रयोग ों को आयोजित करने की अनुमति देता है। निश्चित इमेजिंग प्रयोगों के विपरीत, वीवो अध्ययनों में एक देशीयंधात्मक डिजाइन के लिए अनुमति देते हैं, जो पैटर्न के लिए विश्लेषण किए जा सकने वाले घंटों के डेटा का उत्पादन करते हैं, इस प्रकार अपेक्षाकृत दुर्लभ घटनाओं को देखने की संभावना बढ़ जाती है। गति और ब्याज की घटनाओं की लंबाई के आधार पर, शोधकर्ताओं ने कम (1-2 घंटे) या लंबे समय (~16 घंटे तक) समय चूक इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए चुन सकते हैं । जेब्राफिश हीट शॉक प्रमोटर 70 (एचएसपी70, एचएसपी) का उपयोग करके, ब्रैनइंद्रधनुष अभिव्यक्ति को28,,29को नियंत्रित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस प्रमोटर द्वारा प्रेरित मोज़ेक अभिव्यक्ति कई क्लोन11को लेबल करने और ट्रैक करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।
जीवित मस्तिष्क के भीतर कई क्लोन की पहचान करने की क्षमता इस विधि का लाभ है। तंत्रिका तंत्र के विकास के भीतर क्लोन की भूमिका की जांच करने वाले महत्वपूर्ण पिछले अध्ययनों ने एक ही प्रोजेनिटर सेल और इसकी संतान को एक एफपी या अन्य आसानी से कल्पना प्रोटीन का उपयोग करके लेबल करने के लिए रेट्रोवायरल वैक्टर का उपयोग किया। इस तरह की लेबलिंग शोधकर्ताओं को समय के साथ एक ही क्लोन का पालन करने की अनुमति देती है, या तो इन विट्रो में,या वीवो2, 30 ,31,,,32,33,3431,35 ,3636,37,38में ।, एक क्लोन के भीतर कोशिकाओं के व्यवहार को ट्रैक करने के तरीकों के विपरीत, Bइंद्रधनुष के अलग रंग शोधकर्ताओं क्लोन के बीच गतिशीलता का पालन करने की अनुमति देते हैं । इसके अतिरिक्त, मस्तिष्क के भीतर कई क्लोन लेबल करने के लिए Bइंद्रधनुष का उपयोग करके, क्लोनल व्यवहार पर अतिरिक्त डेटा तकनीकों के सापेक्ष एकत्र किया जाता है जो एक क्लोन11लेबल करते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि यहां वर्णित दृष्टिकोणों का विस्तार मछली के बीच विकासात्मक तुलना उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है जो18में विभिन्न आनुवंशिक या औषधीय जोड़तोड़ से गुजरे हैं। कुल मिलाकर, ये फायदे वर्सेब्रेट तंत्रिका तंत्र के विकास की खोज करने वाले शोधकर्ताओं के लिए जेब्राफिश आदर्श, विशेष रूप से क्लोन की भूमिका में रुचि रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए बोइंद्रधनुष-व्यक्त जेब्राफिश आदर्श के वीवो कॉन्फोकल इमेजिंग में समय-चूक करते हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>134020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06690</td>
			<td>Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 lb nylon fishing line</td>
			<td>SecureLine</td>
			<td>NMT250</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>867-WC NO GLUE</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0298M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>490016-616</td>
			<td>Used to store LMA at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence dissection scope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3158</td>
			<td>To maintain embryos at 28&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection plate molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2320</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0395</td>
			<td>For E3 and for DNA solution for injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E3120</td>
			<td>To create agarose injection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (LMA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks</td>
			<td>Aquaneering, Inc.</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9397</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4058-01</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (90 mm, 60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>To house embryos and create imaging chamber (60 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft stitch ring markers</td>
			<td>Clover Needlecraft, Inc.</td>
			<td>354</td>
			<td>For creating imaging chamber with Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue (Ultra gel control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>BD329412</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging

कशेरुकी तंत्रिका तंत्र के विकास के लिए जटिल सेलुलर व्यवहार और बातचीत के सटीक समन्वय की आवश्यकता होती है। वीवो इमेजिंग तकनीकों में उच्च संकल्प का उपयोग जीवित जीव में इन प्रक्रियाओं में एक स्पष्ट खिड़की प्रदान कर सकता है। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं और उनकी संतानों को विभाजित करने का पालन वास्तविक समय में किया जा सकता है क्योंकि तंत्रिका तंत्र रूपों। हाल के वर्षों में, बहुरंगी तकनीकों में तकनीकी प्रगति ने उन प्रश्नों के प्रकारों का विस्तार किया है जिनकी जांच की जा सकती है। बहुरंगी ब्रून दृष्टिकोण का उपयोग न केवल कोशिकाओं की तरह भेद करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि संबंधित कोशिकाओं के कई अलग-अलग क्लोन रंग-कोड के लिए भी किया जा सकता है जो प्रत्येक एक जनक कोशिका से प्राप्त होते हैं। यह विकास के दौरान एक साथ कई अलग-अलग क्लोन और उनके व्यवहार के मल्टीप्लेक्स वंश विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। यहां हम विकासशील जेब्राफिश तंत्रिका तंत्र के भीतर वास्तविक समय में बड़ी संख्या में बहुरंगी ब्रून-लेबल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं। यह कोशिकाओं की तरह के बीच सेलुलर बातचीत का पालन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है, जो पारंपरिक प्रमोटर संचालित रंगों का उपयोग करके अलग-अलग लेबल करना मुश्किल है। हमारे दृष्टिकोण का उपयोग एक साथ कई अलग-अलग क्लोन के बीच वंश संबंधों को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग करके उत्पन्न बड़े डेटासेट समृद्ध जानकारी प्रदान करते हैं जिनकी तुलना आनुवंशिक या औषधीय जोड़तोड़ में मात्रात्मक रूप से की जा सकती है। अंततः उत्पन्न परिणाम तंत्रिका तंत्र कैसे विकसित होते हैं, इसबारे में व्यवस्थित सवालों का जवाब देने में मदद कर सकते हैं।

यह अनुभाग उन परिणामों के उदाहरण दिखाता है जिन्हें यहां वर्णित वीवो मल्टीकलर टाइम-लैप्स इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। हम बताते हैं कि विकासशील जेब्राफिश हिंदब्रेन14</su...

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Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

वीवो इमेजिंग में एक शक्तिशाली उपकरण है जिसका उपयोग तंत्रिका तंत्र के विकास में अंतर्निहित सेलुलर तंत्र की जांच करने के लिए किया जा सकता है। यहां हम विकासशील जेब्राफिश तंत्रिका तंत्र के भीतर वास्तविक समय में बड़ी संख्या में मल्टीकलर ब्रून-लेबल कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए समय-चूक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करते हैं।

ब्रूरेन और टाइम-लैप्स कॉन्फोकल इमेजिंग का उपयोग करके ज़ेब्राफिश में विकासशील मस्तिष्क की कल्पना करना

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

इस विधि तंत्रिका जनक कोशिकाओं की गतिशीलता और उनकी संतान जो कशेरुकी मस्तिष्क के विकास आबाद के बारे में बुनियादी सवालों के जवाब में मदद कर सकते हैं । इस तकनीक का मुख्य लाभ विकास के कई घंटों में जीवित मस्तिष्क के भीतर क्लोन रूप से संबंधित कोशिकाओं के कई समूहों को सीधे कल्पना करने की क्षमता है। प्रोटोकॉल भी ज़ेब्राफिश भ्रूण के अन्य विकासशील प्रणालियों में क्लोनल और जनक गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।इस विधि का उपयोग करके दृश्य तंत्रिका विकास के दौरान होने वाली मौलिक प्रक्रियाओं को सीधे देखने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। माइक्रो इंजेक्शन प्रदर्शन करने से पहले दोपहर को, सेक्स अलग संभोग टैंक में जंगली प्रकार वयस्क जेब्राफिश स्थापित करें। अगली सुबह पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार डीएनए समाधान तैयार करें और निषेचन के 45 मिनट के भीतर इस समाधान के लगभग 4.2 नैनो लीटर को एक सेल जेब्राफिश भ्रूण में इंजेक्ट करें।ई तीन माध्यम में इंजेक्शन भ्रूण और 24 घंटे के लिए एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर बनाए रखें, तो समूह से मृत और विकृत भ्रूण कहते हैं । एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में 20 स्वस्थ भ्रूण को स्थानांतरित करें, इसे ई तीन के 10 मिलीलीटर के साथ भरें और प्रत्येक ट्यूब के शीर्ष पर एक टोपी रखें। 80 से 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में 50 मिलीलीटर ट्यूबों के साथ एक रैक रखें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि स्नान में पानी का स्तर ट्यूब में ई तीन से अधिक है।पानी के स्नान से ट्यूब रैक निकालें और इसे 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। ई तीन को ठंडा करने के लिए एक घंटे तक की अनुमति दें और भ्रूण तापमान को फिर से तैयार करने के लिए। फिर उन्हें 0.2 मिलीमोलर पीटीयू और ई थ्री के साथ पेट्री व्यंजन में स्थानांतरित करें जो 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में गर्म रखा गया है।गर्मी के झटके के दो से चार घंटे बाद, सीएफपी या वाईएफपी की अभिव्यक्ति के लिए एक मानक फ्लोरेसेंस विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण की जांच करें जो सफल ब्रेनबो पुनर्संयोजन को इंगित करता है। भर में एक मजबूत FP अभिव्यक्ति के साथ भ्रूण का चयन करें और उन्हें पीटीयू के साथ एक अलग पकवान के लिए स्थानांतरित। निषेचन के बाद उन्हें एक, दो या तीन दिन छवि।अभिव्यक्ति जो फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के नीचे मंद दिखाई देती है, वास्तव में कॉन्फोकल टाइम-लैप्स इमेजिंग में अच्छी तरह से कल्पना की जा सकती है। प्रयोग के दिन से पहले, इमेजिंग चैंबर और भ्रूण हेरफेर उपकरण तैयार करें। इमेजिंग चैंबर तैयार करने के लिए, ध्यान से एक 60 मिलीमीटर पेट्री डिश के केंद्र में एक प्लास्टिक की अंगूठी superglue।चार इंच लकड़ी के झाड़ू छड़ी के अंत तक नायलॉन मछली पकड़ने की रेखा की एक छोटी लंबाई को सुपर चिपकाकर जोड़तोड़ का निर्माण करें। यदि आवश्यक हो, तो बढ़ते से पहले विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे भ्रूण को डिकोरीशन करें। भ्रूण माउंट करने के लिए, इमेजिंग कक्ष में प्लास्टिक की अंगूठी के केंद्र में मछली हस्तांतरण और एक ठीक इत्तला दे दी हस्तांतरण pipette के साथ संभव के रूप में ज्यादा अतिरिक्त ई तीन के रूप में हटा दें ।एक प्रतिशत कम पिघल agarose और ई तीन के साथ मछली को कवर करने के लिए एक साफ हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग करें, agarose की एक परत के साथ पूरे प्लास्टिक की अंगूठी भरने । फिर धीरे-धीरे भ्रूण को पिपेट टिप में खींचें और किसी भी हवा के बुलबुले को पेश किए बिना वापस एगर उठे। मछली को जल्दी से उन्मुख करने के लिए भ्रूण जोड़तोड़ का उपयोग करें और इससे पहले कि यह कठोर हो जाए।यदि एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग, भ्रूण को यथासंभव एगर उठी की ऊपरी सतह के करीब स्थिति में रखें, यह सुनिश्चित करें कि वे अपनी पूंछ के साथ इमेजिंग कक्ष के नीचे सीधे समानांतर हैं। एगरे के लिए प्रतीक्षा करें कठोर होने के लिए, फिर इमेजिंग कक्ष को ई थ्री के साथ भरें, इमेजिंग के दौरान वाष्पीकरण के लिए जितना संभव हो उतना जोड़ें। इमेजिंग चैंबर को फिश और ई थ्री के साथ कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर रखें।फिर एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर और एक लंबी काम करने की दूरी के साथ उद्देश्य का चयन करें। कोशिकाओं के उचित घने और उज्ज्वल लेबलिंग के साथ एक क्षेत्र का पता लगाएं और अधिग्रहण मापदंडों की स्थापना की । यह ज़ेन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक उदाहरण है, लेकिन उपलब्ध माइक्रोस्कोप और लेजर लाइनों के आधार पर सेटिंग्स भिन्न होंगी।प्रत्येक एफपी चैनल को क्रमिक रूप से छवि बनाने के लिए तीन ट्रैक तैयार करें। 514 नैनोमीटर पर 458 नैनोमीटर और वाईएफपी पर सीएफपी को उत्तेजित करने के लिए एक आर्गन लेजर का उपयोग करें, और डीटोमैटो को उत्तेजित करने के लिए डीपीएसएस 561 नैनोमीटर लेजर का उपयोग करें। उचित तरंगदैर्ध्य पर तीनों के लिए मिशन लीजिए।माइटोटिक और एपोटोटिक घटनाओं को ट्रैक करने के लिए छवि के लिए जेड स्टैक रेंज और 10 से 30 मिनट के बीच एक समय अंतराल का चयन करें। अंत में, इमेजिंग सत्र की लंबाई का चयन करें और प्रयोग चलाएं। इमेजिंग पूरी होने के बाद, सीजीआई प्रारूप में कच्चे डेटा को सहेजें यदि ज़ेन या फिजी के साथ संगत किसी अन्य प्रारूप का उपयोग करते हैं, तो जैव प्रारूप आयातक का उपयोग करके फिजी में छवियों को आयात करें।वीवो मल्टीकलर टाइम-लैप्स इमेजिंग में विकासशील जेब्राफिश हिंडब्रेन के प्रोलिफेरेटिव वेंट्रिकुलर जोन में कोशिकाओं के ब्रेनबो कलर कोडेड क्लोन दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक विशेष रेडियल फाइबर के साथ व्यवस्थित ब्रेनबो लेबल कोशिकाओं ने एक ही रंग साझा किया। जिसे रिश्तेदार आरजीबी चैनल वेट के रूप में निर्धारित किया जा सकता है।इससे पता चलता है कि ये रेडियो समूह कोशिकाओं को विभाजित करने के क्लोन थे और उनके समान रंग का उपयोग उन्हें क्लोनली रूप से संबंधित होने के रूप में पहचानने के लिए किया जा सकता है। एक मात्रात्मक रंग विश्लेषण से पता चला है कि बेटी कोशिकाओं को अपनी मां की कोशिका के रूप में एक ही रंग व्यक्त करते हैं । लेकिन कोशिकाओं के पड़ोसी रेडियो समूहों को एक दूसरे से अलग किया जा सकता है।संबंधित कोशिकाओं के कई क्लोन वीवो में घंटों से अधिक एक साथ पालन किए जा सकते हैं, जिससे मल्टीप्लेक्स वंश विश्लेषण और तुलना की अनुमति मिल सकती है। दो पर क्लोन में रंग अभिव्यक्ति की मात्रा और फिर तीन दिनों के बाद निषेचन से पता चला कि Brainbow अभिव्यक्ति दो से तीन दिनों से अपेक्षाकृत स्थिर रहे । समय चूक इमेजिंग कई कोशिकाओं को एक से दो दिनों के बाद निषेचन से इंटरकाइनेटिक परमाणु प्रवास और सेल विभाजन के दौर से गुजर पता चला, यह संभव सेल चक्र का अध्ययन करने के लिए बना रही है ।8.4 घंटे के औसत सेल चक्र की गणना की गई थी जो जेब्राफिश में पिछले मापों के बराबर है। इसके अलावा, इस इमेजिंग तकनीक का उपयोग एपोप्टोसिस से जुड़े टकसाली रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरने वाली व्यक्तिगत कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए किया गया था, जैसे झिल्ली ब्लबिंग और सेल विखंडन। चूंकि यह विधि वीवो में की जाती है, इसलिए ज़ेब्राफ़िश को इमेजिंग कक्ष से बचाया जा सकता है और बाद के समय बिंदुओं पर इमेजिंग या अन्य प्रयोगों के लिए बनाए रखा जा सकता है।इस तकनीक का उपयोग हमें तंत्रिका विकास के दौरान क्लोन रूप से संबंधित कोशिकाओं की भूमिकाओं के बारे में नए सवालों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Photoconversion के बाद प्रतिदीप्ति क्षय का प्रयोग लिविंग zebrafish भ्रूण में प्रोटीन स्थिरता मापने (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

समय चूक Brightfield Stereomicroscopy साथ zebrafish लार्वा में ऊतकों की मरम्मत पर कब्जा

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

लिविंग zebrafish भ्रूण में subcellular संरचनाओं इमेजिंग

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

GFP ट्रांसजेनिक Zebrafish Photoconvertible PSmOrange प्रणाली का प्रयोग में कोशिकाओं की ट्रैकिंग

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

विश्लेषण<em&gt; Vivo</em&gt; सेल प्रवास zebrafish भ्रूण में सेल प्रत्यारोपण और समय चूक इमेजिंग का उपयोग कर

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

समय चूक इमेजिंग एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग के साथ Zebrafish गुर्दे का विकास का विश्लेषण ऑप्टिकल सेक्शनिंग के लिए लैस

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

Interrenal Steroidogenic ऊतक और zebrafish में इसका संवहनी Microenvironment Visualizing

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

लाइव Arabidopsis फूल विकास की confocal इमेजिंग

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

रहने वाले मेंढक और ज़ेबराफिश भ्रूण में हाइपोक्सिया का प्रेरण

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

विकास में रीयल-टाइम कल्पना करने के लिए बहु फोटॉन समय चूक इमेजिंग: Zebrafish भ्रूण में न्यूरल क्रेस्ट कोशिकाओं पलायन का दृश्य

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...