Name: visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging
Uploaded: 2020-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging at JoVE.com

Ringraziamo Y. A. Pan, J. Livet e Tobias per il contributo tecnico e intellettuale. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (Award 1553764) e dal M.J. Murdock Charitable Trust.

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Lewis & Clark College.
1. Microiniezione di embrioni di pesce zebra
<ol><li>Impostare il tipo selvaggio, pesce zebra adulto in serbatoi di accoppiamento segregati dal sesso il pomeriggio prima di eseguire microiniezioni39,40.</li>
	<li>Preparare la soluzione del DNA la mattina delle microiniezioni. Diluire <...

Questo protocollo descrive un metodo per visualizzare i cloni delle cellule progenitrici e neuroni nel cervello posteriore del pesce zebra in via di sviluppo e seguirli in vivo utilizzando Brainbow e microscopia confocale time-lapse11. Il principale vantaggio di questo protocollo rispetto agli studi in vitro o ex vivo è la capacità di osservare direttamente la zona proliferale del cervello vertebrato nel suo ambiente naturale nel tempo. Questa tecnica si basa su studi precedenti che hanno etiche...

Nelle prime fasi di sviluppo, i pool di cellule progenitrici specializzate si dividono ripetutamente in zone proliferanti, producendo diverse matrici di cellule figlie. Le cellule nate durante questo periodo di sviluppo si differenziano e viaggiano per formare gli organi nascenti. Nel sistema nervoso, progenitori come la glia radiale danno origine a neuroni immaturi in zone ventricolari. Come i neuroni migrano lontano dai ventricoli e matura, il tessuto in espansione alla fine forma le strutture altamente complesse del cervello1,2,3,4,5,6. Il coordinamento tra la divisione dei progenitori e la differenziazione e la migrazione dei neuroni determinerà la dimensione, la forma e quindi la funzione del cervello, influenzando direttamente il comportamento7,8,9,10. Mentre uno stretto controllo su questi processi è chiaramente cruciale per il normale sviluppo del cervello, i meccanismi globali che regolano queste dinamiche non sono ben compresi. Qui descriviamo uno strumento per studiare lo sviluppo del sistema nervoso a una risoluzione cellulare, permettendo ai ricercatori di visualizzare le cellule progenitrici e neuroni in vivo nel cervello di pesce zebra in via sviluppo con Brainbow e monitorare il loro comportamento nel tempo attraverso la microscopia confocale time-lapse11. L'approccio può anche essere adattato per visualizzare altre parti dell'embrione in via di sviluppo.
Per osservare e distinguere tra le cellule nel cervello del pesce zebra in via di sviluppo, abbiamo adattato la tecnica di etichettatura delle cellule di Brainbow11. Brainbow utilizza l'espressione combinatoria determinata casualmente di tre distinte proteine fluorescenti (FP) per etichettare una popolazione di cellule. Mentre l'espressione predefinita per l'espressione Brainbow è il rosso FP dTomato, la ricombinazione da parte dell'enzima Cre ricombinasi risultati in espressione di mCerulean (proteina fluorescente ciana, CFP) o proteina fluorescente gialla (YFP)12,13. La quantità combinata di ogni FP espresso in una cella gli conferisce una tonalità unica, consentendo una chiara distinzione visiva dalle celle vicine. Inoltre, quando una cellula progenitrice si divide, ogni cellula figlia erediterà il colore dalla sua cellula madre, producendo cloni codificati a colori e permettendo ai ricercatori di tracciare il lignaggio cellulare11,14. Mentre originariamente utilizzato per analizzare i circuiti neuronali nei topi12, Brainbow è stato da allora espresso in una vasta gamma di organismi modello, tra cui il pesce zebra15.
La nostra tecnica si basa su precedenti metodi di etichettatura e imaging multicolore per creare direttamente più cloni codificati a colori nel tempo nel pesce zebra vivente. Grazie alla loro trasparenza ottica come embrioni, i pesci zebra sono adatti agli esperimenti di imaging16, e studi precedenti hanno utilizzato Brainbow nel pesce zebra per studiare una varietà di tessuti, tra cui il sistema nervoso11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. La capacità di immagine direttamente nell'organismo vivente, insieme al loro rapido sviluppo ex utero, rendono il pesce zebra un prezioso modello di sviluppo dei vertebrati. A differenza del cervello dei mammiferi, l'intera zona proliferare del cervello posteriore del pesce zebra è prontamente disponibile per l'imaging senza interruzioni al suo ambiente endogeno6. Ciò consente di condurre esperimenti nell'organismo vivente, piuttosto che in preparati in vitro o in tessuto fisso. A differenza degli esperimenti di imaging fissi, gli studi in vivo consentono una progettazione longitudinale, producendo ore di dati che possono essere analizzati per modelli, aumentando così la probabilità di osservare eventi relativamente rari. A seconda della velocità e della durata degli eventi di interesse, i ricercatori possono scegliere di eseguire brevi (1–2 h) o lunghi (fino a 16 h) esperimenti di imaging time-lapse. Utilizzando il promotore di scosse di calore di pesce zebra 70 (hsp70, hsp), espressione Brainbow può essere controllato temporalmente28,29. Inoltre, l'espressione mosaico indotta da questo promotore è adatta per etichettare e tracciare molti cloni11.
La capacità di identificare visivamente più cloni all'interno del cervello vivente è un vantaggio di questo metodo. Importanti studi precedenti che hanno studiato il ruolo dei cloni all'interno dello sviluppo del sistema nervoso utilizzavano vettori retrovirali per etichettare una singola cellula progenitrice e la sua progenie utilizzando un singolo FP o altra proteina facilmente visualizzabile. Tale etichettatura consente ai ricercatori di osservare un singolo clone nel tempo, sia in vitro che in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. In contrasto con i metodi per monitorare il comportamento delle cellule all'interno di un clone, i colori distinti di Brainbow consentono ai ricercatori di osservare la dinamica tra i cloni. Inoltre, utilizzando Brainbow per etichettare molti cloni all'interno del cervello, vengono raccolti dati aggiuntivi sul comportamento clonale rispetto alle tecniche che etichettano un singolo clone11. È importante sottolineare che gli approcci qui descritti possono essere ampliati per generare confronti di sviluppo tra pesci che hanno subito diverse manipolazioni genetiche o farmacologiche18. Nel complesso, questi vantaggi rendono l'imaging confocale in vivo in vivo del pesce zebra che esprime Barcobaleno ideale per i ricercatori che esplorano lo sviluppo del sistema nervoso dei vertebrati, in particolare quelli interessati al ruolo dei cloni.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>134020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06690</td>
			<td>Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 lb nylon fishing line</td>
			<td>SecureLine</td>
			<td>NMT250</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>867-WC NO GLUE</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0298M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>490016-616</td>
			<td>Used to store LMA at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence dissection scope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3158</td>
			<td>To maintain embryos at 28&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection plate molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2320</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0395</td>
			<td>For E3 and for DNA solution for injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E3120</td>
			<td>To create agarose injection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (LMA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks</td>
			<td>Aquaneering, Inc.</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9397</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4058-01</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (90 mm, 60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>To house embryos and create imaging chamber (60 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft stitch ring markers</td>
			<td>Clover Needlecraft, Inc.</td>
			<td>354</td>
			<td>For creating imaging chamber with Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue (Ultra gel control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>BD329412</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging

Lo sviluppo del sistema nervoso dei vertebrati richiede una coordinazione precisa dei comportamenti cellulari complessi e delle interazioni. L'uso di tecniche di imaging in vivo ad alta risoluzione può fornire una chiara finestra in questi processi nell'organismo vivente. Ad esempio, la divisione delle cellule e la loro progenie può essere seguita in tempo reale man mano che il sistema nervoso si forma. Negli ultimi anni, i progressi tecnici nelle tecniche multicolore hanno ampliato i tipi di domande che possono essere studiate. L'approccio multicolore Brainbow può essere utilizzato non solo per distinguere tra come le cellule, ma anche per codificare a colori più cloni diversi di cellule correlate che derivano ciascuna da una cellula progenitrice. Ciò consente un'analisi di lignaggio multiplex di molti cloni diversi e dei relativi comportamenti contemporaneamente durante lo sviluppo. Qui descriviamo una tecnica per l'utilizzo della microscopia confocale time-lapse per visualizzare un gran numero di cellule multicolore etichettate Brainbow in tempo reale all'interno del sistema nervoso del pesce zebra in via di sviluppo. Ciò è particolarmente utile per seguire le interazioni cellulari tra le cellule simili, che sono difficili da etichettare in modo differenziale utilizzando i colori tradizionali guidati dal promotore. Il nostro approccio può essere utilizzato per tracciare contemporaneamente le relazioni di lignaggio tra più cloni diversi. I grandi set di dati generati utilizzando questa tecnica forniscono informazioni dettagliate che possono essere confrontate quantitativamente tra manipolazioni genetiche o farmacologiche. In definitiva, i risultati generati possono aiutare a rispondere a domande sistematiche su come si sviluppa il sistema nervoso.

Questa sezione illustra esempi di risultati che possono essere ottenuti utilizzando l'approccio di imaging time-lapse multicolore in vivo descritto qui. Mostriamo che Brainbow cloni codificati a colori di cellule nella zona ventricolare proliferale del pesce zebra in via di sviluppo cervello posteriore14 (Figura 1).
In genere, quando le celle etichettate brainbow erano disposte lungo una particolare fibra radiale, condividevano lo stesso co...

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Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

L'imaging in vivo è un potente strumento che può essere utilizzato per studiare i meccanismi cellulari alla base dello sviluppo del sistema nervoso. Qui descriviamo una tecnica per l'utilizzo della microscopia confocale time-lapse per visualizzare un gran numero di cellule multicolore etichettate Brainbow in tempo reale all'interno del sistema nervoso del pesce zebra in via di sviluppo.

Visualizzare il cervello in via di sviluppo nel pesce zebra vivente utilizzando Brainbow e Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sulla dinamica delle cellule progenitrici neurali e sulla loro progenie che sono alla base dello sviluppo cerebrale dei vertebrati. Il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di visualizzare direttamente più ammassi di cellule correlate alla clonally all'interno del cervello vivente per molte ore di sviluppo. Il protocollo può anche essere applicato allo studio della dinamica clonale e progenitrice in altri sistemi in via di sviluppo dell'embrione zebrafish.La visualizzazione utilizzando questo metodo è particolarmente utile per osservare direttamente i processi fondamentali che si verificano durante lo sviluppo neurale. Il pomeriggio prima di eseguire micro iniezioni, impostare zebrafish adulti di tipo selvatico in vasche di accoppiamento segregate per il sesso. La mattina seguente preparare la soluzione di DNA secondo le indicazioni manoscritte e iniettare circa 4,2 nano litri di questa soluzione in embrioni di zebrafish a una cellula entro 45 minuti dalla fecondazione.Mantenere gli embrioni iniettati in E tre mezzi e un incubatore di 28 gradi Celsius per 24 ore, quindi chiamare gli embrioni morti e deformati dal gruppo. Trasferire fino a 20 embrioni sani in un tubo da 50 millilitri, riempirlo con 10 millilitri di E tre e posizionare un cappuccio sopra ogni tubo. Posizionare un rack con i tubi da 50 millilitri in posizione verticale in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per 80-90 minuti, assicurandosi che il livello dell'acqua nel bagno sia superiore ai tre E nel tubo.Rimuovere il portatubi dal bagno d'acqua e posizionarlo nell'incubatore di 28 gradi Celsius. Lasciare raffreddare fino a un'ora affinché l'E tre si raffredda e gli embrioni si riacclimatino alla temperatura. Quindi trasferirli a piastre di Petri con PTU da 0,2 millimolare ed E tre tenuti caldi nell'incubatore di 28 gradi Celsius.A due o quattro ore dopo lo shock termico, esaminare gli embrioni sotto un microscopio standard a dissezione a fluorescenza per l'espressione della PCP o dell'YFP che indica una ricombinazione riuscita di Brainbow. Seleziona embrioni con una robusta espressione FP e trasferiscili in un piatto separato con PTU. Immaginili uno, due o tre giorni dopo la fecondazione.L'espressione che appare fioca al microscopio a fluorescenza può effettivamente essere ben visualizzata nell'imaging confocale time-lapse. Prima del giorno dell'esperimento, preparare la camera di imaging e lo strumento di manipolazione degli embrioni. Per preparare la camera di imaging, sovraincollare con cura un anello di plastica al centro di una piastra di Petri di 60 millimetri.Costruisci il manipolatore incollando super una piccola lunghezza di lente di pesca in nylon fino alla fine di un bastone da tampone di legno da quattro pollici. Se necessario, dechorionare gli embrioni al microscopio a dissezione prima del montaggio. Per montare gli embrioni, trasferire il pesce al centro dell'anello di plastica nella camera di imaging e rimuovere il maggior numero possibile di E tre in eccesso con una pipetta di trasferimento a punta fine.Utilizzare una pipetta di trasferimento pulita per coprire il pesce con un agarosio a bassa fusione dell'uno per cento ed E tre, riempiendo l'intero anello di plastica con uno strato di agarosio. Quindi tirare delicatamente l'embrione nella punta della pipetta e tornare nell'agarosio senza introdurre bolle d'aria. Utilizzare un manipolatore di embrioni per orientare rapidamente il pesce e l'agarosio prima che si indurisca.Se si imaging con un microscopio verticale, posizionare l'embrione il più vicino possibile alla superficie superiore dell'agarosio, assicurandosi che siano paralleli al fondo della camera di imaging con la coda dritta. Attendere che l'agarosio si indurisca, quindi riempire la camera di imaging con E tre, aggiungendo il più possibile per tenere conto dell'evaporazione nel corso dell'imaging. Posizionare la camera di imaging con il pesce ed E tre al microscopio confocale.Quindi selezionare l'obiettivo con un'apertura numerica elevata e una lunga distanza di lavoro. Trovare un'area con un'etichettatura delle celle appropriatamente densa e luminosa e impostare i parametri di acquisizione. Questo è un esempio utilizzando il software Zen, ma le impostazioni varieranno a seconda del microscopio e delle linee laser disponibili.Prepara tre tracce per l'immagine sequenziale di ogni canale FP. Usa un laser argon per eccitare CFP a 458 nanometri e YFP a 514 nanometri e usa un laser DPSS da 561 nanometri per eccitare il dTomato. Raccogli le missioni per i tre alle lunghezze d'onda appropriate.Selezionare l'intervallo di stack Z da immagine a immagine e un intervallo di tempo compreso tra 10 e 30 minuti per tenere traccia degli eventi mitotici e apoptotici. Infine, selezionare la lunghezza della sessione di imaging ed eseguire l'esperimento. Al termine dell'imaging, salvare i dati grezzi in formato CZI se si utilizza Zen o un altro formato compatibile con Fiji, quindi importare le immagini nelle Fiji utilizzando l'importatore di formati bio.L'imaging time-lapse multicolore in vivo è stato utilizzato per mostrare cloni di cellule codificati a colori Brainbow nella zona ventricolare proliferativa del hindbrain zebrafish in via di sviluppo. Le cellule etichettate Brainbow disposte lungo una particolare fibra radiale condividevano lo stesso colore. Che può essere quantificato come i pesi relativi del canale RGB.Ciò suggerisce che questi gruppi radio erano cloni di cellule divisorie e che il loro colore simile poteva essere usato per identificarle come correlate alla clonally. Un'analisi quantitativa del colore ha mostrato che le cellule figlie esprimono lo stesso colore della cellula della madre. Ma che i vicini gruppi radio di cellule possono essere distinti l'uno dall'altro.Numerosi cloni di cellule correlate possono essere seguiti simultaneamente nel corso delle ore in vivo, consentendo un'analisi e un confronto del lignaggio multiplex. La quantificazione dell'espressione del colore nei cloni a due e poi di nuovo a tre giorni dopo la fecondazione ha mostrato che l'espressione di Brainbow è rimasta relativamente costante da due a tre giorni. L'imaging time-lapse ha rivelato numerose cellule sottoposte a migrazione nucleare intercinetica e divisione cellulare da uno a due giorni dopo la fecondazione, rendendo possibile lo studio del ciclo cellulare.È stato calcolato un ciclo cellulare medio di 8,4 ore che è paragonabile alle precedenti misurazioni nel pesce zebra. Inoltre, questa tecnica di imaging è stata utilizzata per osservare singole cellule sottoposte ai cambiamenti morfologici stereotipici associati all'apoptosi, come l'affglieramento della membrana e la frammentazione cellulare. Poiché questo metodo viene eseguito in vivo, il pesce zebra può essere salvato dalla camera di imaging e mantenuto per l'imaging o altri esperimenti in tempi successivi.L'uso di questa tecnica ci consente di esplorare nuove domande sui ruoli delle cellule correlate alla clonally durante lo sviluppo neurale.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

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Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

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