Name: visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging
Uploaded: 2020-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging at JoVE.com

技術的および知的な貢献に対して、Y.A.パン、J.リベット、Z.トビアスに感謝します。この作品は、国立科学財団(賞1553764)とM.J.マードック慈善信託によって支援されました。

動物の被験者を含む手続きは、ルイス&クラーク大学の制度的動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. ゼブラフィッシュ胚の微小注入
<ol><li>マイクロインジェクション39、40,40を行う前の午後、野生型、大人のゼブラフィッシュをセックス分離交配タンクに設置する。</li>
	<li>マイクロインジェクションの?...

本プロトコルは、開発中のゼブラフィッシュ後脳における前駆細胞およびニューロンのクローンを可視化し、Brainbowおよびタイムラプス共焦点顕微鏡11を用いて生体内でそれらに従う方法を説明する。インビトロまたはエキビボ研究と比較してこのプロトコルの主な利点は、時間の経過とともに脊椎動物の脳の増殖帯を直接観察する能力である。この技術は、レトロウイルス...

開発の初期段階では、特殊な前駆細胞のプールが増殖ゾーンで繰り返し分裂し、多様な娘細胞を産生する。この発達期に生まれた細胞は、分化し、新生器官を形成するために移動します。神経系では、放射状グリアなどの前駆物質は、心室領域の未熟なニューロンを生じさせる。ニューロンが心室から離れて成熟するにつれて、膨張する組織は最終的に脳11、2、3、4、5、62,3,4,5の非常に複雑な構造を6形成する。ニューロンの前駆体の分裂と分化と移動との間の調整は、脳の最終的な大きさ、形状、したがって機能を決定し、行動77、8、9、108,9,10に直接影響を与える。これらのプロセスを厳しく制御することは、正常な脳の発達にとって明らかに重要ですが、これらのダイナミクスを調節するグローバルメカニズムはよく理解されていません。ここでは、細胞分解能で神経系の発達を研究するツールを説明し、研究者はBrainbowで発達中のゼブラフィッシュ脳の生体内の前駆細胞およびニューロンを視覚化し、時間経過共焦点顕微鏡11を介して時間をかけてその行動を追跡することを可能にする。このアプローチは、発達中の胚の他の部分を視覚化するためにも適応することができる。
開発中のゼブラフィッシュ脳の細胞間を観察し、区別するために、我々はBrainbow細胞標識技術11を適応させました。Brainbowは、3つの異なる蛍光タンパク質(FP)の無作為に決定された組み合わせ発現を利用して、細胞の集団にラベルを付けます。Brainbow発現のデフォルトの発現は赤FPdTomatoであるが、酵素Creリコンビナーゼによる再結合は、mCerulean(シアン蛍光タンパク質、CFP)または黄色蛍光タンパク質(YFP)12,13,13の発現をもたらす。細胞内で表現される各FPの結合量は、それに固有の色合いを与え、隣接する細胞から明確な視覚的な区別を可能にする。さらに、前駆細胞が分裂すると、各娘細胞は母細胞から色を継承し、色分けされたクローンを産生し、研究者が細胞系11,14,14を追跡することを可能にする。もともとマウス12の神経回路を解析するために使用されるが、Brainbowは、ゼブラフィッシュ15を含む多種多様なモデル生物で発現されている。
私たちの技術は、生きているゼブラフィッシュで時間の経過とともに複数の色分けされたクローンを直接画像化するための以前の多色ラベリングとイメージング方法に基づいています。胚としての光学的透明性のために、ゼブラフィッシュはイメージング実験,16に適しており、以前の研究では、ゼブラフィッシュのBrainbowを利用して、,神経系11、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25を含む様々な組織18,19,20,2111,15,1723を24,25研究してきました22,。2626、27。,生物を直接画像化する能力は、彼らの急速な元子宮の開発と共に、ゼブラフィッシュを脊椎動物の発達の貴重なモデルにします。哺乳動物の脳とは対照的に、ゼブラフィッシュ後脳の増殖帯全体が、その内因性環境6に中断することなく画像化のために容易に利用できる。これにより、インビトロや固定組織製剤ではなく、生体内で実験を行うことができます。固定画像実験とは対照的に、in vivoの研究では縦方向の設計が可能になり、パターンについて分析できる時間のデータが生成され、比較的まれな事象を観察する可能性が高くなります。関心のある事象の速度と長さに応じて、研究者は短い(1-2時間)または長い(〜16時間まで)のタイムラプスイメージング実験を行うことを選択できます。ゼブラフィッシュヒートショックプロモーター70(hsp70,hsp)を用いることで、Brainbow発現を28,29,29に時間的に制御することができる。さらに、このプロモーターによって誘導されるモザイク表現は、多くのクローン11の標識および追跡に適している。
生きている脳内の複数のクローンを視覚的に識別する能力は、この方法の利点です。神経系の発達中のクローンの役割を調査した重要な以前の研究は、単一のFPまたは他の容易に視覚化されたタンパク質を使用して、単一の前駆細胞とその子孫を標識するためにレトロウイルスベクターを利用した。このようなラベリングは、インビトロまたはin vivo,,,,,,22、30、31、32、33、34、35、36、37、3830,31のいずれかで、時間をかけて単一のクローン3337を38観察することができます。323435361つのクローン内の細胞の挙動を追跡する方法とは対照的に、Brainbowの異なる色は、研究者がクローン間のダイナミクスを観察することを可能にする。さらに、Brainbowを使用して脳内の多くのクローンにラベルを付け、クローンの挙動に関する追加データが、単一クローン11にラベルを付ける技術に関連して収集される。重要なことに、ここで説明するアプローチは、異なる遺伝的または薬理学的操作を受けた魚間の発達的比較を生成するために拡大することができる18。全体的に見て、これらの利点は、脊椎動物神経系の発達を探求する研究者、特にクローンの役割に興味を持つ研究者にとって理想的なBrainbow発現ゼブラフィッシュのインビボ共焦点イメージングのタイムラプスを作る。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>134020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06690</td>
			<td>Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 lb nylon fishing line</td>
			<td>SecureLine</td>
			<td>NMT250</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>867-WC NO GLUE</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0298M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>490016-616</td>
			<td>Used to store LMA at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence dissection scope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3158</td>
			<td>To maintain embryos at 28&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection plate molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2320</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0395</td>
			<td>For E3 and for DNA solution for injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E3120</td>
			<td>To create agarose injection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (LMA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks</td>
			<td>Aquaneering, Inc.</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9397</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4058-01</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (90 mm, 60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>To house embryos and create imaging chamber (60 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft stitch ring markers</td>
			<td>Clover Needlecraft, Inc.</td>
			<td>354</td>
			<td>For creating imaging chamber with Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue (Ultra gel control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>BD329412</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging

脊椎動物神経系の発達には、複雑な細胞行動と相互作用の正確な調整が必要です。高分解能in vivoイメージング技術を用いることは、生物におけるこれらのプロセスに明確な窓を提供することができる。例えば、細胞とその子孫の分裂は、神経系が形成するにつれてリアルタイムで追跡することができる。近年、多色技術の技術の進歩は、調査できる質問の種類を拡大しています。多色Brainbowアプローチは、細胞の間で区別するだけでなく、それぞれが1つの前駆細胞から派生する関連する細胞の複数の異なるクローンを色分けするためにも使用できます。これにより、開発中に多くの異なるクローンとその動作を同時に多重系統解析できます。ここでは、開発中のゼブラフィッシュ神経系の中で、多色Brainbow標識細胞をリアルタイムで可視化するために、タイムラプス共焦点顕微鏡を使用する技術について説明します。これは、従来のプロモーター駆動色を使用して差し分化ラベルを付け難い細胞間の細胞相互作用に従う場合に特に有用である。このアプローチは、複数の異なるクローン間の系統関係を同時に追跡するために使用できます。この手法を使用して生成される大規模なデータセットは、遺伝的または薬理学的操作全体で定量的に比較できる豊富な情報を提供します。最終的に生成された結果は、神経系がどのように発達するかについての体系的な質問に答えるのに役立ちます。

このセクションは、ここで説明するin vivo多色タイムラプス撮像アプローチを用いて得ることができる結果の例を示す。我々は、開発中のゼブラフィッシュ後脳14の増殖性心室領域における細胞のBrainbow色分けクローンを示す(図1)。
通常、Brainbow標識された細胞が特定の放射状繊維に沿って配置されたとき、それらは同じ色(<strong clas...

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Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

インビボイメージングは、神経系の発達の根底にある細胞メカニズムを調査するために使用できる強力なツールです。ここでは、開発中のゼブラフィッシュ神経系の中で、多色Brainbow標識細胞をリアルタイムに可視化するために、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いる手法について説明する。

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

この方法は、神経前駆細胞のダイナミクスと脊椎動物の脳の発達の根幹となる子孫に関する基本的な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、開発の多くの時間にわたって生きている脳内のクローン関連細胞の複数のクラスターを直接視覚化する能力です。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の他の発達系におけるクローンおよび前駆体ダイナミクスの研究にも適用することができる。この方法を用いた可視化は、神経発達中に起こる基本的なプロセスを直接観察するのに特に有用である。マイクロ注射を行う前の午後に、セックス分離交配タンクに野生型成虫ゼブラフィッシュを設置する。翌朝、原稿の指示に従ってDNA溶液を調製し、受精後45分以内にこの溶液の約4.2ナノリットルを1つの細胞ゼブラフィッシュ胚に注入する。注入された胚をE 3培地と28°Cのインキュベーターで24時間維持し、グループから死んだ胚と変形した胚を呼び出す。50ミリリットルのチューブに最大20個の健康な胚を移し、10ミリリットルのE 3で満たし、各チューブの上にキャップを置きます。50ミリリットルのチューブを37°Cのウォーターバスに80〜90分間直立させ、お風呂の水位がチューブ内のE 3よりも高いことを確認します。水浴からチューブラックを取り外し、摂氏28度のインキュベーターに入れます。E 3が冷却し、胚が温度に再水応するのに最大1時間かかります。その後、0.2ミリモルPTUとE 3摂氏28度のインキュベーターで暖かく保たれたペトリ料理にそれらを転送します。ヒートショックの2~4時間後に、標準的な蛍光解剖顕微鏡で、ビエンボン組換えの成功を示すCFPまたはYFPの発現について胚を調べる。全体に堅牢なFP発現を持つ胚を選択し、PTUと別の皿に転送します。受精後1、2、または3日を画像化します。蛍光顕微鏡下で薄暗く見える発現は、実際には共焦点タイムラプスイメージングでよく視覚化され得る。実験の日に先立って、イメージングチャンバーと胚操作ツールを準備します。イメージングチャンバーを準備するには、プラスチックリングを60ミリメートルのペトリ皿の中央に慎重にスーパーグルーします。4インチの木製綿棒の端にナイロン釣り糸の小さな長さを接着することによってマニピュレータを構築します。必要に応じて、取り付け前に解剖顕微鏡の下で胚をデコール化する。胚を取り付けるには、魚を画像チャンバーのプラスチックリングの中心に移し、細かいチップトランスファーピペットでできるだけ多くの余分なE3を取り除きます。きれいな移管ピペットを使用して、1%の低溶融アガロースとE 3で魚を覆い、プラスチックリング全体をアガロースの層で満たします。その後、気泡を導入することなく、ピペット先端にゆっくりと胚を引き上げ、アガロースに戻します。胚マニピュレータを使用して、魚とアガロースを硬化させる前に素早く向けます。直立顕微鏡でイメージングする場合は、胚をアガロースの上面にできるだけ近くに置き、尾をまっすぐにしてイメージングチャンバーの底に平行であることを確認します。アガロースが硬化するのを待ってから、イメージングチャンバーをE 3で満たし、イメージングの過程で蒸発を考慮して可能な限り追加します。共焦点顕微鏡の上に魚とE 3とイメージングチャンバーを置きます。次に、高い数値開口と長い作業距離で目的を選択します。セルの適切な緻密で明るいラベリングを持つ領域を見つけ、取得パラメータを設定します。これはZenソフトウェアを使用した例ですが、設定は利用可能な顕微鏡やレーザーラインによって異なります。各 FP チャネルを順番にイメージ化する 3 つのトラックを準備します。アルゴンレーザーを使用してCFPを458ナノメートル、YFPを514ナノメートルで励起し、DPSS 561ナノメートルレーザーを使用してdTomatoを励起します。適切な波長で3つのミッションを収集します。画像に Z スタック範囲を選択し、10 ~ 30 分の時間間隔を選択して、ミトティック イベントとアポトーシス イベントを追跡します。最後に、イメージングセッションの長さを選択し、実験を実行します。イメージングが完了したら、Zenまたはフィジーと互換性のある別のフォーマットを使用している場合は、生データをCZI形式で保存し、バイオフォーマットの輸入者を使用してフィジーに画像をインポートします。インビボ多色タイムラプスイメージングは、開発中のゼブラフィッシュ後脳の増殖性心室領域における細胞のBrainbow色分けクローンを示すために使用された。特定の放射状繊維に沿って配置されたBrainbowラベル細胞は同じ色を共有した。これは、相対的なRGBチャネルの重みとして定量化することができます。これは、これらのラジオグループが分裂細胞のクローンであり、類似した色を使用してクローン的に関連していると識別できることを示唆している。定量的な色分析は、娘細胞が母親の細胞と同じ色を表すことを示した。しかし、その隣接する細胞の無線クラスターは互いに区別することができます。関連細胞の多数のクローンは、生体内での時間にわたって同時に追跡することができ、多重系統分析および比較を可能にする。2時にクローンにおける色発現を定量化し、受精後3日で再びBrainbow発現が2~3日で比較的一定であることを示した。タイムラプスイメージングは、受精後1〜2日の間に核間移動と細胞分裂を受けている多数の細胞を明らかにし、細胞周期を研究することを可能にした。ゼブラフィッシュの以前の測定値に匹敵する8.4時間の平均細胞周期を計算した。さらに、このイメージング技術は、膜のブレンディングや細胞断片化などのアポトーシスに関連するステレオタイプ形態変化を受けている個々の細胞を観察するために使用した。この方法は生体内で行われるため、ゼブラフィッシュを撮像チャンバーから救出し、後の時点でイメージングや他の実験のために維持することができます。この技術を用い、神経発達中のクローン関連細胞の役割に関する新たな疑問を探究することができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

解剖顕微鏡を使用したタイムラプスイメージングとゼブラフィッシュ腎臓の開発の分析は、光学切片のための装備します

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

腎間のステロイド合成組織とゼブラフィッシュにおけるその血管微小環境の可視化

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...