Name: visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging
Uploaded: 2020-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging at JoVE.com

Vi takker Y. A. Pan, J. Livet og Z. Tobias for tekniske og intellektuelle bidrag. Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (Award 1553764) og M.J. Murdock Charitable Trust.

Prosedyrer som involverer dyreforsøk er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Lewis & Clark College.
1. Mikroinjeksjon av sebrafiskembryoer
<ol><li>Sett opp vill type, voksen sebrafisk i sex-segregerte parring tanker ettermiddagen før du utfører mikroinjeksjoner39,40.</li>
	<li>Forbered DNA-løsningen om morgenen av mikroinjeksjonene. Fortynn hsp:Zebrabow11 plasmid DNA...

Denne protokollen beskriver en metode for å visualisere kloner av stamceller og nevroner i den utviklende sebrafisk hindbrain og følge dem in vivo ved hjelp av Brainbow og time-lapse confocal mikroskopi11. Den store fordelen med denne protokollen i forhold til in vitro eller ex vivo studier er evnen til å direkte observere den proliferative sonen av virveldyr hjernen i sitt naturlige miljø over tid. Denne teknikken bygger på tidligere studier som merket en enkelt klone ved hjelp av retroviral...

I de tidlige fasene av utviklingen deler bassenger av spesialiserte stamceller gjentatte ganger i proliferative soner, og produserer ulike arrayer av datterceller. Cellene som er født i denne utviklingsperioden vil da differensiere og reise for å danne de gryende organene. I nervesystemet gir stamfarer som radial glia opphav til umodne nevroner i ventrikulære soner. Som nevroner migrere bort fra ventrikler og modne, danner det ekspanderende vevet til slutt de svært komplekse strukturene i hjernen1,2,3,4,5,6. Koordineringen mellom deling av stamfarer og differensiering og migrasjon av nevroner vil bestemme den endelige størrelsen, formen og dermed funksjonen til hjernen, direkte påvirker atferd7,,8,9,10. Selv om tett kontroll over disse prosessene er klart avgjørende for normal hjerneutvikling, er de globale mekanismene som regulerer disse dynamikkene ikke godt forstått. Her beskriver vi et verktøy for å studere utvikling av nervesystemet ved en cellulær oppløsning, slik at forskere kan visualisere stamceller og nevroner in vivo i den utviklende sebrafiskhjernen med Brainbow og spore deres oppførsel over tid via tid-bortfall konfokal mikroskopi11. Tilnærmingen kan også tilpasses for å visualisere andre deler av det utviklende embryoet.
For å observere og skille mellom celler i den utviklende sebrafiskhjernen, har vi tilpasset Brainbow cellemerkingsteknikk11. Brainbow benytter det tilfeldig bestemte, kombinatoriske uttrykket av tre forskjellige fluorescerende proteiner (FPs) for å merke en populasjon av celler. Mens standarduttrykket for Brainbow-uttrykk er det røde FP dTomato, resulterer rekombinasjon av enzymet Cre rekombinase i uttrykk for mCerulean (cyan fluorescerende protein, CFP) eller gult fluorescerende protein (YFP)12,13. Den kombinerte mengden av hver FP uttrykt i en celle gir den en unik nyanse, slik at klart visuelt skille fra nærliggende celler. I tillegg, når en stamcelle deler seg, vil hver dattercelle arve fargen fra sin morcelle, produsere fargekodede kloner og tillate forskere å spore celleavstamning11,14. Mens den opprinnelig ble brukt til å analysere nevronale kretser i mus12,har Brainbow siden blitt uttrykt i et bredt spekter av modellorganismer, inkludert sebrafisk15.
Vår teknikk bygger på tidligere flerfarget merking og bildemetoder for å direkte bilde flere fargekodede kloner over tid i levende sebrafisk. På grunn av deres optiske gjennomsiktighet som embryoer, er sebrafisk godt egnet til bildeeksperimenter16, og tidligere studier har benyttet Brainbow i sebrafisk for å studere en rekke vev, inkludert nervesystemet11,,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Evnen til å direkte bilde inn i den levende organismen, sammen med deres raske ex utero utvikling, gjør sebrafisk til en verdifull modell for virveldyrutvikling. I motsetning til den pattedyrhjernen er hele proliferativ sone av sebrafisk hindbrain lett tilgjengelig for avbildning uten avbrudd i sitt endogene miljø6. Dette gjør det mulig å gjennomføre eksperimenter i den levende organismen, i stedet for in vitro eller faste vevspreparater. I motsetning til faste bildeeksperimenter tillater in vivo-studier en langsgående design, som produserer timer med data som kan analyseres for mønstre, og dermed øke sannsynligheten for å observere relativt sjeldne hendelser. Avhengig av hastigheten og lengden på hendelsene av interesse, forskere kan velge å utføre korte (1-2 t) eller lange (opp til ~ 16 h) time-lapse bildeforsøk. Ved å bruke sebrafisk varme sjokk promotoren 70 (hsp70, hsp), Brainbow uttrykk kan være tempolysk kontrollert28,29. I tillegg er mosaikkuttrykket indusert av denne arrangøren godt egnet for merking og sporing av mange kloner11.
Evnen til visuelt å identifisere flere kloner i den levende hjernen er en fordel med denne metoden. Viktige tidligere studier som undersøkte klonenes rolle i utviklingen av nervesystemet, benyttet retrovirale vektorer til å merke en enkelt stamcelle og dens avkom ved hjelp av en enkelt FP eller annet lett visualisert protein. Slik merking gjør det mulig for forskere å observere en enkelt klone over tid, enten in vitro eller in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. I motsetning til metoder for å spore oppførselen til celler i en klone, de distinkte fargene i Brainbow tillate forskere å observere dynamikk blant kloner. I tillegg, ved å bruke Brainbow til å merke mange kloner i hjernen, samles ytterligere data om klonal atferd i forhold til teknikker som merker en enkelt klone11. Viktigere, tilnærmingene beskrevet her kan utvides til å generere utviklingssammenligninger mellom fisk som har gjennomgått forskjellige genetiske eller farmakologiske manipulasjoner18. Samlet sett gjør disse fordelene time-lapse in vivo confocal imaging av Brainbow-uttrykkende sebrafisk ideell for forskere som utforsker utviklingen av virveldyrnervesystemet, spesielt de som er interessert i kloners rolle.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>134020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06690</td>
			<td>Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 lb nylon fishing line</td>
			<td>SecureLine</td>
			<td>NMT250</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>867-WC NO GLUE</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0298M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>490016-616</td>
			<td>Used to store LMA at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence dissection scope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3158</td>
			<td>To maintain embryos at 28&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection plate molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2320</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0395</td>
			<td>For E3 and for DNA solution for injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E3120</td>
			<td>To create agarose injection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (LMA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks</td>
			<td>Aquaneering, Inc.</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9397</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4058-01</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (90 mm, 60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>To house embryos and create imaging chamber (60 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft stitch ring markers</td>
			<td>Clover Needlecraft, Inc.</td>
			<td>354</td>
			<td>For creating imaging chamber with Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue (Ultra gel control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>BD329412</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging

Utvikling av virveldyrnervesystemet krever en presis koordinering av kompleks cellulær atferd og interaksjoner. Bruken av høyoppløselige in vivo bildeteknikker kan gi et klart vindu inn i disse prosessene i den levende organismen. For eksempel kan deling av celler og deres avkom følges i sanntid som nervesystemet dannes. I de senere årene har tekniske fremskritt i flerfarget teknikker utvidet hvilke typer spørsmål som kan undersøkes. Den flerfargede Brainbow-tilnærmingen kan brukes til ikke bare å skille mellom like celler, men også til fargekode flere forskjellige kloner av relaterte celler som hver kommer fra en stamcelle. Dette gir mulighet for en multipleks avstamning analyse av mange forskjellige kloner og deres atferd samtidig under utviklingen. Her beskriver vi en teknikk for bruk av tidsforløp konfokal mikroskopi for å visualisere et stort antall flerfarget Brainbow-merkede celler over sanntid i det utviklende sebrafisknervesystemet. Dette er spesielt nyttig for å følge cellulære interaksjoner mellom som celler, som er vanskelig å merke differensialt ved hjelp av tradisjonelle promotordrevne farger. Vår tilnærming kan brukes til å spore avstamningrelasjoner mellom flere forskjellige kloner samtidig. De store datasettene som genereres ved hjelp av denne teknikken, gir rik informasjon som kan sammenlignes kvantitativt på tvers av genetiske eller farmakologiske manipulasjoner. Til syvende og sist kan resultatene som genereres bidra til å svare på systematiske spørsmål om hvordan nervesystemet utvikler seg.

Denne delen illustrerer eksempler på resultater som kan oppnås ved hjelp av in vivo multicolor time-lapse imaging tilnærming beskrevet her. Vi viser at Brainbow fargekodede kloner av celler i den proliferative ventrikulære sonen av den utviklende sebrafisk hindbrain14 (Figur 1).
Vanligvis, når Brainbow-merkede celler ble arrangert langs en bestemt radial fiber, delte de samme farge (Figur 1D), som kan kvan...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging at JoVE.com

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

In vivo imaging er et kraftig verktøy som kan brukes til å undersøke cellulære mekanismer underliggende nervesystemet utvikling. Her beskriver vi en teknikk for bruk av tidsforløp konfokal mikroskopi for å visualisere et stort antall flerfarget Brainbow-merkede celler i sanntid i det utviklende sebrafisknervesystemet.

Visualisere den utviklende hjernen i levende sebrafisk ved hjelp av Brainbow og Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Denne metoden kan bidra til å svare på grunnleggende spørsmål om dynamikken i nevrale stamceller og deres avkom som ligger til grunn for virveldyr hjerneutvikling. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til å visualisere flere klynger av klonalt relaterte celler i den levende hjernen over mange timers utvikling. Protokollen kan også brukes til å studere kloniske og stamfar dynamikk i andre utviklende systemer av sebrafisk embryo.Visualisering ved hjelp av denne metoden er spesielt nyttig for direkte å observere grunnleggende prosesser som oppstår under neural utvikling. På ettermiddagen før du utfører mikroinjeksjoner, sette opp vill type voksen sebrafisk i sex segregerte parring tanker. Neste morgen forberede DNA-løsningen i henhold til manuskriptretninger og injisere ca 4,2 nano liter av denne løsningen i en celle sebrafisk embryoer innen 45 minutter etter befruktning.Opprettholde injisert embryoer i E tre medium og en 28 grader Celsius inkubator i 24 timer, deretter ringe de døde og deformerte embryoer fra gruppen. Overfør opptil 20 friske embryoer til et 50 milliliter rør, fyll det med 10 milliliter E tre og plasser en hette på toppen av hvert rør. Plasser et stativ med de 50 milliliter rørene oppreist i et 37 grader Celsius vannbad i 80 til 90 minutter, og sørg for at vannstanden i badekaret er høyere enn E tre i røret.Fjern rørstativet fra vannbadet og plasser det i 28 grader Celsius inkubator. La opptil en time for E tre avkjøles og embryoene å reacclimate til temperaturen. Deretter overføre dem til Petri retter med 0,2 millimolar PTU og E tre holdt varm i 28 grader Celsius inkubator.Ved to til fire timer etter varmesjokket, undersøke embryoene under en standard fluorescens disseksjon mikroskop for uttrykk for CFP eller YFP som indikerer vellykket Brainbow rekombinasjon. Velg embryoer med et robust FP-uttrykk gjennom og overfør dem til en egen tallerken med PTU. Bilde dem en, to eller tre dager etter befruktning.Uttrykk som vises svakt under et fluorescensmikroskop kan faktisk være godt visualisert i konfokal tidsforløp. Før dagen for eksperimentet, forberede bildekammeret og embryo manipulasjon verktøy. For å forberede bildekammeret, legg forsiktig en plastring til midten av en 60 millimeter petriskål.Konstruer manipulatoren ved å lime en liten lengde av nylon fiskesnøre til slutten av en fire tommers tre vattpinne. Om nødvendig dechorionate embryoene under et disseksjonsmikroskop før montering. For å montere embryoene, overfør fisken til midten av plastringen i bildekammeret og fjern så mye overflødig E tre som mulig med en fin tippet overføringpipette.Bruk en ren overføring pipette for å dekke fisken med en prosent lav smelte agarose og E tre, fylle hele plastringen med et lag av agarose. Trekk deretter embryoet forsiktig opp i pipettespissen og tilbake i agarose uten å introdusere noen luftbobler. Bruk en embryomanipulator til raskt å orientere fisken og agarose før den stivner.Hvis avbildning med et oppreist mikroskop, plasser embryoet så nær den øvre overflaten av agarose som mulig, og sørg for at de er parallelle til bunnen av bildekammeret med halen rett. Vent til agarose å herde, deretter fylle bildekammeret med E tre, og legge så mye som mulig for å ta hensyn til fordampning i løpet av bildet. Plasser bildekammeret med fisken og E tre på det kondikale mikroskopet.Velg deretter målet med en høy numerisk blenderåpning og lang arbeidsavstand. Finn et område med riktig tett og lys merking av celler og sett opp anskaffelsesparameterne. Dette er et eksempel ved hjelp av Zen-programvare, men innstillingene vil variere avhengig av mikroskop og laserlinjer tilgjengelig.Klargjør tre spor for å bilde hver FP-kanal sekvensielt. Bruk en argonlaser til å opphisse CFP ved 458 nanometer og YFP ved 514 nanometer, og bruk en DPSS 561 nanometer laser for å opphisse dTomato. Samle oppdragene for de tre på passende bølgelengder.Velg Z-stakkområdet til bildet og et tidsintervall mellom 10 og 30 minutter for å spore mitotiske og apoptotiske hendelser. Til slutt velger du lengden bildeøkten og kjører eksperimentet. Når bildet er fullført, lagrer du rådataene i CZI-format hvis du bruker Zen eller et annet format som er kompatibelt med Fiji, og deretter importerer du bildene til Fiji ved hjelp av bioformatimportøren.In vivo flerfarget time-lapse imaging ble brukt til å vise Brainbow fargekodede kloner av celler i proliferativ ventrikkel sone av den utviklende sebrafisk hindbrain. Brainbow merkede celler arrangert langs en bestemt radial fiber delte samme farge. Som kan kvantifiseres som de relative RGB-kanalvektene.Dette tyder på at disse radiogruppene var kloner av å dele celler og at deres lignende farge kunne brukes til å identifisere dem som klonalt relatert. En kvantitativ fargeanalyse viste at datterceller uttrykker samme farge som morens celle. Men at nærliggende radioklynger av celler kan skilles fra hverandre.Tallrike kloner av relaterte celler kan følges samtidig over timer in vivo, noe som åpner for en multipleks avstamning analyse og sammenligning. Kvantifisering av fargeuttrykk i kloner på to og deretter igjen på tre dager etter befruktning viste at Brainbow uttrykk forble relativt konstant fra to til tre dager. Time-lapse imaging avslørte mange celler som gjennomgikk interkinetisk kjernefysisk migrasjon og celledeling fra en til to dager etter befruktning, noe som gjør det mulig å studere cellesyklusen.En gjennomsnittlig cellesyklus på 8,4 timer ble beregnet som kan sammenlignes med tidligere målinger i sebrafisk. Videre ble denne bildeteknikken brukt til å observere individuelle celler som gjennomgår de stereotypiske morfologiske endringene forbundet med apoptose, som membranblebbing og cellefragmentering. Fordi denne metoden utføres in vivo, kan sebrafisk reddes fra bildekammeret og vedlikeholdes for bildebehandling eller andre eksperimenter på senere tidspunkter.Bruken av denne teknikken gjør det mulig for oss å utforske nye spørsmål om rollene til klonalt relaterte celler under nevrale utvikling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Måling Protein Stabilitet på Living Sebrafisk embryo med fluoresens Decay Etter Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Fange Tissue Repair i Sebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikros

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulære strukturer i Living Sebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Sporing celler i GFP-transgene Sebrafisk Bruke Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; I Vivo</em&gt; Cell Migration bruker Cell transplantasjoner og Time-lapse Imaging in Sebrafisk embryo

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse av Sebrafisk Nyre Development med Time-lapse Imaging Ved hjelp av en dissekere mikroskop Utstyrt for Optical Seksjonering

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

Visualisere Interrenal Steroidogenic Tissue og dens Vaskulær mikromiljøet i Sebrafisk

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Lev Confocal Imaging av Developing Arabidopsis blomster

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induksjon av hypoksi i levende frosk og sebrafiskembryoer

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Flere Foton tid forfalle Imaging se utvikling i sanntid: visualisering av migrere Neural Crest celler i sebrafisk embryo

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...