Name: visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging
Uploaded: 2020-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging at JoVE.com

Agradecemos a Y. A. Pan, J. Livet e Z. Tobias por contribuições técnicas e intelectuais. Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (Prêmio 1553764) e pelo M.J. Murdock Charitable Trust.

Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade Lewis & Clark.
1. Microinjeção de Embriões de Zebrafish
<ol><li>Configurar tipo selvagem, zebrafish adulto em tanques de acasalamento segregados por sexo na tarde anterior à realização de microinjeções39,40.</li>
	<li>Prepare a solução de DNA na manhã das microinjeções. Diluir hsp:Zebr...

Este protocolo descreve um método para visualizar clones de células progenitoras e neurônios no cérebro-zebrafish em desenvolvimento e segui-los in vivo usando Brainbow e microscopia confocal de lapso de tempo11. A principal vantagem deste protocolo em comparação com estudos in vitro ou ex vivo é a capacidade de observar diretamente a zona proliferativa do cérebro vertebrado em seu meio natural ao longo do tempo. Esta técnica baseia-se em estudos anteriores que rotularam um único clone u...

Nas fases iniciais do desenvolvimento, grupos de células progenitoras especializadas se dividem repetidamente em zonas proliferativas, produzindo diversos conjuntos de células filhas. As células nascidas durante esse período de desenvolvimento se diferenciarão e viajarão para formar os órgãos nascentes. No sistema nervoso, progenitores como glia radial dão origem a neurônios imaturos em zonas ventriculares. À medida que os neurônios migram para longe dos ventrículos e amadurecem, o tecido em expansão eventualmente forma as estruturas altamente complexas do cérebro11,2,,3,4,5,6. A coordenação entre divisão de progenitores e diferenciação e migração de neurônios determinará o tamanho, a forma e, portanto, a função do cérebro, impactando diretamente o comportamento7,,8,,9,,10. Embora o controle rigoroso sobre esses processos seja claramente crucial para o desenvolvimento normal do cérebro, os mecanismos globais que regulam essas dinâmicas não são bem compreendidos. Aqui descrevemos uma ferramenta para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso em uma resolução celular, permitindo que os pesquisadores visualizem células progenitoras e neurônios in vivo no cérebro de zebrafish em desenvolvimento com Brainbow e acompanhem seu comportamento ao longo do tempo através da microscopia confocal de lapso de tempo11. A abordagem também pode ser adaptada para visualizar outras partes do embrião em desenvolvimento.
Para observar e distinguir entre as células no cérebro de zebrafish em desenvolvimento, adaptamos a técnica de rotulagem celular Brainbow11. Brainbow utiliza a expressão combinada e determinada aleatoriamente de três proteínas fluorescentes distintas (FPs) para rotular uma população de células. Enquanto a expressão padrão para expressão Brainbow é o fp dTomato vermelho, a recombinação pela enzima Cre recombinase resulta na expressão de mCerulean (proteína fluorescente de ciano, CFP) ou proteína fluorescente amarela (YFP)12,13. A quantidade combinada de cada FP expressa em uma célula lhe dá uma tonalidade única, permitindo uma clara distinção visual das células vizinhas. Além disso, quando uma célula progenitora se divide, cada célula filha herdará a cor de sua célula mãe, produzindo clones codificados por cores e permitindo que os pesquisadores rastreiem a linhagem celular11,14. Embora originalmente usado para analisar circuitos neuronais em camundongos12, Brainbow tem sido expresso em uma grande variedade de organismos modelo, incluindo zebrafish15.
Nossa técnica se baseia em métodos anteriores de rotulagem e imagem multicoloridas para visualizar diretamente vários clones codificados por cores ao longo do tempo em zebrafish vivos. Devido à sua transparência óptica como embriões, os zebrafish são adequados para experimentos de imagem16, e estudos anteriores têm utilizado brainbow em zebrafish para estudar uma variedade de tecidos, incluindo o sistema nervoso11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. A capacidade de imaginar diretamente o organismo vivo, juntamente com seu rápido desenvolvimento ex-utero, fazem do zebrafish um modelo valioso de desenvolvimento de vertebrados. Em contraste com o cérebro mamífero, toda a zona proliferativa do cérebro-zebrafish está prontamente disponível para imagens sem interrupção em seu ambiente endógeno6. Isso permite que experimentos sejam realizados no organismo vivo, em vez de preparações de tecidos in vitro ou fixos. Em contraste com os experimentos de imagem fixa, estudos in vivo permitem um desenho longitudinal, produzindo horas de dados que podem ser analisados para padrões, aumentando assim a probabilidade de observação de eventos relativamente raros. Dependendo da velocidade e duração dos eventos de interesse, os pesquisadores podem optar por realizar experimentos de imagem curtos (1-2 h) ou longos (até ~16 h). Usando o promotor de choque térmico de zebrafish 70 (hsp70, hsp), a expressão brainbow pode ser controlada temporalmente28,29. Além disso, a expressão de mosaico induzida por este promotor é adequada para rotular e rastrear muitos clones11.
A capacidade de identificar visualmente múltiplos clones dentro do cérebro vivo é uma vantagem deste método. Importantes estudos anteriores que investigaram o papel dos clones no desenvolvimento do sistema nervoso utilizaram vetores retrovirais para rotular uma única célula progenitora e sua descendência usando um único FP ou outra proteína prontamente visualizada. Essa rotulagem permite que os pesquisadores observem um único clone ao longo do tempo, seja in vitro ou in vivo2,,30,,31,,32,,33,,34,,35,,36,,37,,38. Em contraste com os métodos para rastrear o comportamento das células dentro de um clone, as cores distintas do Brainbow permitem que os pesquisadores observem a dinâmica entre os clones. Além disso, usando o Brainbow para rotular muitos clones dentro do cérebro, dados adicionais sobre o comportamento clonal são coletados em relação às técnicas que rotulam um único clone11. É importante ressaltar que as abordagens aqui descritas podem ser ampliadas para gerar comparações de desenvolvimento entre peixes submetidos a diferentes manipulações genéticas ou farmacológicas18. No geral, essas vantagens tornam o lapso de tempo em imagens confocais de zebrafish expressos em Brainbow ideais para pesquisadores que exploram o desenvolvimento do sistema nervoso vertebrado, particularmente aqueles interessados no papel dos clones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>134020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06690</td>
			<td>Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 lb nylon fishing line</td>
			<td>SecureLine</td>
			<td>NMT250</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>867-WC NO GLUE</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0298M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>490016-616</td>
			<td>Used to store LMA at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence dissection scope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3158</td>
			<td>To maintain embryos at 28&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection plate molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2320</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0395</td>
			<td>For E3 and for DNA solution for injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E3120</td>
			<td>To create agarose injection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (LMA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks</td>
			<td>Aquaneering, Inc.</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9397</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4058-01</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (90 mm, 60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>To house embryos and create imaging chamber (60 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft stitch ring markers</td>
			<td>Clover Needlecraft, Inc.</td>
			<td>354</td>
			<td>For creating imaging chamber with Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue (Ultra gel control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>BD329412</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging

O desenvolvimento do sistema nervoso vertebrado requer uma coordenação precisa de comportamentos e interações celulares complexos. O uso de técnicas de imagem in vivo de alta resolução pode fornecer uma janela clara para esses processos no organismo vivo. Por exemplo, a divisão de células e sua descendência pode ser seguida em tempo real à medida que o sistema nervoso se forma. Nos últimos anos, os avanços técnicos em técnicas multicoloridas têm ampliado os tipos de questões que podem ser investigadas. A abordagem multicolor Brainbow pode ser usada não apenas para distinguir entre células semelhantes, mas também para codificar vários clones diferentes de células relacionadas que cada um deriva de uma célula progenitora. Isso permite uma análise de linhagem multiplex de muitos clones diferentes e seus comportamentos simultaneamente durante o desenvolvimento. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo sarco-íris ao longo do tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento. Isso é particularmente útil para acompanhar interações celulares entre células como células, que são difíceis de rotular diferencialmente usando cores tradicionais orientadas por promotores. Nossa abordagem pode ser usada para rastrear relações de linhagem entre vários clones diferentes simultaneamente. Os grandes conjuntos de dados gerados com essa técnica fornecem informações ricas que podem ser comparadas quantitativamente entre manipulações genéticas ou farmacológicas. Em última análise, os resultados gerados podem ajudar a responder perguntas sistemáticas sobre como o sistema nervoso se desenvolve.

Esta seção ilustra exemplos de resultados que podem ser obtidos usando a abordagem de imagem de lapso de tempo multicolor in vivo descrita aqui. Mostramos que os clones codificados por cores brainbow de células na zona ventricular proliferativa do cérebro-zebrafish em desenvolvimento14 (Figura 1).
Tipicamente, quando as células rotuladas por Brainbow eram dispostas ao longo de uma fibra radial particular, elas compartilhavam a mesma co...

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Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

A imagem in vivo é uma ferramenta poderosa que pode ser usada para investigar os mecanismos celulares subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso. Aqui descrevemos uma técnica para usar microscopia confocal de lapso de tempo para visualizar um grande número de células multicoloridas com rótulo barco-íris em tempo real dentro do sistema nervoso zebrafish em desenvolvimento.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a dinâmica das células progenitoras neurais e sua prole que estão por trás do desenvolvimento cerebral vertebrado. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de visualizar diretamente vários aglomerados de células clonalmente relacionadas dentro do cérebro vivo ao longo de muitas horas de desenvolvimento. O protocolo também pode ser aplicado ao estudo da dinâmica clonal e progenitora em outros sistemas de desenvolvimento do embrião de zebrafish.A visualização usando este método é particularmente útil para observar diretamente processos fundamentais que ocorrem durante o desenvolvimento neural. Na tarde anterior à realização de microinjeções, configure zebrafish adultos selvagens em tanques de acasalamento segregados por sexo. Na manhã seguinte, prepare a solução de DNA de acordo com as instruções do manuscrito e injete aproximadamente 4,2 nano litros desta solução em uma célula de embriões de zebrafish dentro de 45 minutos após a fertilização.Mantenha os embriões injetados em E três médios e uma incubadora de 28 graus Celsius por 24 horas, em seguida, chame os embriões mortos e deformados do grupo. Transfira até 20 embriões saudáveis em um tubo de 50 mililitros, encha-o com 10 mililitros de E3 e coloque uma tampa em cima de cada tubo. Coloque um rack com os tubos de 50 mililitros eretos em um banho de água de 37 graus Celsius por 80 a 90 minutos, certificando-se de que o nível de água no banho é maior do que o E três no tubo.Retire o rack do tubo do banho de água e coloque-o na incubadora de 28 graus Celsius. Deixe até uma hora para o E3 esfriar e os embriões se reaclimatam à temperatura. Em seguida, transfira-os para placas de Petri com 0,2 milimôlar PTU e E três mantidos aquecidos na incubadora de 28 graus Celsius.De duas a quatro horas após o choque térmico, examine os embriões sob um microscópio de dissecção de fluorescência padrão para expressão de CFP ou YFP, o que indica uma recombinação cerebral bem sucedida. Selecione embriões com uma expressão FP robusta por toda parte e transfira-os para um prato separado com PTU. Imagem-los um, dois ou três dias após a fertilização.A expressão que aparece fraca sob um microscópio de fluorescência pode realmente ser bem visualizada em imagens de lapso de tempo confocal. Antes do dia do experimento, prepare a câmara de imagem e a ferramenta de manipulação de embriões. Para preparar a câmara de imagem, supercole cuidadosamente um anel de plástico no centro de uma placa de Petri de 60 milímetros.Construa o manipulador super colando um pequeno comprimento de linha de pesca de nylon até o final de uma vara de cotonete de madeira de quatro polegadas. Se necessário, descorionato os embriões sob um microscópio de dissecção antes da montagem. Para montar os embriões, transfira o peixe para o centro do anel plástico na câmara de imagem e remova o máximo de excesso E três possível com uma pipeta de transferência fina.Use uma pipeta de transferência limpa para cobrir o peixe com uma por cento de baixa agarose de derretimento e E três, enchendo todo o anel de plástico com uma camada de agarose. Em seguida, puxe suavemente o embrião para cima na ponta da pipeta e de volta para a agarose sem introduzir quaisquer bolhas de ar. Use um manipulador de embriões para orientar rapidamente o peixe e a agarose antes que endureça.Se for possível a imagem com um microscópio vertical, posicione o embrião o mais próximo possível da superfície superior da agarose, certificando-se de que eles estejam paralelos à parte inferior da câmara de imagem com a cauda reta. Aguarde que a agarose endureça, em seguida, encha a câmara de imagem com E três, adicionando o máximo possível para explicar a evaporação ao longo da imagem. Coloque a câmara de imagem com o peixe e e três no microscópio confocal.Em seguida, selecione o objetivo com uma alta abertura numérica e uma longa distância de trabalho. Encontre uma região com rotulagem adequadamente densa e brilhante das células e configure os parâmetros de aquisição. Este é um exemplo usando o software Zen, mas as configurações variam dependendo das linhas de microscópio e laser disponíveis.Prepare três faixas para imagem de cada canal FP sequencialmente. Use um laser de argônio para excitar CFP a 458 nanômetros e YFP a 514 nanômetros, e use um laser DPSS 561 nanômetro para excitar o dTomato. Colete as missões para os três nos comprimentos de onda apropriados.Selecione a faixa de pilha Z para imagem e um intervalo de tempo entre 10 e 30 minutos para acompanhar eventos mitóticos e apoptóticos. Finalmente, selecione o comprimento da sessão de imagem e execute o experimento. Depois que a imagem estiver concluída, salve os dados brutos no formato CZI se usar Zen ou outro formato compatível com Fiji, em seguida, importe as imagens para Fiji usando o importador de formatos biológicos.Imagens de lapso de tempo multicolor in vivo foram usadas para mostrar clones codificados por cores brainbow de células na zona ventricular proliferativa do cérebro traseiro de zebrafish em desenvolvimento. Células rotuladas por brainbow dispostas ao longo de uma fibra radial particular compartilhavam a mesma cor. Que pode ser quantificado como os pesos relativos do canal RGB.Isso sugere que esses grupos de rádio eram clones de células divisórias e que sua cor semelhante poderia ser usada para identificá-las como sendo relacionadas clonalmente. Uma análise quantitativa de cores mostrou que as células filhas expressam a mesma cor que a célula da mãe. Mas esses aglomerados de rádio vizinhos de células podem ser distinguidos uns dos outros.Numerosos clones de células relacionadas podem ser seguidos simultaneamente ao longo de horas in vivo, permitindo uma análise e comparação de linhagem multiplex. A quantificação da expressão de cor em clones aos dois e, em seguida, novamente em três dias após a fertilização mostrou que a expressão brainbow permaneceu relativamente constante de dois a três dias. Imagens de lapso de tempo revelaram inúmeras células submetidas à migração nuclear intercinética e divisão celular de um a dois dias após a fertilização, possibilitando estudar o ciclo celular.Calculou-se um ciclo celular médio de 8,4 horas, o que é comparável às medições anteriores em zebrafish. Além disso, essa técnica de imagem foi utilizada para observar células individuais submetidas às alterações morfológicas estereotipadas associadas à apoptose, como a membrana e a fragmentação celular. Como esse método é realizado in vivo, o zebrafish pode ser resgatado da câmara de imagem e mantido para imagens ou outros experimentos em momentos posteriores.O uso dessa técnica nos permite explorar novas questões sobre os papéis das células clonalmente relacionadas durante o desenvolvimento neural.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

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Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Biologia do Desenvolvimento

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Captura de Reparo de Tecidos em Zebrafish larvas com a Time-lapse Brightfield lupa estereoscópica

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

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Acompanhando as células GFP em peixes-zebra transgénicos Usando o Sistema Photoconvertible PSmOrange

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analisando<em&gt; In Vivo</em&gt; Migração celular usando transplantes de células e de imagem Time-lapse em embriões Zebrafish

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Análise de Desenvolvimento de rim Zebrafish com imagem Time-lapse Usando um microscópio de dissecação Equipado para Seccionamento Optical

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Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

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Viva Imagem Confocal de Desenvolvimento de Arabidopsis Flores

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Fóton multi tempo lapso imagem para visualizar o desenvolvimento em tempo real: visualização de migrar as células da crista Neural em embriões de peixe-zebra

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...