Name: visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging
Uploaded: 2020-03-23T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging at JoVE.com

Vi tackar Y. A. Pan, J. Livet och Z. Tobias för tekniska och intellektuella bidrag. Detta arbete stöddes av National Science Foundation (Award 1553764) och MJ Murdock Charitable Trust.

Försök med djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Lewis & Clark College.
1. Mikroinjektion av Zebrafish Embryon
<ol><li>Ställ in vild typ, vuxna zebrafiskar i könssegregerade parningstankar på eftermiddagen innan du utför mikroinjektioner39,40.</li>
	<li>Förbered DNA-lösningen på morgonen av mikroinjektionerna. Späd hsp: Zebrabow11 plasmid DNA t...

Detta protokoll beskriver en metod för att visualisera kloner av stamceller och nervceller i utvecklingen zebrafisk hindbrain och följa dem in vivo med Brainbow och time-lapse confocal mikroskopi11. Den största fördelen med detta protokoll i jämförelse med in vitro- eller ex vivo-studier är förmågan att direkt observera den proliferativa zonen av ryggradsdjur hjärnan i sin naturliga miljö över tiden. Denna teknik bygger på tidigare studier som märkt en enda klon med retrovirala vekto...

I de tidiga utvecklingsfaserna delar sig pooler av specialiserade stamceller upprepade gånger i proliferativa zoner, vilket producerar olika matriser av dotterceller. De celler som föds under denna utvecklingsperiod kommer sedan att differentiera och resa för att bilda de begynnande organen. I nervsystemet, förfäder såsom radiell glia ge upphov till omogna nervceller i ventrikulära zoner. Som nervceller migrera bort från ventriklarna och mogna, den expanderande vävnaden bildar så småningom de mycket komplexa strukturerna i hjärnan1,2,3,4,5,6. Samordningen mellan uppdelning av stamfader och differentiering och migration av nervceller kommer att avgöra den slutliga storleken, formen, och därmed funktionen av hjärnan, direkt påverkar beteende7,8,9,10. Även om snäv kontroll över dessa processer är helt klart avgörande för normal hjärnans utveckling, de globala mekanismer som reglerar dessa dynamik är inte väl förstådda. Här beskriver vi ett verktyg för att studera nervsystemet utveckling på en cellulär upplösning, så att forskare att visualisera stamceller och nervceller in vivo i utvecklingen zebrafish hjärnan med Brainbow och spåra deras beteende över tiden via time-lapse confocal mikroskopi11. Tillvägagångssättet kan också anpassas för att visualisera andra delar av det utvecklande embryot.
För att observera och skilja mellan celler i den utvecklande zebrafiskhjärna har vi anpassat Brainbow cellmärkningsteknik11. Brainbow använder slumpmässigt bestämd, kombinatoriskt uttryck för tre distinkta fluorescerande proteiner (FPs) för att märka en population av celler. Medan standarduttrycket för Brainbow uttryck är den röda FP dTomato, återkombinering av enzymet Cre recombinase resulterar i uttryck för mCerulean (cyan fluorescerande protein, CFP) eller gult fluorescerande protein (YFP)12,13. Den sammanlagda mängden av varje FP uttryckt i en cell ger det en unik nyans, vilket möjliggör tydlig visuell åtskillnad från angränsande celler. Dessutom, när en stamcell delar sig, varje dotter cell kommer att ärva färgen från sin modercell, producerar färgkodade kloner och tillåter forskare att spåra cell härstamning11,14. Medan ursprungligen används för att analysera neuronala kretsar hos möss12, Brainbow har sedan dess uttryckts i en mängd olika modellorganismer, inklusive zebrafisk15.
Vår teknik bygger på tidigare multicolor märkning och bildframställning metoder för att direkt bild flera färgkodade kloner över tiden i levande zebrafisk. På grund av deras optiska öppenhet som embryon, zebrafisk är väl lämpade för bildbehandling experiment16, och tidigare studier har använt Brainbow i zebrafiskar att studera en mängd olika vävnader, inklusive nervsystemet11,15,17,18,19,20,21,22,23,,24,25, 26,27. Förmågan att direkt avbilda in i den levande organismen, tillsammans med deras snabba ex utero utveckling, gör zebrafisk en värdefull modell av ryggradsdjur utveckling. I motsats till däggdjurshjärnan är hela den proliferative zonen i zebrafisk hindbrain lätt tillgänglig för avbildning utan avbrott i dess endogena miljö6. Detta gör det möjligt att genomföra experiment i den levande organismen, snarare än i in vitro- eller fasta vävnadspreparat. I motsats till fasta bildframställning experiment, in vivo studier möjliggör en longitudinell design, producerar timmar av data som kan analyseras för mönster, vilket ökar sannolikheten för att observera relativt sällsynta händelser. Beroende på hastigheten och längden på händelser av intresse, kan forskarna välja att utföra korta (1-2 h) eller långa (upp till ~ 16 h) time-lapse imaging experiment. Genom att använda zebrafisk värme chock promotor 70 (hsp70, hsp), Brainbow uttryck kan vara tidsmässigt kontrolleras28,29. Dessutom är mosaik uttryck framkallas av denna promotor väl lämpad för märkning och spåra många kloner11.
Förmågan att visuellt identifiera flera kloner i den levande hjärnan är en fördel med denna metod. Viktiga tidigare studier som undersökte klonernas roll inom utvecklingen av nervsystemet använde retrovirala vektorer för att märka en enda stamcell och dess avkomma med hjälp av ett enda FP eller annat lätt visualiserat protein. En sådan märkning gör det möjligt för forskare att observera en enda klon över tiden, antingen in vitro eller in vivo2,,30,,31,,32,,33,,34,,35,,36,,37,38. I motsats till metoder för att spåra beteendet hos celler inom en klon, de distinkta färgerna i Brainbow tillåter forskare att observera dynamiken bland kloner. Dessutom, genom att använda Brainbow att märka många kloner i hjärnan, ytterligare data om kloniska beteende samlas in i förhållande till tekniker som etikett en enda klon11. Viktigt, de metoder som beskrivs här kan utökas för att generera utvecklingsmässiga jämförelser mellan fisk som har genomgått olika genetiska eller farmakologiska manipulationer18. Sammantaget gör dessa fördelar time-lapse in vivo confocal imaging av Brainbow-uttrycker zebrafisk idealisk för forskare utforska utvecklingen av ryggradsdjur nervsystemet, särskilt de som är intresserade av rollen som kloner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>134020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-phenyl-2-thiourea (PTU)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L06690</td>
			<td>Diluted to 0.2 mM in E3 to prevent embryo pigmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml conical tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 lb nylon fishing line</td>
			<td>SecureLine</td>
			<td>NMT250</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5mL transfer pipet</td>
			<td>Globe Scientific, Inc.</td>
			<td>135010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3881</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>867-WC NO GLUE</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre recombinase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0298M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital dry bath</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>490016-616</td>
			<td>Used to store LMA at 40&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence dissection scope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary tubes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TW100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3158</td>
			<td>To maintain embryos at 28&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection plate molds</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2320</td>
			<td>For heat shocking embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>0395</td>
			<td>For E3 and for DNA solution for injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-scanning confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LE agarose</td>
			<td>Genemate</td>
			<td>E3120</td>
			<td>To create agarose injection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melt agarose (LMA)</td>
			<td>AMRESCO</td>
			<td>J234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks</td>
			<td>Aquaneering, Inc.</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9140</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9397</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>M3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 Tricaine-S</td>
			<td>Western Chemical, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>Stock made at 4 mg/mL in reverse osmosis (RO) water, then added dropwise to E3 to final concentration of 0.2 mM to anesthetize embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>4058-01</td>
			<td>For E3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (90 mm, 60 mm)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-107G</td>
			<td>To house embryos and create imaging chamber (60 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft stitch ring markers</td>
			<td>Clover Needlecraft, Inc.</td>
			<td>354</td>
			<td>For creating imaging chamber with Petri dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue (Ultra gel control)</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1363589</td>
			<td>For making embryo manipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needles</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>BD329412</td>
			<td>For dechorionating embryos</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the developing brain in living zebrafish using brainbow and time-lapse confocal imaging

Utveckling av ryggradsdjur nervsystemet kräver en exakt samordning av komplexa cellulära beteenden och interaktioner. Användningen av högupplösta in vivo bildtekniker kan ge ett tydligt fönster in i dessa processer i den levande organismen. Till exempel kan dela celler och deras avkomma följas i realtid som nervsystemet bildas. Under de senaste åren har tekniska framsteg inom multicolor tekniker utökat de typer av frågor som kan undersökas. Den multicolor Brainbow metoden kan användas för att inte bara skilja mellan liknande celler, men också att färgkod flera olika kloner av relaterade celler som var och en härrör från en stamcell. Detta möjliggör en multiplex härstamning analys av många olika kloner och deras beteenden samtidigt under utveckling. Här beskriver vi en teknik för att använda time-lapse confocal mikroskopi för att visualisera ett stort antal multicolor Brainbow-märkta celler över realtid inom den växande zebrafish nervsystemet. Detta är särskilt användbart för att följa cellulära interaktioner mellan liknande celler, som är svåra att märka differentiellt med traditionella promotordrivna färger. Vår metod kan användas för att spåra härstamning relationer mellan flera olika kloner samtidigt. De stora datamängder som genereras med hjälp av denna teknik ger omfattande information som kan jämföras kvantitativt över genetiska eller farmakologiska manipulationer. I slutändan de resultat som genereras kan bidra till att svara på systematiska frågor om hur nervsystemet utvecklas.

Det här avsnittet illustrerar exempel på resultat som kan erhållas med hjälp av in vivo multicolor time-lapse imaging metod som beskrivs här. Vi visar att Brainbow färgkodade kloner av celler i proliferative Ventrikulärt zonen i den växande zebrafish hindbrain14 (Figur 1).
Typiskt, när Brainbow-märkta celler arrangerades längs en viss radiell fiber, delade de samma färg (figur 1D), som kan kvantifie...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging at JoVE.com

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

In vivo imaging är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att undersöka de cellulära mekanismerna bakom nervsystemet utveckling. Här beskriver vi en teknik för att använda time-lapse confocal mikroskopi för att visualisera ett stort antal multicolor Brainbow-märkta celler i realtid inom den växande zebrafish nervsystemet.

Visualisera utveckla hjärnan i levande zebrafisk med Brainbow och Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara grundläggande frågor om dynamiken i neurala stamceller och deras avkomma som ligger bakom ryggradsdjur hjärnans utveckling. Den största fördelen med denna teknik är förmågan att direkt visualisera flera kluster av klonally relaterade celler inom den levande hjärnan under många timmars utveckling. Protokollet kan också tillämpas för att studera klonal och progenitor dynamik i andra utvecklande system av zebrafisk embryot.Visualisering med denna metod är särskilt användbart för att direkt observera fundamentala processer som sker under neural utveckling. På eftermiddagen före utförandet av mikroinjektioner, inrätta vilda typ vuxna zebrafisk i kön segregerade parning tankar. På nästa morgon förbereda DNA-lösningen enligt manuskript riktningar och injicera cirka 4,2 nano liter av denna lösning i en cell zebrafish embryon inom 45 minuter efter befruktning.Underhåll de injicerade embryona i E tre medium och en 28 grader Celsius inkubator i 24 timmar, sedan ringa de döda och deformerade embryon från gruppen. Överför upp till 20 friska embryon i ett 50 milliliter rör, fyll det med 10 milliliter E tre och placera ett lock ovanpå varje rör. Placera ett rack med 50 milliliter rör upprätt i en 37 grader Celsius vattenbad i 80 till 90 minuter, se till att vattennivån i badet är högre än E tre i röret.Ta bort rörstället från vattenbadet och placera den i 28 grader Celsius inkubatorn. Låt upp till en timme för E tre att svalna och embryona att återankna till temperaturen. Sedan överföra dem till Petri rätter med 0,2 millimolar PTU och E tre hålls varm i 28 grader Celsius inkubatorn.Vid två till fyra timmar efter värmechocken, undersöka embryon under en standard fluorescens dissekering mikroskop för uttryck av CFP eller YFP som indikerar framgångsrika Brainbow rekombination. Välj embryon med ett robust FP-uttryck hela och överför dem till en separat maträtt med PTU. Avbilda dem en, två eller tre dagar efter befruktning.Uttryck som visas dim under en fluorescens mikroskop kan faktiskt vara väl visualiseras i confocal time-lapse imaging. Före dagen för experimentet, förbereda bildbehandlingskammaren och embryo manipulation verktyg. För att förbereda bildbehandlingskammaren, noggrant superlim en plastring till mitten av en 60 millimeter Petri-skålen.Konstruera manipulatorn genom att super limma en liten längd av nylon fiskelina till slutet av en fyra tum trä svabb pinne. Om det behövs, dehorionerera embryona under ett dissekeringmikroskop före montering. För att montera embryona, överför fisken till mitten av plastringen i bildbehandlingskammaren och avlägsna så mycket överskott E tre som möjligt med en fin tippad överföringspipett.Använd en ren överföringspipett för att täcka fisken med en procent låg smälta agaros och E tre, fylla hela plastringen med ett lager av agaros. Dra sedan försiktigt upp embryot i pipettspetsen och tillbaka in i agarosen utan att införa några luftbubblor. Använd en embryomanipulator för att snabbt orientera fisken och agarosen innan den hårdnar.Om avbildning med upprätt mikroskop, placera embryot så nära den övre ytan av agaros som möjligt, se till att de är parallella med botten av bildbehandlingskammaren med svansen rak. Vänta på att agarosen ska härda, fyll sedan bildkammaren med E tre, och tillsätt så mycket som möjligt för att redogöra för avdunstning under avbildningen. Placera bildbehandlingskammaren med fisken och E tre på konfokalmikroskopet.Välj sedan målet med en hög numerisk bländare och ett långt arbetsavstånd. Hitta en region med lämpligt tät och ljus märkning av celler och ställa in anskaffningsparametrarna. Detta är ett exempel med zen programvara, men inställningarna kommer att variera beroende på mikroskop och laser linjer tillgängliga.Förbered tre spår för att avbilda varje FP-kanal sekventiellt. Använd en argonlaser för att excitera CFP vid 458 nanometer och YFP vid 514 nanometer, och använd en DPSS 561 nanometerlaser för att excitera dTomato. Samla in uppdragen för de tre vid lämpliga våglängder.Välj Z-stackintervallet till avbildning och ett tidsintervall mellan 10 och 30 minuter för att spåra mitotiska och apoptotiska händelser. Slutligen väljer du längden avbildningssessionen och kör experimentet. Efter imaging är klar, spara rådata i CZI-format om du använder Zen eller ett annat format som är kompatibelt med Fiji, sedan importera bilderna till Fiji med hjälp av bio format importören.In vivo multicolor time-lapse imaging användes för att visa Brainbow färg kodade kloner av celler i proliferative Ventrikulärt zonen av den utvecklande zebrafish hindbrain. Brainbow märkta celler ordnade längs en viss radiell fiber delade samma färg. Som kan kvantifieras som den relativa RGB-kanalen vikter.Detta tyder på att dessa radiogrupper var kloner av att dela celler och att deras liknande färg skulle kunna användas för att identifiera dem som klonally relaterade. En kvantitativ färganalys visade att dotterceller uttrycker samma färg som sin mors cell. Men att angränsande radiokluster av celler kan skiljas från varandra.Talrika kloner av relaterade celler kan följas samtidigt över timmar in vivo, vilket möjliggör en multiplex härstamning analys och jämförelse. Kvantifiering av färguttryck i kloner vid två och sedan igen vid tre dagar efter befruktning visade att Brainbow uttryck förblev relativt konstant från två till tre dagar. Time-lapse imaging visade många celler som genomgår interkinetic nukleära migration och cell delning från en till två dagar efter befruktning, vilket gör det möjligt att studera cellen cykeln.En genomsnittlig cellcykel på 8,4 timmar beräknades vilket är jämförbart med tidigare mätningar hos zebrafisk. Vidare användes denna bildframställning teknik för att observera enskilda celler som genomgår de stereotypa morfologiska förändringar som är associerade med apoptos, såsom membran blebbing och cell fragmentering. Eftersom denna metod utförs in vivo kan zebrafisk räddas från bildbehandlingskammaren och underhållas för bildbehandling eller andra experiment vid senare tidpunkter.Användningen av denna teknik gör det möjligt för oss att utforska nya frågor om rollerna för klonally relaterade celler under neural utveckling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mätning Protein Stabilitet i Living Zebrafish embryon Använda Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Fånga Tissue Repair i Zebrafish Larver med Time-lapse Bright stereomikroskopi

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulära strukturer i vardagsZebraFish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Spåra celler i GFP-transgen zebrafisk Använda Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analysera<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migration använder Cell Transplantationer och Time-lapse avbildning i Zebrafish embryon

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analys av zebrafisk njure utveckling med Time-lapse avbildning med ett dissektionsmikroskop Utrustad för optisk Sektione

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

Visualisera Interrenal steroidogena Tissue och dess Vascular mikromiljö i Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Live Confocal Imaging för att utveckla Arabidopsis blommor

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion av hypoxi i levande groda och zebrafiskembryon

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Flera Photon Time Lapse Imaging att visualisera utvecklingen i realtid: visualisering av migrera Neural Crest celler hos zebrafiskar embryon

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...