Name: purification and analysis of caenorhabditis elegans extracellular vesicles
Uploaded: 2020-03-31T13:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles at JoVE.com

ونحن ننوه بامتنان لـ"نك تيرزوبولوس" للوحات الديدان والكواشف؛ ونقدّم امتناننا لـ"نَكِر" "ب"الديدان" و"الكواشف" مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) في مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440) لخط النيماتودا N2؛ لوسيا فويتك، دكتوراه، للمساعدة في تحليل تتبع الجسيمات النانوية؛ جيسيكا يونغ, دكتوراه, وماري كلير, دكتوراه, دكتوراه, دكتوراه, لhiPSC المستمدة من وسائل الإعلام الخلية مكيفة; واي بانغ للمساعدة في التصوير تيم. تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعاهد القومية للصحة P30AG013280 إلى MK وNIH منحة AG054098 إلى JCR.

<ol>
	<li>Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Unique+Intercellular+Delivery+Vehicles.">Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles.</a> Trends in Cell Biology. 27, 172-188 (2017).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li><li>Lakhter, A. J., Sims, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Emerging+Roles+for+Extracellular+Vesicles+in+Diabetes+and+Related+Metabolic+Disorders.">Minireview: Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Diabetes and Related Metabolic Disorders.</a> Molecular Endocrinology. 29, 1535-1548 (2015).</li><li>Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+membrane+vesicles+in+the+pathogenesis+of+various+diseases,+including+cancer,+renal+diseases,+atherosclerosis,+and+arthritis.">Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis.</a> Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 90, 1549-1557 (2010).</li><li>Lai, C. P. -. K., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes/microvesicles+in+the+nervous+system+and+use+in+emerging+therapies.">Role of exosomes/microvesicles in the nervous system and use in emerging therapies.</a> Frontiers in Physiology. 3, 228 (2012).</li><li>Duijvesz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+exosomes+leads+to+the+identification+of+novel+biomarkers+for+prostate+cancer.">Proteomic profiling of exosomes leads to the identification of novel biomarkers for prostate cancer.</a> PLoS One. 8, 82589 (2013).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+Fetuin-A+identified+by+proteomics:+a+novel+urinary+biomarker+for+detecting+acute+kidney+injury.">Exosomal Fetuin-A identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury.</a> Kidney International. 70, 1847-1857 (2006).</li><li>Cheng, L., Sharples, R. A., Scicluna, B. J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+provide+a+protective+and+enriched+source+of+miRNA+for+biomarker+profiling+compared+to+intracellular+and+cell-free+blood.">Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Michael, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+human+saliva+as+a+source+of+microRNA+biomarkers.">Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers.</a> Oral Diseases. 16, 34-38 (2010).</li><li>Wehman, A. M., Poggioli, C., Schweinsberg, P., Grant, B. D., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P4-ATPase+TAT-5+inhibits+the+budding+of+extracellular+vesicles+in+C.+elegans+embryos.">The P4-ATPase TAT-5 inhibits the budding of extracellular vesicles in C. elegans embryos.</a> Current Biology. 21, 1951-1959 (2011).</li><li>Naik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P4-ATPase+ATP9A+is+a+novel+determinant+of+exosome+release.">The P4-ATPase ATP9A is a novel determinant of exosome release.</a> PLoS One. 14, 0213069 (2019).</li><li>Li&#233;geois, S., Benedetto, A., Garnier, J. -. M., Schwab, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V0-ATPase+mediates+apical+secretion+of+exosomes+containing+Hedgehog-related+proteins+in+Caenorhabditis+elegans.">The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 173, 949-961 (2006).</li><li>Simon, E., Aguirre-Tamaral, A., Aguilar, G., Guerrero, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+Intra-+and+Intercellular+Trafficking+of+Hedgehog+for+Tissue+Patterning.">Perspectives on Intra- and Intercellular Trafficking of Hedgehog for Tissue Patterning.</a> Journal of Developmental Biology. 4, (2016).</li><li>Qi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Derived+from+Human+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Promote+Tumor+Growth+Through+Hedgehog+Signaling+Pathway.">Exosomes Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Promote Tumor Growth Through Hedgehog Signaling Pathway.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42, 2242-2254 (2017).</li><li>Sigg, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+Proteomics+Uncovers+Ancient+Associations+of+Cilia+with+Signaling+Pathways.">Evolutionary Proteomics Uncovers Ancient Associations of Cilia with Signaling Pathways.</a> Developmental Cell. 43, 744-762 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+ciliated+sensory+neurons+release+extracellular+vesicles+that+function+in+animal+communication.">C. elegans ciliated sensory neurons release extracellular vesicles that function in animal communication.</a> Current Biology. 24, 519-525 (2014).</li><li>Beer, K. B., Wehman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functions+of+extracellular+vesicle+release+in+vivo-What+we+can+learn+from+flies+and+worms.">Mechanisms and functions of extracellular vesicle release in vivo-What we can learn from flies and worms.</a> Cell Adhesion and Migration. 11, 135-150 (2017).</li><li>Deatherage, B. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicle+release+in+bacteria,+eukaryotes,+and+archaea:+a+conserved+yet+underappreciated+aspect+of+microbial+life.">Membrane vesicle release in bacteria, eukaryotes, and archaea: a conserved yet underappreciated aspect of microbial life.</a> Infection and Immunity. 80, 1948-1957 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> C. elegans. 2, 51-67 (1999).</li><li>Kibria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+automated+surface+protein+profiling+of+single+circulating+exosomes+in+human+blood.">A rapid, automated surface protein profiling of single circulating exosomes in human blood.</a> Scientific Reports. 6, 36502 (2016).</li><li>Rose, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantification+of+peripheral+blood+cell+&#946;-adrenergic+receptor+density+and+urinary+endothelial+cell-derived+microparticles+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Flow cytometric quantification of peripheral blood cell &#946;-adrenergic receptor density and urinary endothelial cell-derived microparticles in pulmonary arterial hypertension.</a> PLoS One. 11, 0156940 (2016).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Fernandez, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescence-based+isolation+of+live+C.+elegans+larvae.">High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae.</a> Nature Protocols. 7, 1502-1510 (2012).</li><li>de Rond, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Generic+Fluorescent+Markers+for+Detection+of+Extracellular+Vesicles+by+Flow+Cytometry.">Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry.</a> Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).</li><li>Russell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+from+Caenorhabditis+elegans+for+multi-omic+analysis+[Internet].">Isolation and characterization of extracellular vesicles from Caenorhabditis elegans for multi-omic analysis [Internet].</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن مصالح متنافسة.

التحدي الأساسي للحقل EV هو فصل مجموعة واسعة من الأنواع الفرعية EV2. تستخدم الأساليب الموصوفة هنا الترشيح، والطرد المركزي التفاضلي، والكروماتوغرافيا الإقصاء للحجم لتوليد مجموعة نقية من المركبات الكهربائية الصغيرة لأن ~ 100 نانومتر EVs ثبت سابقا أن تفرز في البيئة الخارجية ووظيفة في مسارات الاتصال ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية16. قد لا تزال المركبات الكهربائية المنقاة من خلال الكروماتوغرافيا الإقصاء الحجمية مزيجًا من الاكسوزوسومات والميكروفيسيخالصغيرة الصغيرة لأن هذه الفئات الفرعية EV متشابهة الحجم. عادة ما يتم فصل الفئات الفرعية EV الفقارية عن طريق الترسيب المناعي لأن هذه الطريقة تعزل المركبات الكهربائية من خلال ربط علامات بروتين الغشاء الانتقائي. الطرق الموصوفة تسهيل التعرف على بروتينات علامة غشاء EV C. elegans EV. لذلك ، في المستقبل قد يكون من الممكن زيادة فصل الفئات الفرعية EV الصغيرة من خلال أساليب مماثلة لهطول المناعة. من الناحية النظرية، يمكن أن يعزل الترسيب المناعي المركبات الكهربائية عن الديدان التغذية بشكل جيد لأن E. Coli EVs لا ينبغي أن تتفاعل مع الأجسام المضادة. يمكن للباحثين المهتمين بتحديد البروتين والشحنات الوراثية للفئات الفرعية الأكبر EV (> 200 نانومتر) القيام بذلك عن طريق تخطي خطوة الترشيح 0.22 ميكرومتر ثم تحليل بيليه بدلاً من supernatant. الكشف عن وفرة البروتين والبضائع الوراثية من السيارات الكهربائية الكبيرة سوف يؤسس لفهم أكثر شمولا للعمليات الفسيولوجية التي تعمل من خلال سي elegans secretome. بالإضافة إلى كونها تفرز في البيئة، يتم نقل السيارات الكهربائية C. elegans داخليا بين الأنسجة. لذلك، هذه الأساليب عزل مجموعة فرعية فقط من إجمالي C. elegans EVs. ومع ذلك ، فإن اكتشاف البضائع من المركبات الكهربائية الداخلية غير ممكن لأنه لا توجد طريقة لفصل المركبات الكهربائية عن الديدان الملبدة. تحليل البضائع من هذه المجموعة الفرعية EV تفرز خارجيا يوفر وسيلة لتحديد علامات البروتين EV العامة المحتملة قادرة على وضع العلامات الكهربائية الداخلية كذلك.
يعتمد حجم إعداد EV على متطلبات التجربة. يوفر ما مجموعه 500,000 شاب من البالغين ما يكفي من المركبات الكهربائية لإجراء قياس خلايا التدفق وLC-MS-MS وتحليل RNAseq بالتوازي. يمكن توسيع هذا العدد لأعلى أو لأسفل حسب الاحتياجات التجريبية. أكبر عامل عملي لزيادة هو عدد لوحات النمو 10 سم عالية المطلوبة. لوحات النمو العالي أعدت مع 500 ميكرولتر من 20x مركزة بين عشية وضحاها NA22 الثقافة سوف تدعم السكان من حوالي 50،000 البالغين من مرحلة اليرقات L1 حتى اليوم الأول من مرحلة البلوغ. لذلك ، لإجراء تجربة مع 500،000 شخص بالغ ، هناك حاجة إلى 13 لوحة نمو عالية: لوحة واحدة لتوليد عدد سكان L1s ، ولوحتين لتوليد البالغين للتبييض ، و 10 لوحات لنمو الحيوانات التجريبية. هذه المقاييس هي التي تتوقف على ظروف البذر والنمو البكتيري لوحات النمو العالي. لذلك ، يوصى بصنع جميع اللوحات بطريقة موحدة ثم معايرتها بكميات معروفة من الحيوانات.
يتم حساب الديدان على مرحلتين أثناء عملية الزراعة: 1) قبل البذر الديدان على لوحات و 2) قبل توليد وسائل الإعلام مكيفة. وقد ثبت كثافة زراعة الحيوان للتأثير على السلوك، والتنمية، والاستجابات الإجهاد15،16،17،18 ، وبالتالي ، قد تؤثر أيضا على الشحنات EV. لذلك ، من أجل كثافة زراعة متسقة ، من الضروري تقدير أعداد الديدان بدقة. إن تحديد عدد الديدان في تسع قطرات يعطي الثقة الإحصائية للتقديرات السكانية. من الضروري علاج كل قطرة على حدة ، والدوامة بين كل قطرة وإدراج ماصة نفس المسافة في تعليق الدودة. إن اتخاذ هذه الاحتياطات سيضمن قيم S.E.M. من حوالي 5-10٪ من إجمالي السكان. إذا كانت S.E.M. للمجموعة الدودة أعلى من 20٪، ثم شيء ما ذهب منحرف.
بعد فترة الحضانة خالية من البكتيريا 24 ساعة ، يزحف الشباب من النوع البري C. elegans فورًا بالإضافة إلى العشب البكتيري. وهذا يشير إلى أن الحضانة لا تؤثر بشدة على صحتهم. ومع ذلك ، فإن هذه الخطوة تؤثر على فسيولوجيا الحيوانات وبالتالي قد تؤثر على تكوين شحنات EV. لذلك ، عند العمل مع الأنماط الجينية المريضة جدًا أو الحيوانات القديمة ، من الضروري التحقق من الجدوى بعد خطوة الحضانة. إذا لم تنجو جميع الحيوانات من الحضانة ، فقم بزيادة حجم السكان التجريبي وتقليل وقت الحضانة. عند العمل مع كميات كبيرة من الوسائط المكيفة ، فمن العملي أكثر استخدام مكثف الخلايا التحريكية مع مرشح مصنوع من النيتروسيللوز المتجدد. لا ترتبط المركبات الكهربائية بكيمياء التصفية هذه بقوة مثل أنواع التصفية الأخرى14.
نسبة البروتين الكلي المسترد من وسائل الإعلام مكيفة لعدد الحيوانات المحتضنة لجعل إعداد هو مقياس مفيد. إذا كانت هذه النسبة أعلى بكثير مما كان متوقعا، فمن الممكن أن التقديرات السكانية كانت قبالة أو أن الحيوانات ماتت وتدهورت في وسائل الإعلام مكيفة. إذا كانت هذه النسبة أقل بكثير مما كان متوقعا، ثم بعض البروتين قد فقدت على المرشحات أثناء عملية التركيز. وفي حين أن أساليب نظام مراقبة الأصول الميدانية سوف تحدد مباشرة المركبات الكهربائية في الإعداد، فإن هذا المقياس مفيد لأنه يمكن أن يسلط الضوء على شذوذ العينة في وقت مبكر من العملية. طريقة أخرى مفيدة للتحقق من جودة إعداد EV هو المجهر الإلكتروني انتقال، كما هو مبين في الشكل 4D. على الرغم من أن بروتوكول المجهر الإلكتروني الإرسال لم يتم تضمينها رسميا في هذه المادة أساليب بسبب طول، فإنه يمكن أن يتم بالطرق القياسية. ويوصى بإجراء هذا النوع من التحليل، في البداية على الأقل، كطريقة مجانية لنظام مراقبة الأصول الميدانية لتقييم نوعية مستحضرات EV. للحصول على أفضل النتائج استخدام شبكات formvar الكربون ية حديثا ووصمة عار العينات مع حمض فوسفوالتنغستن 2٪ بدلا من خلات uranyl.
تم اختيار DI-8-ANEPPS لأنه ثبت أن تسمية الأغشية EV كميا، متفوقا على غيرها من الأصباغ EV العامة مع عينات خزعة الإنسان والليبوزومات25. القياسات سريعة ، مع 3 دقيقة فقط من وقت جمع كل عينة. إن التحديد الكمي للمركبات الكهربائية الحساسة للمنظفات له أهمية وظيفية مباشرة لأنه يستفيد من التمييز المادي الأساسي بين المركبات الكهربائية ومجاميع البروتين الدهني الصلبة. الأهم من ذلك، لا تتأثر هذه الطريقة بكمية البروتين الكلي أو عدد المجاميع غير EV، وبالتالي يمكن تحديد كمية المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها من خلال طرق تنقية مختلفة بطريقة غير متحيزة. سيكون مقياس EV الذي تم التحقق منه من FACS الذي نصفه هنا مفيدًا بشكل خاص للدراسات التي توضح الآثار الفسيولوجية للمركبات الكهربائية المنقىة. كما يمكن أن يفيد مجال EV بشكل عام لوضع منهجية FACS كمقياس عالمي بحيث يمكن مقارنة وفرة EV المطلقة مباشرة عبر الدراسات. يمكن أن تسمية الأصباغ الحيوية C. elegans EVs ، ولكنها ليست مشرقة مثل السيارات الكهربائية المسماة مع Di-8-ANEPPS.
يستفيد هذا النهج التنقية من الإفراز النشط للمركبات الكهربائية خارج أجسام الديدان الحية السليمة. وهذا يسمح C. elegans EVs لتكون معزولة في نقاء ووفرة مماثلة اعتبارا من ثقافة الخلية, المواصفات التي هي كافية لتحديد مئات من البروتين وشحنات الحمض النووي الريبي عبر LC-MS-MS وRNAseq تحليل26. وهكذا، يمكن الاستفادة من المكتبة الكبيرة من الكواشف المتاحة لبحوث C. elegans للتحقيق في تأثير الاضطراب الوراثي والفسيولوجي على تكوين البضائع EV.

إفراز الحويصلات خارج الخلية المرتبطة بالغشاء (EVs) يسهل العمليات الفسيولوجية العالمية من خلال نقل بروتين معين وحمض نوي ومستقلب وشحنات من الدهون بين الخلايا1بنشاط. تفرز الخلايا EVs التي تمتد سلسلة متصلة من الأحجام تتراوح بين 2 ميكرومتر أو أكبر إلى صغيرة مثل 20 نانومتر2. تتم دراسة المركبات الكهربائية الصغيرة (<200 نانومتر) بشكل متزايد بسبب تأثيرها في العمليات المرضية ، بما في ذلك الاضطرابات الأيضية والسرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والأمراض العصبية3،4،5. وقد ثبت أيضا هذه الأمراض للتأثير على البروتين والتكوين الوراثي للمركبات الكهربائية الشحنات من المركبات الكهربائية الصغيرة. لذلك ، يتم الكشف بشكل متزايد عن توقيعات العلامات الحيوية للأمراض من خلال طرق اكتشاف البضائع EV مثل LC-MS-MS و RNAseq6و7و8و9.
C. elegans كان نموذجا غير فقاري مفيد لتحديد مسارات إشارات EV المحفوظة بشكل تطوري. على سبيل المثال، تم أول عرض لـ C. elegans flippase للحث على النشأة الحيوية EV في أجنة C. elegans، وأظهر أن التجانس البشري يؤثر على إطلاق EV في الخلايا البشرية10،11. C. elegans EVs تم الإبلاغ عن حمل إشارات القنفذ اللازمة لتطوير cuticle. وقد تبين تسليم القنفذ وغيرها من المورفوجين للعب دور تنموي رئيسي من السيارات الكهربائية، ويتم الحفاظ عليه في حمار وحشي، الفئران، والبشر12،13،14،15. C. elegans هو مناسبة تماما لاكتشاف المؤشرات الحيوية EV لأنه يفرز المركبات الكهربائية خارج جسمها التي تعمل في الاتصالات بين الحيوان والحيوان16،17 (الشكل 1A). ومع ذلك ، لا يمكن استخدام المنهجية التي تم تحديدها من خلال دراسة سابقة لأن مصدر الأغذية E. coli النيماتوديس يفرز أيضًا EVs18. في هذه الطريقة ، تتكون معظم العينة من تلوث الإشريكية القولونية ، مما يحد من قوة نهج البروتيوميات أو RNAseq لاكتشاف شحنات C. elegans EV. تم تطوير الأساليب الموصوفة هنا لإنتاج EVs C. elegans نقية للغاية عند مستويات الوفرة المميزة لتجارب ثقافة الخلايا النموذجية وبالتالي تسهيل نهج omics لاكتشاف المؤشرات الحيوية EV.
وهناك حاجة إلى أعداد كبيرة من الديدان لتوليد عدد كاف من المركبات الكهربائية لتحليل البضائع. ولذلك، فإن أساليب إجراء الزراعة الكمية لأعداد كبيرة من السكان المتزامنين من الناحية الإنمائية C. elegans مدرجة أيضا. عادة ، عندما تكون هناك حاجة إلى عدد كبير من الديدان للتجارب ، يتم استزراعها في وسائل الإعلام السائلة. في حين أن هذا فعال لتوليد أعداد كبيرة من الديدان ، فإن فسيولوجيا الحيوانات تختلف إلى حد كبير عن الديدان المزروعة في ظل الظروف القياسية على لوحات agar المتوسطة لنمو النيماتودا (NGM). الحيوانات المستزرعة في السائل تنمو ببطء أكبر، وأرق، وتظهر عدم التجانس التنموي، وتخضع لدرجة عالية من تقلب دفعة. لذلك ، نقدم وسيلة بسيطة ولكنها فعالة للزراعة الكمية لأعداد كبيرة من C. elegans المتزامنة تنمويًا باستخدام لوحات نمو عالية 10 سم. يتضمن التركيب الإعلامي للوحات النمو العالي المزيد من البُرَب من لوحات NGM العادية ويتم زرعها بسلالة الإشريكية القولونية NA22 التي تنمو بقوة أكبر من OP50.
وقد مكنت أوجه التقدم في تكنولوجيا قياس الخلايا تدفق (FACS) التحليل المباشر للمركبات الكهربائية الفردية20،21، مما يسمح بالقياس الكمي للمركبات الكهربائية دون القيود المتأصلة في أساليب أخرى. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن البروتين ليس وكيلا مفيدا لوفرة EV لأن منهجيات تنقية مختلفة تؤدي إلى نسب EV إلى البروتين مختلفة بشكل ملحوظ22. تحتوي كسور EV النقية للغاية على بروتين قليل نسبيًا ، مما يجعل من الصعب قياس العينات باستخدام BCA أو المواد الهلامية Coomassie. يمكن للتحليل الغربي تحديد الاختلافات النسبية للبروتينات الفردية ولكن لا يمكن تحديد عدد المركبات الكهربائية الموجودة في العينة. ويعوق التحديد الكمي القوي لعدد EV عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية نطاقه الضيق من الإشارة إلى الضوضاء، وعدم القدرة على التمييز بين المركبات الكهربائية والمجاميع الصلبة، وعدم إمكانية نقل الأساليب بين الأدوات ذات المواصفات المختلفة23. لذلك، تحتوي هذه المقالة أيضاً على إجراء قياس خلايا التدفق القابل للتعميم للتمييز وتحديد المركبات الكهربائية كمياً.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="791">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">0.22 filters units</td>
			<td style="width:107px;">Genesee</td>
			<td style="width:115px;">25-233</td>
			<td style="width:327px;">For clairifying the conditioned media from debris</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">1% solution of Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">HFH10</td>
			<td>Add this to 0.05 % to lyse EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">10 cm high growth plates</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">N/A</td>
			<td>For cultivating large populations of worms</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">2-liter bottom baffled flasks</td>
			<td style="width:107px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">4110-2000PK</td>
			<td>For conducting size exclusion separation of EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">40 &#956;m mesh</td>
			<td style="width:107px;">Amazon</td>
			<td style="width:115px;">CMY-0040-C/5PK-05</td>
			<td>Use this to separate adult worms from larval stages</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">5 &#956;m mesh</td>
			<td style="width:107px;">Amazon</td>
			<td style="width:115px;">CMN-0005-C</td>
			<td>Use this to separate L1s from other worm stages</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">6 cm normal growth medium worm cultivation plate</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">N/A</td>
			<td>For cultivating small populations of worms</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">C7715</td>
			<td>For concentrating the size exclusion elute</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">C78144</td>
			<td>For concentrating the conditioned media</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Apogee A50 flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Apogee</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">ApogeeMix</td>
			<td style="width:107px;">Apogee</td>
			<td style="width:115px;">1493</td>
			<td>Assess light scatter and fluorescence performance of FACS</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">DI-8-ANEPPS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3167</td>
			<td>Add this at 20 uM to label EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Disposable chromatography Column</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:115px;">7321010</td>
			<td>For conducting size exclusion separation of EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Geletin</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">G9391-100G</td>
			<td>To treat pipette tips so that worms do not stick</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">HALT protease inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">87785</td>
			<td>Add to EV sample to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Low-protein binding collection tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>90410</td>
			<td>Use these for EV samples</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>For sucrose floatation of worms</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">S Basal buffer</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">N/A</td>
			<td>Recipe in WormBook</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Sepharose CL-2B resin</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">CL2B300-100ML</td>
			<td>For conducting size exclusion separation of EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Small orbital shaker</td>
			<td style="width:107px;">ABC Scientific</td>
			<td>83211301</td>
			<td>Use this for worm S Basal incubation</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Sucrose</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td>For sucrose floatation of worms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and analysis of caenorhabditis elegans extracellular vesicles

إفراز الحويصلات الصغيرة المرتبطة بالغشاء في البيئة الخارجية هو عملية فسيولوجية أساسية لجميع الخلايا. تعمل هذه الحويصلات خارج الخلية (EVs) خارج الخلية لتنظيم العمليات الفسيولوجية العالمية عن طريق نقل البروتينات والأحماض النووية والأيض والدهون بين الأنسجة. تعكس المركبات الإلكترونية الحالة الفسيولوجية لخلايا المنشأ الخاصة بها. والمركبات الكهربائية متورطة في أن لها أدواراً أساسية في كل جانب من جوانب صحة الإنسان تقريباً. وهكذا، يتم تحليل بروتين EV والشحنات الوراثية بشكل متزايد للعلامات الحيوية للصحة والمرض. ومع ذلك، لا يزال حقل EV يفتقر إلى نظام نموذج لافقاري قابل للمسار يسمح بدراسة تكوين البضائع EV. C. elegans مناسبة تماما لأبحاث EV لأنه يفرز بنشاط المركبات الكهربائية خارج جسمها في بيئتها الخارجية، مما يسمح العزلة سهلة. توفر هذه المقالة جميع المعلومات اللازمة لتوليد وتنقية وقياس هذه المركبات الكهربائية C. elegans التي تفرزها البيئة بما في ذلك كيفية العمل كميًا مع مجموعات كبيرة جدًا من الديدان المتزامنة مع العمر ، وتنقية المركبات الكهربائية ، وبروتوكول قياس الخلايا التدفقي الذي يقيس مباشرة عدد المركبات الكهربائية السليمة في العينة المنقىة. وهكذا، يمكن استغلال المكتبة الكبيرة من الكواشف الوراثية المتاحة لبحوث C. elegans للتحقيق في آثار المسارات الجينية والعمليات الفسيولوجية على تكوين البضائع EV.

ويرد تخطيطي للعمليات اللازمة لتوليد وتنقية المركبات الكهربائية في الشكل 1. يتم عرض الأوقات النموذجية المطلوبة لإكمال كل خطوة أسفل. ويبين الشكل 2 تخطيطياً لإعداد عينات لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام DI-8-ANEPPS(الشكل 2A)وكذلك الحسابات اللازمة لتقدير العدد الإجمالي للمركبات الكهربائية في عينة(الشكل 2B).
وترد النتائج التمثيلية من 10 يكرر البيولوجية في الشكل 3ألف. التباين بين النسخ المتماثلة ليس كبيراً وS.E.M. النموذجي لحجم السكان هو ما يزيد قليلاً عن 10٪(الشكل 3B). تصفية الديدان وزراعة على لوحات النمو العالي الطازجة سوف تولد مجموعة كبيرة من البالغين gravid مناسبة لتزامن التبييض. لوحة واحدة جوعا معالجتها بهذه الطريقة يمكن أن تنتج مجموعة تجريبية من 1 × 106 أو أكثر من ذرية متزامنة لأن كل الكبار gravid سوف تحتوي على حوالي 10 بيضات. من الممكن الحفاظ على أعداد كبيرة من السكان المتزامنين تنمويًا عن طريق تصفية البيض واليرقات من خلال فلتر 40 ميكرومتر للحصول على المركبات الكهربائية من الحيوانات القديمة. يتم نقل البالغين المحتفظ بهم إلى لوحات نمو عالية جديدة بكثافة 20،000 الحيوانات لكل لوحة. وتكررت هذه العملية كل يومين. ويبين الشكل 3جيم ثلاث نسخ بيولوجية من مجموعات الديدان التي يجري نقلها عبر ثلاث عمليات نقل للألواح. يؤدي نقل الحيوانات بين اللوحات إلى فقدان الحيوانات بنسبة 10٪ تقريبًا(الشكل 3C)بينما يتم فقدان حوالي 20٪ من الحيوانات في خطوة تعويم السكروز(الشكل 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig3a.jpg"> الشكل 3: القياس الكمي لأعداد كبيرة من C. elegans لتحليل EV. (أ)مقارنة بين عدد الديدان مرحلة اليرقات L1 معزولة عن واحد يتضور جوعا مؤخرا (<24 ح) لوحة النمو العالي. يتم رسم قيم كل من النسخ المتماثلات البيولوجية 10. كما يتم تقديم تجميع جميع نقاط البيانات في النسخ المتماثلة العشرة كمؤامرة كمان وبار مع S.E.M. وهذا يدل على أن لوحة واحدة من الديدان جوعا مؤخرا سوف تسفر عن ~ 80،000 L1 اليرقات المرحلة الديدان المرحلة. (ب)S.E.M. من 15 قياسات مختلفة للسكان لوحة في لوحة A رسمت كنقاط فردية. بشكل عام، S.E.M. أكبر قليلاً من 10٪. (ج)تم تقدير ثلاث نسخ بيولوجية من مجموعات الديدان بعد كل نقلمن بين الصفائح كل 4 ساعات. ولم يسفر هذا النقل للحيوانات بين الصفائح عن انخفاض كبير في حجم السكان. وهذا يشير إلى أن المنهجية المعروضة هنا للديدان المتحركة لا تؤدي إلى خسارة كبيرة للحيوانات. (د)قياسات السكان التي اتخذت على طول مسار ثلاثة EV التجريبية يكرر: أعداد الحيوانات التي قدرت ليرقات L1 الأصلي الذي بدأ التجربة، وعدد الحيوانات البالغة الشباب تعافى من تعويم السكروز وجاهزة لفترة الحضانة 24 ح، وعدد الحيوانات التي تحسب من إعداد EV عند استرداد السروم. هناك انخفاض صغير ولكن ليس كبيرا في حجم السكان بين التقدير الأولي للسكان في مرحلة اليرقات L1 وبعد ذلك عندما تكون الحيوانات من الشباب البالغين. تم تعيين متوسط قياس السكان L1 على أنه 100٪ وتم قياس جميع القياسات الأخرى من خلال علاقتها بهذه القيمة. أشرطة الخطأ S.E.M. * = p قيمة < 0.05، N.S. = ليست كبيرة في اختبار t المقترنة parametric. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig3alarge.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
نسبة البروتين إلى الحيوان هو مقياس مفيد لتوصيف إعداد EV. يمكن أن يوفر هذا المقياس وسيلة سريعة لتحديد الاتساق بين الاستعدادات EV. في المتوسط ، 1000 الحيوانات البرية من النوع البالغين الشباب سيفرز 1 ميكروغرام من البروتينات أكبر من 10 كيلو دا في بيئتها(الشكل 4ألف). عندما يتم فصل هذا الكسر كذلك من قبل الكروماتوغرافيا استبعاد حجم, ملف البروتين الكلي elution يظهر ذروة البروتين الصغيرة بين 2-6 مل وذروة كبيرة بعد 8 مل. وترد المركبات الكهربائية في أول 5 مل من eluate العمود(الشكل 4B). تحليل تتبع الجسيمات النانوية أول 5 مل من eluate العمود يحتوي على عدد أحادي التشتت من السيارات الصغيرة ، ~ 150 نانومتر(الشكل 4C). يكشف المجهر الإلكتروني للإرسال من كسور استبعاد الحجم عن مركبات EVs وفيرة في الجزء 2-6 مل من الإلجيل ولكن ليس في أحجام eluate اللاحقة. ومن المعروف EVs لشكلها مثل كوب، وبالتالي من السهل التمييز من الجسيمات الصلبة التي تظهر كنقاط مشرقة punctate عند إعدادها تحت ظروف تلطيخ سلبية(الشكل 4D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig4.jpg"> الشكل 4: تنقية السيارات الكهربائية C. elegans من الكتلة الحيوية التفرز بالكامل. (أ)تم رسم نسبة البروتينات الإجمالية أكبر من 10 كيلودا إلى عدد الديدان المحتضنة في التحضير لـ 10 يكرر البيولوجية. وتحتوي معظم المستحضرات على ميكروغرام واحد من البروتين لكل 000 1 من الحيوانات. (ب)ملف تعريف اليويون البروتين يُعنى بعمود راتنج يُمَمَّم بـ 1 مل من السرايوم المركز. يتم وضع الأجزاء التي يتم دمجها في مزيد من التحليلات في مجموعات. (C)تحليل تتبع الجسيمات النانوية للكسرات الموحدة الراتنج توصف 2-6 مل. فترة الثقة 95% هي رمادية المعلّمة. (D)تحليل TEM للكسور الراتنج الموحدة. كان لدى مادة البداية جسيمات تشبه الحويصلات وجسيمات غير حوسية. تم إثراء الكسر الإلوطي الموحد الذي كان 2-6 مل للحويصل اتّذي بجزيئات قليلة غير الحويصلات. تحتوي الكسور الموحدة 7-11 مل على جزيئات قليلة تشبه الحويصلات ولكن العديد من الجسيمات غير الحويصلات. تحتوي الكسور الelution 12-15 مل فقط على جزيئات غير الحويصلات. يتم عرض جميع الميكروغرافيات في نفس التكبير. شريط مقياس = 200 نانومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig4large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
لمقارنة مباشرة خصائص التدفق الخلوي بين C. elegans وEVs الإنسان، ونحن تنقية EVs من وسائل الإعلام مكيفة من الخلايا الثقافات من الخلايا العصبية البشرية مع هذا الأسلوب. ويفصل قياس الخلايا التدفق الجسيمات على أساس تشتت الضوء. يرتبط تشتت الضوء ذو الزاوية الصغيرة (SALS) تقريبًا بالحجم ، ويرتبط تشتت الضوء طويل الزاوية (LALS) ببنية الغشاء الداخلي. وتركز معظم الأحداث عينة مجموع من كل من ثقافة الخلية وC. elegans EV الاستعدادات بإحكام في مجموعة تركزت حول 103 SALS و 104 LALS(الشكل 5A). ويبين الرسم البياني لأحداث عينة C. elegans EV التي تم فرزها بواسطة SALS أن جميع الاستعدادات تصل إلى ذروتها عند ~ 103 (الشكل 5B).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig5.jpg"> الشكل 5: يتم تعريف C. elegans EVs بوضوح من خلال خصائصها تشتت الضوء. (أ)الرسم البياني لأحداث SALS في ثلاث نسخ بيولوجية من C. elegans EVs. ~ 80 ٪ من مجموع الأحداث عينة ترد داخل ضيق ، والسكان محددة بوضوح. على غرار تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، فإنه يظهر أن توزيع حجم C. elegans EVs هو أحادي التشتت. يتم عرض الرسم البياني للمخزن المؤقت القاعدي S المستخدم لتخفيف العينات للمقارنة. (ب)مقارنة الخصائص الانكسارية لـ C. elegans وEVs ثقافة الخلايا البشرية المنقاة بالطرق الموضحة في هذا النص. كلا النوعين EV باستمرار عرض توزيعات التشتت ضوء قصيرة وطويلة الزاوية مماثلة (SALS و LALS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig5large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
وDI-8-ANEPPS تسميات قوية C. elegans EVs، وتسليط الضوء باستمرار على غالبية من مجموع الأحداث في كل من Elegans C. وثقافة الخلية عينات مشتقة. يتم تقديم حبات المعايرة وعناصر التحكم في الشكل 6A. يتم عرض قطع الأراضي الفردية المتناثرة FACS من عينة C. elegans أعدت من 200،000 الحيوانات (#1) واثنين من أعدت من 500،000 الحيوانات(الشكل 6باء). كما تم تحليل المركبات الكهربائية من 100 مل (#1) أو 200 مل (#2،3) من ثقافة الخلية(الشكل 6C). وأظهرت كل من C. elegans وثقافة الخلايا عينات مشتقة الأحداث الفلورية وفيرة التي اختفت عند التعامل مع 0.05٪ تريتون X 100 وسونيكيشن الخفيفة. وهذا يدل على أن الأحداث المسماة هي هياكل فوسفوليبيد المنظفات (الحويصلات) بدلا من المنظفات غير الحساسة المجاميع البروتين الدهني الصلب. يتم حساب وفرة EV كالفرق بين عدد الأحداث في بوابة DI-8-ANEPPS+ بين الكسور بدون منظفات (-) ومع المنظفات (+) ناقص الأحداث في عنصر التحكم Dye فقط. وللوضوح، تُلخص البيانات المقدمة بشكل فردي في الشكل 6باء والشكل 6جيم كرسوم بيانية شريطية في الشكل 6دال والشكل 6هاء. وفرة من السيارات الكهربائية المنقى لم يكن مختلفا بشكل ملحوظ بين C. elegans وثقافة الخلية المستمدة الاستعدادات(الشكل 6واو).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig6.jpg"> الشكل 6: أمثلة على بيانات قياس الخلايا المتدفقة المستخدمة لحساب وفرة EV. (أ)لضمان أن عدد الأحداث يمكن مقارنته مباشرة بين العينات، يجب تشغيل عناصر التحكم المخزن المؤقت والصبغة فقط بنفس معدل التدفق ووقت التجميع مثل كسور عينة EV. هناك عدد قليل جدا من الأحداث في بوابة DI-8-ANEPPS. (ب)النتائج التمثيلية لDI-8-ANEPPS وبروتوكول معالجة المنظفات من C. elegans. وتظهر ثلاث يكرر البيولوجية. وقد تم إعداد #1 البيولوجية المتكررة من 000 200 من الحيوانات في حين تم إعداد #2 #3 من 000 500 من الحيوانات. اختفاء المركبات الكهربائية مع علاج المنظفات واضح في جميع الحالات. (C)النتائج التمثيلية لDI-8-ANEPPS وبروتوكول معالجة المنظفات باستخدام الوسائط المكيفة لثقافة الخلايا البشرية. تم إعداد اليكرر البيولوجي #1 #2 من 200 مل من الوسائط المكيفة بينما تم إعداد #3 التكرار البيولوجي من 100 مل. (D)شريط الرسم البياني للبيانات التي تم جمعها من النسخ البيولوجية الثلاث من السيارات الكهربائية C. elegans. أشرطة الخطأ = S.E.M. إقران اثنين من الذيل تي الاختبارات بين العلاجات. = قيمة p < 0.001. (E)شريط الرسم البياني للبيانات التي تم جمعها من النسخ البيولوجية الثلاثة من ثقافة الخلية المستمدة EVs. إقران اختبارات تي ذيلتين بين العلاجات. = قيمة p < 0.001(F)تم حساب عدد الأحداث الحساسة للمنظفات المسماة بالصبغة لكل ميكرولتر لجميع النسخ البيولوجية لـ C. elegans وثقافة الخلايا. القيم بين مصدري عينة EV لا تختلف بشكل ملحوظ. إقران اختبارات t ذيلين بين قيمة العلاجات p = 0.685. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig6large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
يحتوي الجدول 1 على القيم التجريبية الخام للـ 4.5 ميكرولتر كاملة من كل نوع عينة تم تحليلها. كان العدد الإجمالي للأحداث التي تم جمعها من كسور EV المنقى من 500,000 الحيوانات 10-20x على عدد الخلفية من الجسيمات التي تم جمعها عن طريق المخزن المؤقت وحده في حين أن الكسر المنقى من 200,000 الحيوانات يحتوي على حوالي 2x كما العديد من الأحداث كما عازلة وحدها. كما يظهر عدد الأحداث داخل بوابة DI-8-ANEPPS+ لكل عينة. يمكن استيراد هذه المقاييس إلى جدول بيانات لحساب عدد المركبات الكهربائية الإيجابية للصبغة والمنظفات الحساسة كما هو موضح أعلاه. على سبيل المثال، سيتم حساب عدد المركبات الكهربائية في 1 مل من التكرار البيولوجي C. elegans المبين ة على هذا النحو:
(18,974 – 3,853 - 1,487) × (10/4.5) × 1,000 = 30,297,778.
الجدول 1: بيانات قياس الخلايا المتدفقة المجدولة. يتم تقديم البيانات المعروضة في الشكل 6 كجدول بيانات. لكل عينة يتم عرض إجمالي الأحداث والأحداث المسورة DI-8-ANEPPS+ . يتم ترتيب كل تكرار بيولوجي بترتيب العينات #1-3 في البروتوكول. تكشف هذه المقاييس أن العدد الإجمالي للأحداث التي تم جمعها من عينات C. elegans التي تم إعدادها من 500,000 الحيوانات أو 200 مل من الوسائط المكيفة في ثقافة الخلايا كان 10-20x على عدد الخلفية من الجسيمات التي تم جمعها عن طريق المخزن المؤقت وحده في حين أن التكرار البيولوجي المنقى من 200,000 الحيوانات يحتوي على حوالي 2xمثل العديد من الأحداث الإجمالية كعازل وحده. كما يظهر عدد الأحداث داخل بوابة DI-8-ANEPPS+ لكل عينة. يمكن تصدير هذه المقاييس إلى جدول بيانات لحساب العدد الإجمالي للمركبات الكهربائية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/Table1.xlsx" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على الحق للتحميل).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles at JoVE.com

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

تعرض هذه المقالة أساليب لتوليد وتنقية وقياس الحويصلات Caenorhabditis elegans خارج الخلية.

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

وقد افتقر حقل الحويصلات خارج الخلية إلى نموذج اللافقاريات القابلة للخلود وراثياً لدراسة إشارات البروتين والرنا من الحويصلات خارج الخلية. هذا البروتوكول يؤسس أساليب الحصول على وفيرة، حويصلات خارج الخلية نقية من C.elegans. وهذا يكفي لتحليل RNA-SEQ والبروتيوم القوي.عندما تكون الثقافة المتزامنة C.elegans قد استنفدت الغذاء من لوحة متوسطة النمو الطبيعي، واستخدام العصابات المطاطية لتأمين خمسة ميكرومتر مرشح شبكة نايلون غطاء على زجاجة معقمة والبدء في فراغ. صب الديدان L1 على المرشح وتمرير وحدة تخزين متساوية من المتوسط على المجاميع دودة. بعد دوامة، نقل ثلاثة 10 ميكرولتر مجلدات من تعليق دودة على غطاء لوحة زراعة دودة وعدد الحيوانات في كل قطرة.ضبط تعليق دودة إلى اثنين من الحيوانات لكل ميكرولتر من المتوسطة الطازجة ودوامة تعليق مرة أخرى. بعد ذلك ، أضف تسعة ، 10 قطرات ميكرولتر من الديدان على غطاء لوحة جديدة ، وتحسب يدويا عدد الحيوانات في كل قطرة. ثم حساب متوسط والخطأ القياسي للمتوسط كنسبة مئوية من كل مجموعة من الديدان وحساب العدد الإجمالي للحيوانات في كل مجموعة.لإعداد الديدان لتوليد إفرازات، وغسل الديدان مع ثلاثة يغسل خمس دقائق في 15 ملليلتر من M9 المتوسطة العقيمة مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من كاربينسيلين لكل لوحة في غسل مع دوامة لطيف لإزاحة الديدان، وتجميع يغسل في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. بعد الغسيل الأخير، تمييع الديدان إلى واحد لكل ميكرولتر من محلول S-Basel مكمّل بـ 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكوليسترول و50 تركيز كربنيسيلين ميكرومولار. ثم إضافة ما يصل إلى 400 ملليلتر من تعليق دودة إلى قارورة معقمتين قاع لترين في حيرة.ضع القارورة على دوار دائري عند 20 درجة مئوية و 100 دوران في الدقيقة لمدة 24 ساعة. بالنسبة لحصاد الحويضات خارج الخلية، قم بنقل الديدان في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر للطرد المركزي و ديسانت الماذر من خلال فلتر فراغ 0.22 ميكرومتر لإزالة أي حطام جسيمات. بعد العد، ضع قطرة من الديدان المعلقة على حديقة بكتيرية وسجل الحيوانات على أنها تتحرك أو مشلولة أو ميتة بعد 15 دقيقة.المقبل، والتركيز على السوبر المصفاة إلى 700 ميكرولترات مع نيتروسيلولوز تجديد 10 كيلودالتون الجزيئية خفض الوزن مرشح وإضافة 150 ميكرولترات من حل S بازل الطازجة للحد. تصفية ودوامة الحل الناتج وتكرار التخفيض والترشيح مرتين أكثر كما هو موضح للتو. بعد الترشيح الأخير، الطرد المركزي فائق لإزالة أي الجزيئات والحطام التي قد تراكمت أثناء المناولة وإضافة كوكتيل مثبطات البروتياز بالإضافة إلى EDTA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.لإعداد عمود استبعاد الحجم، decant 15 ملليلتر من الراتنج agarose مع وقف التنفيذ في خرطوشة عمود تدفق الجاذبية الفارغة. عندما ينضب العمود، إضافة محلول S-بازل حتى يتم حزم سرير الراتنج في حجم النهائي من 10 ملليلتر. استبدال العازلة الراتنج مع 40 ملليلتر من محلول S-بازل معقم المصفاة، مع الحرص على عدم إزعاج الراتنج، والسماح للجاذبية لاستنزاف العازلة من خلال العمود.مرة واحدة في الجزء العلوي من الراتنج لم يعد مغمورة، قبعة الجزء السفلي من خرطوشة لوقف تدفق ووضع أنبوب جمع تحت العمود. لبدء تجزئة إفرازات، وإزالة الغطاء وإضافة فورا حل secretome المركزة قطرة الحكمة إلى الجزء العلوي من السرير العمود، تليها إضافة ملليلتر واحد من حل S-بازل قطرة الحكمة. ضع أنبوب جمع جديد تحت العمود وملء خزان العمود العلوي ببطء بخمسة ملليلترات من محلول S-Basel.بعد جمع أول ملليلترين من الزاوي، بسرعة تغيير الأنابيب لجمع المليلتر الأربعة المقبلة. استخدام nitrocellulose مجددة 10 كيلودالتون الجزيئية خفض الوزن الجزيئية خفض فلتر الدوران لتركيز في vesicle خارج الخلية التي تحتوي على مسيل العمود إلى 300 microliters ونقل إعادة فلتر إلى انخفاض ربط microcentrifuge أنبوب. ثم غسل غشاء مرشح مرتين مع 100 ميكرولترات من محلول S-بازل في 20 ثانية من دوامة لكل غسل والجمع بين يغسل مع إعادة الأصلي لحجم العينة النهائية من 500 ميكرولترات.لإعداد العويصلات خارج الخلية للقياس الكمي عن طريق تحليل التدفق الخلوي، أضف 840 ميكرولترات من محلول S-Basel و60 ميكرولترات من العويصلات الخارجية النقية إلى أنبوب ميكروفيرج. إضافة 300 ميكرولترات من العينة في اثنين من أنابيب microcentuge إضافية جنبا إلى جنب مع سبعة ميكرولترات من المسبار القوي المناسب لكل أنبوب. إضافة سبعة ميكروليتر من 1٪ تريتون X-100 إلى أنبوب الماضي وخلط جميع الأنابيب عن طريق دوامة.وضع طرف sonicator في وسط أنبوب العينة الثالثة ونبض العينة 10 مرات في 20 ٪ والسلطة ودورة 30 ٪ واجب. المقبل، إضافة 300 ميكرولترات من حل S-بازل لاثنين من أنابيب التحكم microcentrifuge وإضافة سبعة ميكرولترات من المسبار إلى أنبوب صبغ فقط. تسمية الأنبوب الثاني المخزن المؤقت فقط.ثم احتضان جميع الأنابيب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء قبل تحليلها عن طريق تدفق cytometry وفقا للبروتوكولات القياسية. لتحليل البيانات، افتح الملفات في برنامج التحليل السيتوميتري المناسب للتدفق. تعيين بوابة مستطيلة تبدأ من أعلى المؤامرة تمتد من زاوية صغيرة ضوء مبعثر مستوى في مرة واحدة 10 إلى اثنين إلى واحد مرات 10 إلى الأربعة وبذلك البوابة إلى أسفل حتى أنه يحتوي على حوالي 2.5٪ من مجموع الأحداث.اسم البوابة بعد التحقيق ونسخ ولصق البوابة على العينتين الأخرى والسيطرة على المؤامرات البيانات. ثم قم بتصدير التحليل إلى جدول بيانات. هنا، تظهر النتائج التمثيلية من 10 تكرارات بيولوجية.التقلبات بين تكرارات ليس كبيرة والخطأ نموذجيّة معياريّة من الوسط من الالسّكان حجم قليلا على 10٪ ينتج نقل الحيوانات بين صفائح في حوالي 10٪ خسارة الحيوانات, بينما حوالي 20٪ من الحيوانات يكون خسرت في ال [سكروس] تعويم خطوة. في المتوسط، سيفرز 1000 من النوع البري من الشباب الصغار ميكروغرام واحد من البروتينات أكبر من 10 كيلودالتون في بيئتهم. عندما يتم فصل هذا الكسر كذلك بواسطة الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم، فإن إجمالي ميل البروتين يوضح ذروة بروتين صغيرة بين ملليلترين إلى ستة وذرية كبيرة بعد ثمانية ملليلتر.يتم احتواء العُيَضَل خارج الخلية داخل المليلترات الخمسة الأولى من رُحَل العمود. في مقارنة مباشرة من خصائص تدفق الخلايا بين C.elegans والضويصلات خارج الخلية البشرية، وهو مدرج بياني من C.elegans الأحداث عينة من الخلايا خارج الخلية، وفرزها من زاوية صغيرة مبعثر ضوء، ويبين أن جميع الاستعدادات الذروة في شدة الفلورانس المتوسط من حوالي مرة واحدة مرة إلى الثالثة. المسبار القوي DI-8-ANEPPS، تسميات بقوة C.elegans خارج الخلية vesicles ووفرة من الخلايا الخارجة عن الخلية المنقى فرزها من قبل التعبير DI-8-ANEPPS لا تختلف اختلافا كبيرا بين C.elegans وثقافة الخلية المستمدة من الاستعدادات.العينات التي أعدتها هذه العملية قابلة لجميع أساليب تحليل الخلايا خارج الخلية المصبية النموذجية، بما في ذلك الحمض النووي الريبي-SEQ، وقياس الخلايا التدفقي، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية، وتحليل البروتيوم. إن إنشاء طرق لتنقية الحويصلات خارج الخلية من C.elegans يسمح للباحثين باستخدام هذا النموذج اللافقاري البسيط لدراسة المسارات الوراثية والعمليات الفسيولوجية التي تؤثر على تكوين شحنة الحويصلات خارج الخلية.

Research

JoVE Journal

Biology

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

والعزلة في المختبر تفعيل انواع معينة ايليجانس الحيوانات المنوية

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

مصاصة للدماء العزل من السائل خارج الخلية من<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

استخراج البروستاجلاندين والتحليل في<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

تحليل سيتوميتريك من حويصلات خارج الخلية من خلية مكيفة وسائل الإعلام تدفق

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد كمي وحجم الحويصلات خارج الخلية

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

أتمتة القياس الكمي الكلي في Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...