Name: purification and analysis of caenorhabditis elegans extracellular vesicles
Uploaded: 2020-03-31T13:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles at JoVE.com

Wir danken Nick Terzopoulos für Wurmplatten und Reagenzien; das Caenorhabditis Genetics Center (CGC) am NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) für die Nematodenlinie N2; Lucia Vojtech, PhD, für Unterstützung bei der Nanopartikel-Tracking-Analyse; Jessica Young, PhD, und Marie Claire, MD, PhD, für hiPSC-abgeleitete neuronale konditionierte Zellmedien; Wai Pang für Unterstützung bei der TEM-Bildgebung. Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss P30AG013280 an MK und den NIH-Zuschuss AG054098 an JCR unterstützt.

1. Vorbereitung
<ol><li>Fügen Sie 2 g Gelatine auf 100 ml dH2O und erhitzen Sie in der Mikrowelle, bis es zu kochen beginnt. Dann rühren und 20 min abkühlen lassen.</li>
	<li>Übergeben Sie die Lösung durch einen 0,22 m Filter und geben Sie sie in sterile Schläuche. Pipette-Spitzen unmittelbar vor dem Einsatz mit Gelatine behandeln, indem Sie die Gelatinelösung aufpeppen und austreiben. Behandelte Tipps können entweder sofort verwendet oder gespeichert werden.</li>
	<li>Schneiden Sie die Membran aus einem sterilen Kappenfilter aus.</li>
	<li>Befeuchten Sie ein 20 cm großes Quadrat aus 5 'm Nylon-Mesh-Gewebe und legen Sie es um die Oberseite eines sterilen Kappenfilters. Sichern Sie es mit mehreren dicken Gummibändern. VORSICHT: Prüfen Sie den Stoff sorgfältig, um sicherzustellen, dass es keine Falten gibt. Diese machen Luftspalten, die das Absaugen behindern.</li>
</ol>2. Berechnung großer Würmerpopulationen (Abbildung 1A)
<ol><li>Vortex und Pipette 10 l der Schneckensuspension auf einen Wurmanbauplattendeckel oder eine Glasrutsche. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3x. Zeichnen Sie die Anzahl der Tiere in jedem Tropfen auf.</li>
	<li>Passen Sie die Wurmsuspension auf zwei Tiere pro L an.</li>
	<li>Wirbeldiel die Suspension und Pipette neun Tropfen (10 l) auf einem Schieber oder einem Plattendeckel. Zählen Sie manuell die Anzahl der Tiere. Zeichnen Sie die Anzahl der Tiere in jedem Tropfen auf.</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts (S.E.M.) als Prozentsatz jeder Wurmpopulation.</li>
	<li>Berechnen Sie die Gesamtzahl der Tiere in jeder Population, indem Sie den Mittelwert durch 10 l dividieren und dann mit dem Gesamtvolumen der Wurmsuspension in L multiplizieren.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig1.jpg"> Abbildung 1: Verfahrensübersichten zum Generieren, Quantifizieren und Reinigen von C. elegans-EVs. (A) Schematisch für die Zählung großer Tierpopulationen. (B) Schematisch zur Erzeugung von Würmern zur Ernte von Elektrofahrzeugen. (C) Schemazurd zur Reinigung von Elektrofahrzeugen von C. elegans überlagert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
3. Kultivierung von C. elegans für die EV-Reinigung
<ol><li>Generieren Sie eine große Population von entwicklungssynchronisierten C. elegans. Führen Sie dazu die folgenden Schritte aus.<ol>
<li>Fügen Sie ein einzelnes Tier auf eine 6 cm normale Wachstumsmedienplatte. Zwei Generationen lang brüten und dann auf zwei wachstumsstarke Mittelplatten waschen.</li>
		<li>Inkubieren, bis die Würmer die Nahrung erschöpft haben.</li>
		<li>Filtern Sie L1-Würmer mit 5'm Nylongewebe, die in Schritt 1.4 hergestellt werden. Legen Sie den Schraubverschluss auf die sterile Flasche, starten Sie das Vakuum und gießen Sie Würmer über den Filter. Übergeben Sie das gleiche Volumen des Mediums über die Wurmaggregate auf dem Filter.</li>
		<li>Quantifizieren Sie die Würmer und berechnen Sie die Gesamtzahl (siehe Schritt 2). Kürzlich verhungerte (<24 h) Würmer, die auf einer hohen Wachstumsplatte angebaut werden, führen zu etwa 80.000 L1-Larven.</li>
		<li>Zentrifuge L1-Larven bei 2.000 x g für 3 min. Auf 100.000 Tiere pro ml resuspendieren.</li>
		<li>Platzieren Sie 50.000 Tiere pro Wachstumsplatte. Pflegen Sie die Tiere bei 20 °C, bis sie gravid Erwachsene sind (ca. 72 h).</li>
		<li>Bleichen Sie die gravid Erwachsenen mit Standardmitteln und lassen Sie Embryonen in 10 ml S Basal-Lösung mit 2,5 g/ml Cholesterin schlüpfen.</li>
		<li>Quantifizieren Sie L1-Larven (siehe Schritt 2) und fügen Sie dann 50.000 Würmer zu jeder hochwachstumsplatte hinzu.</li>
		<li>Bewirtschaften Sie Teller bei 20 °C, bis tiere junge Erwachsene sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie C. elegans für die Sekrelom-Generation vor.<ol>
<li>Waschen Sie Würmer von Platten, indem Sie 15 ml steriles M9 mit 50 g/ml Carbenicillin zu jeder hochgewachsenen Platte hinzufügen. Lassen Sie die gesättigten Platten für 5 min sitzen. Lösen Sie Würmer, indem Sie den Puffer um die Platte kreisen. Vermeiden Sie Schleudern. Gießen Sie den Puffer von jeder Platte in ein separates 50 ml konisches Rohr. Wiederholen Sie den Waschschritt 2x mehr für insgesamt 45 ml Puffer pro Platte.</li>
		<li>Lassen Sie die Würmer für 15 min. Dekant den Überstand und fügen Sie 50 ml frischen M9 Puffer in die Röhre. Wiederholen Sie dies für insgesamt 4x.</li>
		<li>Die Würmer auf einem 30%igen Saccharose-Schrittgradienten schweben lassen und Tiere in der S Basal Lösung24bergen.<ol>
<li>Die Würmer in 15 ml eiskaltem 100 mM NaCl kurz wieder aufsetzen, 15 ml eiskalte 60%-Saccharose hinzufügen und invertieren, um sie zu mischen. Mit einer Glaspipette legen sie 5 ml eiskalte 100 mM NaCl auf der Oberseite der Saccharosemischung sanft schichten.</li>
			<li>Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 min. Worms wird an der Schnittstelle zwischen NaCl und Saccharose konzentriert.</li>
			<li>Die Tiere vorsichtig von der Schnittstelle in ein neues 50 ml kegelförmiges Rohr auspfeifen. S Basal-Lösung auf 50 ml erhöhen. Würmer 5 min absetzen lassen.</li>
			<li>Dekantieren Sie den Überstand und fügen Sie frische 50 ml S Basal Lösung hinzu. Wiederholen Sie dies mindestens 3x.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Quantifizieren Sie die Anzahl der Würmer, wie in Schritt 2 beschrieben.</li>
		<li>Setzen Sie die Würmer auf eine Dichte von einem Tier pro L mit steriler S Basal-Lösung mit 2,5 g/ml Cholesterin und 50 m Carbenicillin aus.</li>
		<li>Um die Probe für die Sekrelom-Generierung vorzubereiten, addieren Sie bis zu 400 ml der Suspension zu einem sterilen 2 L Boden-Baffled Kolben.</li>
		<li>Die Kolben auf den Kreisförmigen Rotator in einem 20 °C-Inkubator bei 100 U/min für 24 h legen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. EV-Reinigung
<ol><li>Ernte und Fraktionierung<ol>
<li>Entfernen Sie den 2L-Flaschen Würmer aus dem Inkubator und pellet die Tiere in 50 ml konischen Durchstechflaschen (500 x g für 2 min).</li>
		<li>Gießen Sie den Überstand durch einen 0,22 m-Vakuumfilter, um Partikelzureste zu entfernen. HINWEIS: An dieser Stelle kann der gefilterte Überstand, der das Sekretom und die Vesikel enthält, bei -80 °C gelagert werden.</li>
		<li>Zählen Sie die Anzahl der Tiere, wie in Schritt 2 beschrieben.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Würmer, indem Sie einen Tropfen hängender Würmer auf einen bakteriellen Rasen legen. Warten Sie 15 min und bewerten Sie tiere dann als bewegend, gelähmt oder tot.</li>
		<li>Konzentrieren Sie den 0,22 m gefilterten Überstand mit regenerierten Nitrocellulose 10 kDa-Filtereinheiten auf 700 l. Fügen Sie 150 L S Basal-Lösung und dann Pipette über den Filter und Wirbel. 2x wiederholen.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie den konzentrierten Überstand bei 18.000 x g für 20 min bei 4 °C und übertragen Sie den Überstand auf ein neues Rohr. Dieser Schritt entfernt mögliche Trümmer oder größere Partikel, die sich während der Handhabung angesammelt haben könnten.</li>
		<li>Fügen Sie den Protease-Hemmer-Cocktail + EDTA gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu. HINWEIS: An dieser Stelle kann der konzentrierte Überstand, der das Sekretom und die Vesikel enthält, bei -80 °C gelagert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Größenausschlusschromatographie<ol>
<li>Gießen Sie 80–200 m Agaroseharz (Porengrößenfraktionierungsbereich von 70.000 bis 40.000.000 kDa für Kugelproteine) in eine leere Gravitationsstromsäulenpatrone. Flow S Basal Lösung, bis das Harzbett mit einem Endvolumen von 10 ml verpackt ist. HINWEIS: Wenn zu viel Harz in die Säulenpatrone gegossen wird, dann dispergieren Sie die Oberseite der Säule und entfernen Sie den Überschuss mit einer Pipette.</li>
		<li>40 ml sterilgefilterte S Basal-Lösung durch die Säule passieren und unter Schwerkraft fließen lassen. VORSICHT: Stellen Sie fest, dass das Harz nicht gestört wird.</li>
		<li>Lassen Sie den Puffer fließen, bis die Oberseite des Harzes nicht untergetaucht ist, und verkapseln Sie dann den Boden der Säulenpatrone. Platzieren Sie ein Sammelrohr unter der Spalte.</li>
		<li>Entfernen Sie die kappe auf der Patrone. Fügen Sie das konzentrierte Sekretom, das sie in Schritt 2.1 erhalten hat, tropfenweise an die Spitze des Säulenbetts. Pipette 1 ml S Basal Lösung tropfenweise. Legen Sie ein frisches Sammelrohr unter die Spalte.</li>
		<li>Füllen Sie das obere Säulenreservoir langsam mit 5 ml S BasalLösung, um das Harz nicht zu stören. Sammeln Sie die ersten 2 ml Eluate dann schnell die Rohre wechseln und die nächsten 4 ml sammeln. Dies ist der Bruch, der für Elektrofahrzeuge angereichert ist.</li>
		<li>Konzentrieren Sie das Eluat auf 300 l mit einem regenerierten Nitrocellulose 10 kDa Molekulargewichts-Abschneidefilter (MWCO) und dem Transferretenat zu einem niedrig bindenden Mikrozentrifugenrohr.</li>
		<li>Waschen Sie die Filtermembran 2x mit 100 l S Basal Lösung, indem Sie 20 s wirbeln und den Puffer über den Filter pipetieren. Fügen Sie der Anfangsprobe ein Endvolumen von 500 l hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie Protease-Hemmer-Cocktail gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu.</li>
		<li>Führen Sie die nachgelagerten Experimente sofort durch (RNAseq, LC-MS-MS, GC-MS-MS, Western, FACS, etc.) oder lagern Sie bei -80 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Durchflusszytometrie Quantifizierung der EV-Fülle
<ol><li>Farbstoffzubereitung<ol>
<li>Bereiten Sie einen 10 mM Bestand an DI-8-ANEPPS mit frischem DMSO vor. In 10 L Aliquots verteilen und bei -20 °C lagern.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 1 mM Arbeitslösung vor, indem Sie 90 l sterilgefilterte PBS zu einem Rohr mit 10 l Farbstoffbestand hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Experimentelle Probenvorbereitung<ol>
<li>Fügen Sie 840 L S Basal Lösung in ein Mikrozentrifugenrohr. Fügen Sie dann 60 l der in Abschnitt 4.2 erzeugten gereinigten Elektrofahrzeuge und Wirbel hinzu.</li>
		<li>Aliquot 300 l der Probe in zwei neue Mikrozentrifugenröhrchen. Es gibt jetzt einen experimentellen Satz von drei Röhren, die jeweils 300 L verdünnte Elektrofahrzeuge enthalten. Beschriften Sie die Rohre #1–3. Zu Proben #2 und #3 7 L des DI-8-ANEPPS-Bestands hinzufügen, der in 5.1.2 hergestellt wurde. Dann fügen Sie 7 l von 1% Triton-X 100 zu Tuben #3. Mischen Sie jede Röhre durch Wirbel.</li>
		<li>Beschallungsprobe #3, indem Sie die Beschallungsspitze in der Mitte der Probe platzieren und 10 Mal bei 20% Leistung 30% Tastzyklus pulsieren. VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass sich die Spitze der Beschallungssonde in der Mitte der Probe befindet, damit die Schaumerzeugung auf ein Minimum reduziert wird. Schaum kann die Probe beeinträchtigen, indem er dazu führt, dass sich die Elektrofahrzeuge aggregieren.</li>
		<li>Fügen Sie zwei Mikrozentrifugenröhren 300 L S Basal-Lösung hinzu. Fügen Sie dem zweiten Rohr 7 l des in Schritt 5.1 hergestellten DI-8-ANNEPS-Arbeitsreagenzs hinzu und beschriften Sie "Dye Only". Beschriften Sie die andere Röhre "Nur Puffer". HINWEIS: Bereiten Sie die Kontrollproben nur "Dye" und "Puffer" und die experimentellen Proben mit derselben S-Basal-Quelle vor.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Proben weg vom direkten Licht und bei Raumtemperatur für 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie FACS-Experimente durch.<ol>
<li>Stellen Sie den FACS-Anregungsfilter auf 488 nm (blau) und den Emissionsfilter auf 605 nm (orange) ein. Stellen Sie den Durchfluss satz auf 1,5 l pro min ein.</li>
		<li>Führen Sie nanobead FACS Kalibrierungsmix (optional, aber empfohlen).</li>
		<li>Führen Sie jede Probe auf einer FACS-Maschine für 3 min (180 s). Notieren Sie sich die genauen Laufzeiten in Sekunden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analysieren Sie die FACS-Daten.<ol>
<li>Öffnen Sie die Dateien mit der FACS-Analysesoftware.</li>
		<li>Wechseln Sie die Y-Achse auf 488-Org (Bereich), indem Sie auf die Achseklicken und aus dem Dropdown-Menü auswählen.</li>
		<li>Legen Sie ein rechteckiges Tor an der Spitze des Grundstücks fest, das sich von SALS-Ebene 102 bis 104 (<300 nm große Partikel) erstreckt. Erweitern Sie das Tor nach unten, bis es 2,5 % der gesamten Ereignisse enthält. Benennen Sie das Gate "DI-8-ANEPPS+" Ereignisse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantifizierung der Proben-EV-Fülle
	<ol>
<li>Kopieren Sie dieses Gate und fügen Sie es in die anderen beiden Samples in Ihrem Experimentellen Set sowie in die Steuerelemente Buffer Only und Dye Only ein. Exportieren Sie die Analyse in eine Kalkulationstabelle.</li>
		<li>Wenn die FACS-Beispiele nicht für die empfohlenen 3 min (180 s) ausgeführt wurden, normalisieren Sie alle Ereignisanzahlen in der Probe auf Ereignisse pro 180 s. Wenn z. B. ein Beispiel für 250 s ausgeführt wurde, wird die DI-8-ANEPPS+-Ereignisnummer um 250 s/180 s skaliert.</li>
		<li>Entfernen Sie die Farbhintergrundereignisse, indem Sie die Anzahl der DI-8-ANEPPS+-Ereignisse im Dye Only-Steuerelement von denen in der #2 subtrahieren.</li>
		<li>Entfernen Sie Isotyp-Hintergrundereignisse, indem Sie die Anzahl der DI-8-ANEPPS+-Ereignisse in Beispiel#1 subtrahieren.</li>
		<li>Entfernen Sie waschmittelunempfindliche Ereignisse, indem Sie die Anzahl der DI-8-ANEPPS+-Ereignisse in der #3 subtrahieren. Dieser Wert ist die Anzahl der gutgläubigen Elektrofahrzeuge.</li>
		<li>Berechnen Sie die Anzahl der EVs in 1 L der Probe, indem Sie den in Schritt 5.5.5 berechneten Wert durch das in Der Stufe 5.3 analysierte Volumen (4,5 l) und multiplizieren mit dem Verdünnungsfaktor (10x wie in Schritt 2.5 beschrieben) dividieren. Multiplizieren Sie diesen Wert mit der Anzahl der in der EV-Vorbereitung verbleibenden L. Dies ist die Anzahl der Elektrofahrzeuge, die für die Nachflussanalyse verfügbar sind.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig2.jpg"> Abbildung 2: Schematische Probenvorbereitung der Durchflusszytometrie zur Quantifizierung der EV-Fülle. (A) Die EV-Zubereitung ist in drei identische Proben unterteilt. Probe Nr. 1 ist die Negative Kontrolle "No Dye". DI-8-ANEPPS wird dann den Proben #2 und #3 hinzugefügt. Triton-X 100 wird dann dem #3 hinzugefügt. Der grüne Pfeil zeigt an, dass nur #3 anschließend beschallt wird. Die Daten aus dem Durchfluss helfen, die absolute Anzahl der waschmittelempfindlichen Elektrofahrzeuge in den FACS-Proben zu bestimmen und dann die Häufigkeit von Elektrofahrzeugen in der Gesamtzubereitung zu berechnen. Das Tor zur Bestimmung von farbstoffpositiven Ereignissen wird mit Probe#1 gesetzt, die keinen Farbstoff enthält. Die rote Schrift auf den Tabellendaten soll veranschaulichen, dass farbstoffpositive Ereignisse aus der mit Reinigungsmitteln behandelten Probe mit Farbstoff von der Probe subtrahiert werden. (B) Gleichungen zur Quantifizierung von Elektrofahrzeugen in einer von FACS analysierten Stichprobe und Zur Berechnung der Gesamtzahl der Elektrofahrzeuge in der Stichprobe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<ol>
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+from+Caenorhabditis+elegans+for+multi-omic+analysis+[Internet].">Isolation and characterization of extracellular vesicles from Caenorhabditis elegans for multi-omic analysis [Internet].</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Eine grundlegende Herausforderung des EV-Bereichs ist die Trennung der Vielfalt der EV-Subtypen2. Die hier beschriebenen Methoden verwenden Filtration, Differentialzentrifugation und Größenausschlusschromatographie, um eine reine Population kleiner Elektrofahrzeuge zu erzeugen, da zuvor gezeigt wurde, dass 100 nm Elektrofahrzeuge in die äußere Umgebung abgesondert wurden und in physiologisch relevanten Kommunikationswegen funktionieren16. EVs, die durch Größenausschlusschromatographie gereinigt werden, können immer noch eine Mischung aus Exosomen und kleinen Mikrovesikeln sein, da diese EV-Unterklassen ähnlich dimensioniert sind. Wirbeltier-EV-Unterklassen werden häufig durch Immunpräzipitation getrennt, da diese Methode Elektrofahrzeuge durch Bindung an selektive Membranproteinmarker isoliert. Die beschriebenen Methoden erleichtern die Identifizierung von C. elegans EV Membranmarkerproteinen. Daher könnte es in Zukunft möglich sein, kleine EV-Unterklassen durch analoge Immunpräzipitierungsmethoden weiter zu trennen. Theoretisch könnte Die Immunpräzipitation EVs von gut gefütterten Würmern isolieren, da E. coli EVs nicht mit dem Antikörper interagieren sollten. Forscher, die daran interessiert sind, die Protein- und gengenetischen Ladungen größerer EV-Unterklassen (>200 nm) zu identifizieren, können dies tun, indem sie den Filterschritt von 0,22 m überspringen und dann das Pellet anstelle des Überstandes analysieren. Die Aufdeckung der Protein- und genetischen Ladungsmengen großer Elektrofahrzeuge wird ein umfassenderes Verständnis der physiologischen Prozesse schaffen, die durch das C. elegans-Sekrelom funktionieren. C. elegans EVs werden nicht nur in die Umwelt abgesondert, sondern auch intern zwischen Geweben übertragen. Daher isolieren diese Methoden nur eine Teilmenge der gesamten C. elegans EVs. Die Ladungsentdeckung interner Elektrofahrzeuge ist jedoch nicht möglich, da es keine Methode gibt, Um Elektrofahrzeuge von lysierten Würmern zu trennen. Die Frachtanalyse dieser extern abgesonderten EV-Teilmenge bietet eine Möglichkeit, potenzielle allgemeine EV-Proteinmarker zu identifizieren, die auch interne Elektrofahrzeuge kennzeichnen können.
Der Umfang der EV-Vorbereitung hängt von den Anforderungen des Experiments ab. Insgesamt 500.000 junge Erwachsene bieten genügend Elektrofahrzeuge für die parallele Durchführung von Durchflusszytometrie, LC-MS-MS und RNAseq-Analyse. Diese Zahl kann je nach experimentellem Bedarf nach oben oder unten skaliert werden. Der größte praktische Faktor für die Skalierung ist die Anzahl der benötigten 10 cm hohen Wachstumsplatten. Hochwachstumsplatten, die mit 500 L 20x konzentrierter NA22-Kultur über Nacht hergestellt werden, werden eine Bevölkerung von 50.000 Erwachsenen vom L1-Larvenstadium bis zum ersten Tag des Erwachsenenalters unterstützen. Um ein Experiment mit 500.000 Erwachsenen durchführen zu können, werden daher 13 Hochwachstumsplatten benötigt: eine Platte, um die Population von L1s zu erzeugen, zwei Platten, um die Erwachsenen zum Bleichen zu erzeugen, und 10 Platten für das Wachstum der Versuchstiere. Diese Metriken sind abhängig von den Saat- und Bakterienwachstumsbedingungen der hohen Wachstumsplatten. Daher wird empfohlen, alle Platten in standardisierter Weise herzustellen und dann mit bekannten Mengen von Tieren zu kalibrieren.
Würmer werden während des Kultivierungsprozesses in zwei Stufen gezählt: 1) vor der Aussaat von Würmern auf Tellern und 2) vor der Erzeugung der konditionierten Medien. Die Anbaudichte von Tieren hat gezeigt, dass sie das Verhalten, die Entwicklung und die Stressreaktionen15,16,17,18 beeinflusst und daher auch EV-Ladungen beeinflussen kann. Für eine gleichbleibende Anbaudichte ist es daher notwendig, die Wurmpopulationen genau abzuschätzen. Die Quantifizierung der Anzahl der Würmer in neun Tropfen gibt statistisches Vertrauen der Bevölkerungsschätzungen. Es ist wichtig, jeden Tropfen einzeln zu behandeln, zwischen jedem Tropfen zu wirbeln und die Pipette in der gleichen Entfernung in die Wurmsuspension einzufügen. Durch diese Vorsichtsmaßnahmen werden S.E.M.-Werte von 5–10 % der Gesamtbevölkerung sichergestellt. Wenn die S.E.M. für eine Wurmpopulation höher als 20% ist, dann ging etwas schief.
Nach der 24 h bakteriellen Inkubationszeit kriechen junge, wilde Typ C. Elegans sofort nach Zugabe zu einem bakteriellen Rasen. Dies deutet darauf hin, dass die Inkubation ihre Gesundheit nicht ernsthaft beeinträchtigt. Dieser Schritt beeinflusst jedoch die Physiologie der Tiere und kann daher die Zusammensetzung der EV-Ladungen beeinflussen. Daher ist es bei der Arbeit mit sehr kranken Genotypen oder älteren Tieren wichtig, die Lebensfähigkeit nach dem Inkubationsschritt zu überprüfen. Wenn alle Tiere die Inkubation nicht überleben, erhöhen Sie die experimentelle Populationsgröße und verringern Sie die Zeit der Inkubation. Bei der Arbeit mit großen Mengen konditionierter Medien ist es praktischer, einen Rührzellenkonzentrator mit einem Filter aus regenerierter Nitrocellulose zu verwenden. Elektrofahrzeuge binden diese Filterchemie nicht so stark wie andere Filtertypen14.
Das Verhältnis des gesamten Proteins, das aus den konditionierten Medien gewonnen wird, zur Anzahl der Tiere, die zur Herstellung der Zubereitung inkubiert werden, ist eine nützliche Metrik. Wenn dieses Verhältnis viel höher ist als erwartet, dann ist es möglich, dass die Populationsschätzungen ausfielen oder dass Tiere in den konditionierten Medien verendeten und sich verschlechterten. Wenn dieses Verhältnis viel niedriger als erwartet ist, dann kann ein Protein auf den Filtern während des Konzentrationsprozesses verloren gegangen sein. Während die FACS-Methoden die EVs in der Vorbereitung direkt quantifizieren, ist diese Metrik nützlich, da sie Stichprobenanomalien zu einem frühen Beginn des Prozesses hervorheben kann. Eine weitere nützliche Methode zur Überprüfung der Qualität der EV-Präparation ist die Transmissionselektronenmikroskopie, wie in Abbildung 4Ddargestellt. Obwohl das Protokoll für die Transmissionselektronenmikroskopie aufgrund der Länge formal nicht in diesem Methodenartikel enthalten ist, kann es mit Standardmethoden durchgeführt werden. Es wird empfohlen, diese Art der Analyse zumindest anfangs als ergänzende Methode für FACS zur Beurteilung der Qualität von EV-Präparaten durchzuführen. Für beste Ergebnisse verwenden Sie frisch entladene Formvar-Kohlenstoff-Gitter und färben Sie die Proben mit 2% Phosphotungssäure anstelle von Uranylacetat.
DI-8-ANEPPS wurde ausgewählt, weil es nachweislich EV-Membranen quantitativ kennzeichnen deuziert und andere allgemeine EV-Farbstoffe mit humanen Biopsieproben und Liposomen25übertrifft. Die Messungen sind schnell und nehmen nur 3 min Sammelzeit für jede Probe. Die Quantifizierung waschmittelempfindlicher Elektrofahrzeuge hat eine direkte funktionelle Bedeutung, da sie von einer grundlegenden physikalischen Unterscheidung zwischen Elektrofahrzeugen und festen Lipoproteinaggregaten profitiert. Wichtig ist, dass diese Methode nicht durch die Menge an Gesamtprotein oder die Anzahl der Nicht-EV-Aggregate beeinflusst wird und daher Elektrofahrzeuge, die durch verschiedene Reinigungsmethoden gewonnen werden, unvoreingenommen quantifizieren kann. Die FACS-verifizierte EV-Metrik, die wir hier beschreiben, wäre besonders hilfreich für Studien, die physiologische Auswirkungen gereinigter Elektrofahrzeuge nachweisen. Es könnte auch dem EV-Bereich im Allgemeinen zugute kommen, eine FACS-Methodik als universelle Metrik zu etablieren, damit absolute EV-Überflussmengen direkt über Studien hinweg verglichen werden können. Vitalfarbstoffe können auch C. elegans EVs kennzeichnen, aber sie sind nicht so hell wie Elektrofahrzeuge, die mit Di-8-ANEPPS beschriftet sind.
Dieser Reinigungsansatz profitiert von der aktiven Sekretion von Elektrofahrzeugen außerhalb der Körper intakter, lebender Würmer. Dies ermöglicht es C. elegans EVs, in vergleichbarer Reinheit und Fülle wie aus der Zellkultur isoliert zu werden, Spezifikationen, die ausreichen, um Hunderte von Protein- und RNA-Ladungen über LC-MS-MS und RNAseq-Analyse26zu identifizieren. So kann die große Bibliothek von Reagenzien, die für die C. elegans Forschung zur Verfügung stehen, genutzt werden, um den Einfluss der genetischen und physiologischen Störung auf die Zusammensetzung der EV-Ladung zu untersuchen.

Die Sekretion von membrangebundenen extrazellulären Vesikeln (EVs) erleichtert die globalen physiologischen Prozesse, indem bestimmte Protein-, Nukleinsäure-, Metaboliten- und Lipidladungen aktiv zwischen den Zellen1transportiert werden. Zellen sezernieren Elektrofahrzeuge, die ein Kontinuum von Größen von 2 m oder größer bis zu 20nm2umfassen. Kleine Elektrofahrzeuge (<200 nm) werden zunehmend untersucht, weil sie sich auf pathologische Prozesse, einschließlich Stoffwechselstörungen, Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, und neurodegenerative Erkrankungen3,4,5. Diese Pathologien haben auch gezeigt, dass die Protein-und genetische Zusammensetzung der EVs Ladungen von kleinen Elektrofahrzeugen beeinflussen. Daher werden Biomarkersignaturen der Pathologie zunehmend durch EV-Frachtermittlungsmethoden wie LC-MS-MS und RNAseq6,7,8,9aufgedeckt.
C. elegans war ein nützliches wirbelloses Modell zur Identifizierung evolutionär konservierter EV-Signalwege. Zum Beispiel wurde eine C. elegans flippase zuerst gezeigt, um die EV-Biogenese in C. elegans Embryonen zu induzieren, und der menschliche Homolog wurde gezeigt, dass er die Freisetzung von EV in menschlichen Zellenbeeinflusst 10,11. C. elegans EVs wurden berichtet, Igel-Signale zu tragen, die für die Entwicklung von Cuticle notwendig sind. Die Lieferung von Igel und andere Morphogene wurde gezeigt, dass eine wichtige Entwicklungsrolle von Elektrofahrzeugen zu spielen, und es ist in Zebrafischen, Mäusen und Menschenkonserviert 12,13,14,15. C. elegans eignet sich gut für die Entdeckung von EV-Biomarkern, da es Elektrofahrzeuge außerhalb seines Körpers absondert, die in der Kommunikation von Mensch zu Tier funktionieren16,17 (Abbildung 1A). Die in einer früheren Studie eingeführte Methodik kann jedoch nicht angewandt werden, da die E. coli-Lebensmittelquelle der Nematoden auch EVs18absondert. Bei dieser Methode besteht der größte Teil der Probe aus E. coli-Kontamination, die die Leistung von proteomischen oder RNAseq-Ansätzen für die Entdeckung von C. elegans EV-Ladungen begrenzt. Die hier beschriebenen Methoden wurden entwickelt, um hochreine C. elegans EVs auf Überflussniveaus zu ergeben, die für typische Zellkulturexperimente charakteristisch sind, und so omics Ansätze für die EV-Biomarker-Entdeckung zu erleichtern.
Große Populationen von Würmern werden benötigt, um eine ausreichende Anzahl von Elektrofahrzeugen für die Frachtanalyse zu generieren. Daher sind auch Methoden zur quantitativen Kultivierung großer Populationen entwicklungssynchronisierter C. elegans enthalten. Wenn eine große Anzahl von Würmern für Experimente benötigt wird, werden sie in flüssigen Medien kultiviert. Während dies wirksam ist, um große Populationen von Würmern zu erzeugen, unterscheidet sich die Physiologie der Tiere erheblich von Würmern, die unter Standardbedingungen auf Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) Agarplatten angebaut werden. Tiere, die in Flüssigkeit kultiviert werden, wachsen langsamer, sind dünner, zeigen entwicklungsfördernde Heterogenität und sind einem hohen Maß an Batchvariabilität ausgesetzt. Daher präsentieren wir ein einfaches, aber effektives Mittel für die quantitative Kultivierung großer Populationen entwicklungssynchronisierter C. elegans mit 10 cm hohen Wachstumsplatten. Die Medienzusammensetzung von Hochwachstumsplatten enthält mehr Pepton als normale NGM-Platten und wird mit dem E. coli-Stamm NA22 gesät, der robuster wächst als OP50.
Fortschritte in der Durchflusszytometrietechnologie (FACS) haben die direkte Analyse einzelner Elektrofahrzeuge20,21ermöglicht, um die Quantifizierung von Elektrofahrzeugen ohne die inhärenten Einschränkungen anderer Methoden zu ermöglichen. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Protein kein nützlicher Proxy für die EV-Fülle ist, da unterschiedliche Reinigungsmethoden zu deutlich unterschiedlichen EV-Protein-Verhältnissen führen22. Extrem reine EV-Fraktionen enthalten relativ wenig Protein, was es schwierig macht, Proben mit BCA- oder Coomassie-Gelen zu quantifizieren. Westliche Analysen können relative Unterschiede einzelner Proteine identifizieren, aber nicht identifizieren, wie viele Elektrofahrzeuge sich in der Stichprobe befinden. Die robuste Quantifizierung der EV-Zahl durch Nanopartikel-Tracking-Analyse wird durch ihren engen Signal-Rausch-Bereich, die Unfähigkeit, zwischen Elektrofahrzeugen und festen Aggregaten zu unterscheiden, und die mangelnde Übertragbarkeit von Methoden zwischen Instrumenten mit unterschiedlichen Spezifikationen behindert23. Daher enthält dieser Artikel auch ein verallgemeinerbares zytometrisches Verfahren zur Unterscheidung und Quantifizierung von Elektrofahrzeugen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="791">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">0.22 filters units</td>
			<td style="width:107px;">Genesee</td>
			<td style="width:115px;">25-233</td>
			<td style="width:327px;">For clairifying the conditioned media from debris</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">1% solution of Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">HFH10</td>
			<td>Add this to 0.05 % to lyse EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">10 cm high growth plates</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">N/A</td>
			<td>For cultivating large populations of worms</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">2-liter bottom baffled flasks</td>
			<td style="width:107px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">4110-2000PK</td>
			<td>For conducting size exclusion separation of EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">40 &#956;m mesh</td>
			<td style="width:107px;">Amazon</td>
			<td style="width:115px;">CMY-0040-C/5PK-05</td>
			<td>Use this to separate adult worms from larval stages</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">5 &#956;m mesh</td>
			<td style="width:107px;">Amazon</td>
			<td style="width:115px;">CMN-0005-C</td>
			<td>Use this to separate L1s from other worm stages</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">6 cm normal growth medium worm cultivation plate</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">N/A</td>
			<td>For cultivating small populations of worms</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">C7715</td>
			<td>For concentrating the size exclusion elute</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">C78144</td>
			<td>For concentrating the conditioned media</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Apogee A50 flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Apogee</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">ApogeeMix</td>
			<td style="width:107px;">Apogee</td>
			<td style="width:115px;">1493</td>
			<td>Assess light scatter and fluorescence performance of FACS</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">DI-8-ANEPPS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3167</td>
			<td>Add this at 20 uM to label EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Disposable chromatography Column</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:115px;">7321010</td>
			<td>For conducting size exclusion separation of EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Geletin</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">G9391-100G</td>
			<td>To treat pipette tips so that worms do not stick</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">HALT protease inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">87785</td>
			<td>Add to EV sample to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Low-protein binding collection tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>90410</td>
			<td>Use these for EV samples</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>For sucrose floatation of worms</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">S Basal buffer</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">N/A</td>
			<td>Recipe in WormBook</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Sepharose CL-2B resin</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">CL2B300-100ML</td>
			<td>For conducting size exclusion separation of EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Small orbital shaker</td>
			<td style="width:107px;">ABC Scientific</td>
			<td>83211301</td>
			<td>Use this for worm S Basal incubation</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Sucrose</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td>For sucrose floatation of worms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and analysis of caenorhabditis elegans extracellular vesicles

Die Sekretion kleiner membrangebundener Vesikel in die äußere Umgebung ist ein grundlegender physiologischer Prozess aller Zellen. Diese extrazellulären Vesikel (EVs) funktionieren außerhalb der Zelle, um globale physiologische Prozesse zu regulieren, indem sie Proteine, Nukleinsäuren, Metaboliten und Lipide zwischen Geweben übertragen. Elektrofahrzeuge spiegeln den physiologischen Zustand ihrer Ursprungszellen wider. Elektrofahrzeuge sind damit verpflichtet, in praktisch jedem Aspekt der menschlichen Gesundheit eine grundlegende Rolle zu spielen. So werden EV-Protein eis- und genetische Ladungen zunehmend auf Biomarker von Gesundheit und Krankheit analysiert. Dem EV-Bereich fehlt jedoch noch ein transportables Wirbellosenmodellsystem, das die Untersuchung der Zusammensetzung der EV-Ladung ermöglicht. C. elegans eignet sich gut für die EV-Forschung, da es Elektrofahrzeuge außerhalb seines Körpers aktiv in seine äußere Umgebung absondert, was eine einfache Isolation ermöglicht. Dieser Artikel enthält alle notwendigen Informationen zum Generieren, Reinigen und Quantifizieren dieser ökologisch abgesonderten C. elegans EVs, einschließlich der quantitativen Arbeit mit sehr großen Populationen alterssynchronisierter Würmer, reinigender Elektrofahrzeuge und eines Flow-Zytometrie-Protokolls, das direkt die Anzahl intakter Elektrofahrzeuge in der gereinigten Probe misst. So kann die große Bibliothek genetischer Reagenzien, die für die C. elegans-Forschung zur Verfügung stehen, für die Untersuchung der Auswirkungen genetischer Pfade und physiologischer Prozesse auf die Zusammensetzung von EV-Ladungen erschlossen werden.

Ein Schaltplan für die Prozesse, die zum Generieren und Reinigen von Elektrofahrzeugen erforderlich sind, ist in Abbildung 1dargestellt. Die typischen Zeiten, die zum Abschließen der einzelnen Schritte erforderlich sind, werden unten angezeigt. Abbildung 2 zeigt einen Schaltplan für die Vorbereitung von Proben für die FACS-Analyse mit DI-8-ANEPPS (Abbildung 2A) sowie die Berechnungen, die erforderlich sind, um die Gesamtzahl der Elektrofahrzeuge in einer Stichprobe zu schätzen (Abbildung 2B).
Repräsentative Ergebnisse aus 10 biologischen Replikationen sind in Abbildung 3Adargestellt. Die Variabilität zwischen den Replikationen ist nicht signifikant und die typische S.E.M. der Bevölkerungsgröße beträgt etwas mehr als 10 % (Abbildung 3B). Das Filtern der Würmer und das Kultivieren auf den frischen Hochwachstumsplatten erzeugt eine große Population von Gravid Erwachsenen, die für die Bleichsynchronisation geeignet sind. Eine einzelne ausgehungerte Platte, die auf diese Weise verarbeitet wird, kann eine experimentelle Population von 1 x 106 oder mehr synchronisierten Nachkommen erzeugen, da jeder gravid Erwachsene etwa 10 Eier enthalten wird. Es ist möglich, große Populationen von entwicklungssynchronisierten Populationen zu erhalten, indem Eier und Larven durch einen 40-mm-Filter gefiltert werden, um Elektrofahrzeuge von älteren Tieren zu erhalten. Zurückgehaltene Erwachsene werden auf frische Hochwuchsplatten mit einer Dichte von 20.000 Tieren pro Platte übertragen. Dieser Vorgang wurde alle 2 Tage wiederholt. Abbildung 3C zeigt drei biologische Replikationen von Wurmpopulationen, die über drei Plattenübertragungen verschoben werden. Die Übertragung von Tieren zwischen Platten führt zu einem Verlust von etwa 10 % der Tiere(Abbildung 3C), während etwa 20 % der Tiere im Sukzessatratschritt verloren gehen (Abbildung 3D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig3a.jpg"> Abbildung 3: Quantifizierung großer Populationen von C. eleganen für die EV-Analyse. (A) Ein Vergleich der Anzahl der L1-Larvenstadiumwürmer, die von einer einzigen kürzlich ausgehungerten (<24 h) hohen Wachstumsplatte isoliert sind. Die Werte jeder der 10 biologischen Repliken werden dargestellt. Die Summe aller Datenpunkte in den 10 Replikationen wird auch als Geigenplot und Bar mit S.E.M. dargestellt. Dies zeigt, dass eine einzige Platte von kürzlich ausgehungerten Würmern 80.000 L1 Larven-Bühnenwürmer ergibt. (B) Die S.E.M. der 15 verschiedenen Plattenpopulationsmessungen in Tafel A, die als Einzelpunkte dargestellt werden. Im Allgemeinen ist die S.E.M. etwas größer als 10%. (C) Drei biologische Nachbildungen von Wurmpopulationen wurden nach jeweils zwei Übertragungen zwischen Platten alle 4 h geschätzt. Dieser Transfer von Tieren zwischen den Platten hat nicht zu einem signifikanten Rückgang der Populationsgröße geführt. Dies deutet darauf hin, dass die hier vorgestellte Methode zur Bewegung von Würmern nicht zu einem signifikanten Verlust von Tieren führt. (D) Populationsmessungen im Verlauf von drei EV-Experimenten: Die Anzahl der Tiere, die für die ursprünglichen L1-Larven geschätzt wurden, die das Experiment begannen, die Anzahl der jungen erwachsenen Tiere, die aus dem Saccharoseschwimmer geborgen und bereit für die 24-Stunden-Inkubationszeit, die Anzahl der Tiere aus der EV-Vorbereitung bei der Rückgewinnung des Sekrenomen gezählt wurden. Zwischen der ursprünglichen Populationsschätzung im L1-Larvenstadium und später, wenn es sich bei den Tieren um junge Erwachsene handelt, gibt es einen kleinen, aber nicht signifikanten Rückgang der Populationsgröße. Die durchschnittliche L1-Populationsmessung wurde als 100% bezeichnet, und alle anderen Messungen wurden anhand ihres Verhältnisses zu diesem Wert skaliert. Fehlerbalken S.E.M. * = p-Wert < 0,05, N.S. = in einem parametrischen gepaarten t-Test nicht signifikant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig3alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Das Protein-Tier-Verhältnis ist eine nützliche Metrik zur Charakterisierung einer EV-Zubereitung. Diese Metrik kann eine schnelle Methode zur Bestimmung der Konsistenz zwischen EV-Vorbereitungen bieten. Im Durchschnitt werden 1.000 wilde Junge erwachsene Tiere 1 g Proteine, die größer als 10 kDa sind, in ihre Umgebung absondern (Abbildung 4A). Wenn dieser Anteil weiter durch die Größenausschlusschromatographie getrennt wird, zeigt das gesamte Proteinelutionsprofil einen kleinen Proteinspitzen zwischen 2–6 ml und einen großen Peak nach 8 ml. Die Elektrofahrzeuge sind in den ersten 5 ml des Säuleneluats enthalten (Abbildung 4B). Nanopartikel-Tracking-Analyse die ersten 5 ml des Säuleneluats enthält eine monodisperse Population von kleinen, 150 nm EVs (Abbildung 4C). Die Transmissionselektronenmikroskopie von Größenausschlussfraktionen zeigt reichlich EVs im 2-6-ml-Anteil des Eluats, nicht aber in den späteren Eluat-Volumen. Elektrofahrzeuge sind für ihre becherartige Form bekannt und lassen sich daher leicht von festen Partikeln unterscheiden, die bei der Herstellung unter den negativen Färbebedingungen als punktierte helle Punkte erscheinen (Abbildung 4D).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig4.jpg"> Abbildung 4: Reinigung von C. elegans EVs aus vollständig sezernierter Biomasse. (A) Das Verhältnis der Gesamtproteine größer als 10 kDa zur Anzahl der Würmer, die in der Zubereitung für 10 biologische Replikationen inkubiert wurden, wurde dargestellt. Die meisten Präparate enthielten 1 g Protein pro 1.000 Tiere. (B) Proteinelutionsprofil aus einer 10 ml Harzsäule, die mit 1 ml des konzentrierten Sekretoms beladen ist. Die Brüche, die in weiteren Analysen konsolidiert werden, werden in Gruppen schattiert. (C) Nanopartikel-Tracking-Analyse der konsolidierten harzeluierten Fraktionen 2–6 ml. Das 95%-Konfidenzintervall ist grau schattiert. (D) TEM-Analyse der konsolidierten harzeluierten Fraktionen. Das Ausgangsmaterial hatte sowohl vesikelartige Partikel als auch nicht-vesikelartige Partikel. Die konsolidierte 2-6 ml Elutionsfraktion wurde für Vesikel mit wenigen nicht-vesikelförmigen Partikeln angereichert. Die 7-11 ml konsolidierten Fraktionen enthielten nur wenige vesikelartige Partikel, aber viele nicht-vesikelartige Teilchen. Die 12–15 ml Elutionsfraktionen enthielten nur nicht-vesikelfreie Partikel. Alle Mikrographen werden mit der gleichen Vergrößerung dargestellt. Skalenbalken = 200 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Um die Strömungszytometrie-Eigenschaften zwischen C. elegans und humanEn Elektrofahrzeugen direkt zu vergleichen, haben wir Elektrofahrzeuge aus den konditionierten Medien von Zellkulturen menschlicher Neuronen mit dieser Methode gereinigt. Durchflusszytometrie trennt Partikel basierend auf Lichtstreuung. Die Kleinwinkel-Lichtstreuung (SALS) korreliert grob mit der Größe, und die Langwinkel-Lichtstreuung (LALS) korreliert mit der inneren Membranstruktur. Der Großteil der gesamten Probenereignisse sowohl aus der Zellkultur als auch aus C. elegans EV-Präparaten sind eng fokussiert in einem Cluster, der um 103 SALS und 104 LALS zentriert ist (Abbildung 5A). Ein Histogramm der nach SALS sortierten C. elegans EV-Probenereignisse zeigt, dass alle Präparate bei 103 (Abbildung 5B) liegen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig5.jpg"> Abbildung 5: C. elegans EVs sind durch ihre Lichtstreueigenschaften klar definiert. (A) Histogramm von SALS-Ereignissen in drei biologischen Repliken von C. elegans EVs. 80 % der gesamten Stichprobenereignisse sind in einer engen, klar definierten Grundgesamtheit enthalten. Ähnlich wie bei der Nanopartikel-Tracking-Analyse zeigt es, dass die Größenverteilung von C. elegans EVs monodisperse ist. Zum Vergleich wird das Histogramm des S Basal Puffers gezeigt, mit dem die Proben verdünnt werden. (B) Vergleich der refraktiven Eigenschaften von C. elegans und menschlichen Zellkultur-EVs, die mit den in diesem Text beschriebenen Methoden gereinigt werden. Beide EV-Typen präsentieren durchgängig vergleichbare Kurz- und Langwinkel-Lichtstreuungsverteilungen (SALS und LALS). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Der DI-8-ANEPPS beschriftet C. elegans EVs robust und hebt konsequent einen Großteil der Gesamtereignisse sowohl in den C. elegans als auch in den Zellkultur-Abgeleiteten Proben hervor. Die Kalibrierperlen und -steuerungen sind in Abbildung 6Adargestellt. Die einzelnen FACS-Streuflächen werden aus einer C. elegans-Probe gezeigt, die von 200.000 Tieren (#1) und zwei von 500.000 Tieren hergestellt wurde (Abbildung 6B). Analysiert wurden auch Elektrofahrzeuge aus 100 ml (#1) oder 200 ml (#2,3) zellkultur (Abbildung 6C). Sowohl C. elegans als auch Zellkultur-abgeleitete Proben zeigten reichlich fluoreszierende Ereignisse, die verschwanden, wenn sie mit 0,05% Triton-X 100 und Lichtbeschallung behandelt wurden. Dies zeigt, dass es sich bei den markierten Ereignissen um Waschmittel-Labile Phospholipidstrukturen (Vesikel) und nicht um waschmittelunempfindliche feste Lipoproteinaggregate handelt. Die EV-Überflussmenge wird berechnet als die Differenz zwischen der Anzahl der Ereignisse im DI-8-ANEPPS+-Gate zwischen den Fraktionen ohne Waschmittel (-) und mit Waschmittel (+) abzüglich der Ereignisse in der Dye Only-Steuerung. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden die in Abbildung 6B und Abbildung 6C einzeln dargestellten Daten in Abbildung 6D und Abbildung 6Eals Balkendiagramme zusammengefasst. Die Häufigkeit der gereinigten Elektrofahrzeuge war zwischen den C. elegans und den zellkulturabgeleiteten Präparaten nicht signifikant unterschiedlich (Abbildung 6F).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60596/60596fig6.jpg"> Abbildung 6: Beispiele für Durchflusszytometriedaten, die zur Berechnung der EV-Überflussmenge verwendet werden. (A) Um sicherzustellen, dass die Anzahl der Ereignisse direkt zwischen Samples verglichen werden kann, müssen die Steuerelemente Puffer nur und Nur Puffer und Farbstoff mit der gleichen Durchflussrate und Sammelzeit wie die EV-Probenfraktionen ausgeführt werden. Es gibt nur sehr wenige Veranstaltungen im DI-8-ANEPPS-Gate. (B) Repräsentative Ergebnisse des DI-8-ANEPPS- und Waschmittelbehandlungsprotokolls von C. elegans. Drei biologische Repliken werden gezeigt. Biologische Nachbildung #1 wurde von 200.000 Tieren hergestellt, während #2 und #3 von 500.000 Tieren hergestellt wurden. Das Verschwinden von Elektrofahrzeugen mit der Waschmittelbehandlung ist in allen Fällen klar. (C) Repräsentative Ergebnisse des DI-8-ANEPPS- und Waschmittelbehandlungsprotokolls unter Verwendung von humanzellkulturbedingten Medien. Biologische Nachbildungen #1 und #2 wurden aus 200 ml konditionierten Medien hergestellt, während biologische Replikations-#3 aus 100 ml hergestellt wurde. (D) Balkendiagramm der Daten, die aus den drei biologischen Replikationen von C. elegans EVs gesammelt wurden. Fehlerbalken = S.E.M. Gepaarte zweischwanzige T-Tests zwischen den Behandlungen. = p-Wert < 0,001. (E) Balkendiagramm der Daten, die aus den drei biologischen Replikationen von Zellkultur abgeleiteten Elektrofahrzeugen gewonnen wurden. Gepaarte zweitailte T-Tests zwischen den Behandlungen. = p-Wert < 0,001 (F) Die Anzahl der mit Farbstoffen gekennzeichneten Waschmittel-empfindlichen Ereignisse pro L wurde für alle biologischen Replikationen von C. elegans und Zellkultur berechnet. Die Werte zwischen den beiden EV-Probenquellen unterscheiden sich nicht wesentlich. Gepaarte zweitailte t-Tests zwischen den Behandlungen p-Wert = 0,685. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/60596fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Tabelle 1 enthält die rohen versuchswerten Werte für die vollen 4,5 l jedes analysierten Stichprobentyps. Die Gesamtzahl der Ereignisse, die aus den von 500.000 Tieren gereinigten EV-Fraktionen gesammelt wurden, betrug 10-20x über der Hintergrundzahl der Partikel, die allein durch Puffer gesammelt wurden, während die von 200.000 Tieren gereinigte Fraktion etwa 2x so viele Ereignisse wie nur Puffer enthielt. Die Anzahl der Ereignisse innerhalb des DI-8-ANEPPS+ Gates wird ebenfalls für jedes Beispiel angezeigt. Diese Metriken können in eine Kalkulationstabelle importiert werden, um die Anzahl der farbstoffpositiven, waschmittelempfindlichen Elektrofahrzeuge wie oben beschrieben zu berechnen. Beispielsweise würde die Anzahl der EVs in 1 ml der ersten gezeigten biologischen Replikation C. elegans wie folgt berechnet:
(18.974 – 3.853 – 1.487) x (10/4,5) x 1.000 = 30.297.778.
Tabelle 1: Tabulatierte Flusszytometriedaten. Die in Abbildung 6 dargestellten Daten werden als Tabellenkalkulation dargestellt. Für jedes Beispiel werden die Gesamtereignisse und DI-8-ANEPPS+ Gated-Ereignisse angezeigt. Jede biologische Replikation ist in der Reihenfolge der Proben #1–3 im Protokoll angeordnet. Diese Metriken zeigen, dass die Gesamtzahl der Ereignisse, die aus den C. elegans Proben gesammelt wurden, die von 500.000 Tieren oder 200 ml zellkulturbedingter Medien hergestellt wurden, 10-20x über der Hintergrundzahl der Partikel lag, die allein durch Puffer gesammelt wurden, während die biologische Replikation, die von 200.000 Tieren gereinigt wurde, etwa 2x so viele Gesamtereignisse wie nur Puffer enthielt. Die Anzahl der Ereignisse innerhalb des DI-8-ANEPPS+ Gates wird ebenfalls für jedes Beispiel angezeigt. Diese Metriken können in eine Kalkulationstabelle exportiert werden, um die Gesamtzahl der Elektrofahrzeuge zu berechnen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60596/Table1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).</a>

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Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Dieser Artikel stellt Methoden zur Erzeugung, Reinigung und Quantifizierung von Caenorhabditis elegans extrazellulären Vesikeln vor.

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Dem extrazellulären Vesikelfeld fehlte es an genetisch beschreibbaren Wirbellosen, um die Protein- und RNA-Signale extrazellulärer Vesikel zu untersuchen. Dieses Protokoll legt die Methoden zur Gewinnung reichlich, reine extrazelluläre Vesikel von C.elegans. Dies reicht für eine robuste RNA-SEQ- und proteomische Analyse.Wenn die synchronisierten Kultur C.elegans die Nahrung von ihrer normalen Wachstumsmediumplatte erschöpft haben, verwenden Sie Gummibänder, um eine fünf Mikrometer Nylon-Netzfilterkappe auf einer sterilen Flasche zu befestigen und ein Vakuum zu starten. Gießen Sie die L1-Würmer auf den Filter und übergeben Sie ein gleiches Mediumvolumen über die Schneckenaggregate. Nach dem Wirbeln drei 10 Mikroliter Volumen der Wurmsuspension auf einen Wurmanbauplattendeckel übertragen und die Anzahl der Tiere in jedem Tropfen zählen.Stellen Sie die Wurmsuspension auf zwei Tiere pro Mikroliter frisches Medium ein und wirbeln Sie die Suspension erneut aus. Als nächstes fügen Sie neun, 10 Mikroliter Tropfen Würmer auf einen neuen Plattendeckel und manuell zählen die Anzahl der Tiere in jedem Tropfen. Berechnen Sie dann den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts als Prozentsatz jeder Wurmpopulation und berechnen Sie die Gesamtzahl der Tiere in jeder Population.Um die Würmer für die Sekretik-Generation vorzubereiten, waschen Sie die Würmer mit drei fünfminütigen Waschungen in 15 Milliliter sterilem M9-Medium mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Carbenicillin pro Platte pro Waschplatte mit sanftem Wirbeln, um die Würmer zu lösen, und bündeln die Wäschen in einem 50 Milliliter konischen Rohr. Nach der letzten Wäsche die Würmer auf ein Tier pro Mikroliter S-Basel-Lösung verdünnen, ergänzt mit 2,5 Mikrogramm pro Milliliter Cholesterin und 50 mikromolarem Carbenicillin. Dann fügen Sie bis zu 400 Milliliter der Schneckensuspension zu einem sterilen Zweiliter Boden verwirrt Kolben.Stellen Sie den Kolben 24 Stunden lang auf einen kreisförmigen Rotator bei 20 Grad Celsius und 100 Umdrehungen pro Minute. Für die extrazelluläre Vesikelernte die Würmer in einem 50 Milliliter konischen Rohr zur Zentrifugation übertragen und den Überstand durch einen 0,22 Mikrometer-Vakuumfilter dekantieren, um Partikelzustände zu entfernen. Legen Sie nach dem Zählen einen Tropfen hängender Würmer auf einen bakteriellen Rasen und bewerten Sie die Tiere nach 15 Minuten als bewegend, gelähmt oder tot.Als nächstes konzentrieren Sie den gefilterten Überstand auf 700 Mikroliter mit einem regenerierten Nitrocellulose 10 Kilodalton Molekulargewichts-Cutoff-Filter und fügen 150 Mikroliter frische S-Basel-Lösung zur Reduktion hinzu. Filtern und wirbeln Sie die resultierende Lösung und wiederholen Sie die Reduktion und Filtration zwei weitere Male, wie gerade gezeigt. Zentrifugieren Sie nach der letzten Filtration den Überstand, um Partikel und Schmutz zu entfernen, die sich während der Handhabung angesammelt haben könnten, und fügen Sie Protease-Hemmer-Cocktail plus EDTA gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu.Um die Größenausschlusssäule vorzubereiten, dekantieren Sie 15 Milliliter aufgehängtes Agaroseharz in eine leere Schwerkraftflusssäulenpatrone. Wenn die Säule entleert ist, fügen Sie die S-Basel-Lösung hinzu, bis das Harzbett mit einem Endvolumen von 10 Millilitern verpackt ist. Ersetzen Sie den Harzpuffer durch 40 Milliliter steril gefilterte S-Basel-Lösung, wobei darauf geachtet wird, das Harz nicht zu stören, und die Schwerkraft den Puffer durch die Säule entleeren kann.Sobald die Oberseite des Harzes nicht mehr untergetaucht ist, verriegeln Sie den Boden der Patrone, um den Fluss zu stoppen, und legen Sie ein Sammelrohr unter die Säule. Um die Sekrezfraktionierung zu initiieren, entfernen Sie die Kappe und fügen Sie die konzentrierte Geheimlösung sofort tropfenweise an die Oberseite des Säulenbettes, gefolgt von der Zugabe von einem Milliliter S-Basel Lösung tropfenweise. Legen Sie ein frisches Sammelrohr unter die Säule und füllen Sie langsam das obere Säulenreservoir mit fünf Millilitern S-Basel-Lösung.Nach dem Sammeln der ersten zwei Milliliter Eluat, schnell die Rohre wechseln, um die nächsten vier Milliliter zu sammeln. Verwenden Sie einen regenerierten Nitrocellulose 10 Kilodalton Molekulargewichts-Cutoff-Spin-Filter, um das extrazelluläre Vesikel, das Dassäuleneluat enthält, auf 300 Mikroliter zu konzentrieren und das Filterretenin in ein niedrig bindendes Mikrozentrifugenrohr zu übertragen. Dann die Filtermembran zweimal mit 100 MikroliterS S-Basel-Lösung bei 20 Sekunden Wirbel pro Waschgang waschen und die Wäsche mit dem Originalretentat für ein endgültiges Probenvolumen von 500 Mikrolitern kombinieren.Um die extrazellulären Vesikel für die Quantifizierung durch zytometrische Durchflussanalyse vorzubereiten, fügen Sie 840 Mikroliter S-Basel-Lösung und 60 Mikroliter gereinigter extrazellulärer Vesikel in ein Mikrozentrifugenrohr ein. Fügen Sie 300 Mikroliter der Probe in zwei zusätzliche Mikrozentrifugenröhrchen zusammen mit sieben Mikrolitern einer geeigneten potentiometrischen Sonde pro Röhre hinzu. Fügen Sie sieben Mikroliter von 1%Triton X-100 in die letzte Röhre und mischen Sie alle Rohre durch Wirbeln.Legen Sie eine Beschallungsspitze in die Mitte des Rohres der dritten Probe und pulsieren Sie die Probe 10 Mal mit 20 % Leistung und einem 30%-Zollzyklus. Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter S-Basel-Lösung zu zwei Kontrollmikrozentrifugenröhren hinzu und fügen Sieben Mikroliter Sonde in das reine Farbstoffrröhre ein. Beschriften Sie nur das zweite Rohr Buffer.Dann inkubieren Sie alle Rohre für eine Stunde bei Raumtemperatur vor Licht geschützt vor ihrer Analyse durch Durchflusszytometrie nach Standardprotokollen. Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie die Dateien in der entsprechenden zytometrischen Flussanalysesoftware. Legen Sie ein rechteckiges Tor, das am oberen Rand des Grundstücks beginnt, das sich von der kleinen Winkellichtstreuebene einmal 10 bis zu zwei mal 10 bis zu den Vieren erstreckt, und bringen Sie das Tor nach unten, bis es etwa 2,5 % der gesamten Ereignisse enthält.Benennen Sie das Tor nach der Sonde, kopieren Sie das Gate, und fügen Sie es in die beiden anderen Beispiel- und Steuerdatendiagramme ein. Exportieren Sie dann die Analyse in eine Kalkulationstabelle. Hier werden repräsentative Ergebnisse aus 10 biologischen Repliken gezeigt.Die Variabilität zwischen den Replikationen ist nicht signifikant und der typische Standardfehler des Mittelwerts der Populationsgröße beträgt etwas mehr als 10%Die Übertragung von Tieren zwischen Platten führt zu einem Verlust von etwa 10%, während etwa 20% der Tiere in der Saccharose-Flotationsstufe verloren gehen. Im Durchschnitt werden 1 000 wildlebende junge erwachsene Tiere ein Mikrogramm Proteine mit mehr als 10 Kilodaltonen in ihre Umwelt absondern. Wenn dieser Anteil weiter durch größenausschlusschromatographie getrennt wird, zeigt das gesamte Protein-Elutionsprofil einen kleinen Proteinspitzen zwischen zwei und sechs Millilitern und einen großen Peak nach acht Millilitern.Die extrazellulären Vesikel sind innerhalb der ersten fünf Milliliter der Säule eluate enthalten. In einem direkten Vergleich der Strömungszytometrie-Eigenschaften zwischen C.elegans und menschlichen extrazellulären Vesikeln zeigt ein Histogramm von C.elegans extrazellulären Vesikelprobenereignissen, sortiert nach kleinwinkellicher Lichtstreuung, dass alle Präparate mit einer mittleren Fluoreszenzintensität von etwa einem mal 10 bis dritten Gipfel erreichen. Die potentiometrische Sonde DI-8-ANEPPS, die C.elegans extrazelluläre Vesikel robust beschriftet, und die Fülle von gereinigten extrazellulären Vesikeln, sortiert nach dem DI-8-ANEPPS-Ausdruck, unterscheidet sich nicht signifikant zwischen C.elegans und zellkulturabgeleiteten Präparaten.Die mit diesem Verfahren erstellten Proben sind für alle typischen nachgeschalteten extrazellulären Vesikelanalysemethoden geeignet, einschließlich RNA-SEQ, Durchflusszytometrie, Nanopartikel-Tracking-Analyse und proteomischer Analyse. Die Festlegung von Methoden zur Reinigung von C.elegans extrazellulären Vesikeln ermöglicht es Forschern, dieses einfache Wirbellose Modell zu verwenden, um die genetischen Bahnen und physiologischen Prozesse zu untersuchen, die sich auf die zusammensetzung der extrazellulären Vesikelladung auswirken.

Research

JoVE Journal

Biology

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation und In-vitro- Aktivierung von Caenorhabditis elegans Sperma

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Forschung

Biologie

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation der extrazellulären Flüssigkeit aus<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlegende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisation und Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraktion und Analyse in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automatisierung der Aggregatquantifizierung bei Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...