Name: purification and analysis of caenorhabditis elegans extracellular vesicles
Uploaded: 2020-03-31T13:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles at JoVE.com

हम कृतज्ञता से कृमि प्लेटों और अभिकर्मकों के लिए निक Terzopoulos स्वीकार करते हैं; N2 सूत्रकृमि लाइन के लिए अनुसंधान बुनियादी ढांचा कार्यक्रम (P40 OD010440) के एनआईएच कार्यालय में Caenorhabditis आनुवंशिकी केंद्र (सीजीसी); नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के साथ सहायता के लिए लूसिया वोजटेक, पीएचडी; जेसिका यंग, पीएचडी, और मैरी क्लेयर, एमडी, पीएचडी, hiPSC-व्युत्पन्न न्यूरोनल वातानुकूलित सेल मीडिया के लिए; TEM इमेजिंग के साथ सहायता के लिए वाई वेदना । इस काम को जेसीआर को एमके और एनआईएच ग्रांट AG054098 को एनआईएच ग्रांट P30AG013280 ने सपोर्ट किया।

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लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा करते हैं ।

ईवी क्षेत्र की एक मूलभूत चुनौती ईवी उपप्रकार2की विस्तृत विविधता को अलग कर रही है । यहां वर्णित विधियां छोटे ईवीएस की शुद्ध आबादी उत्पन्न करने के लिए निस्पंदन, अंतर केंद्रीकरण और आकार-बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करती हैं क्योंकि ~ 100 एनएम ईवी पहले बाहरी वातावरण में स्रावित और शारीरिक रूप से प्रासंगिक संचार मार्गों16में कार्य करते हुए दिखाए गए थे। आकार-बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी के माध्यम से शुद्ध ईवीएस अभी भी एक्सोसोम और छोटे माइक्रोवेसिकल्स का मिश्रण हो सकता है क्योंकि ये ईवी उपवर्ग इसी तरह आकार के होते हैं। कशेरुकी ईवी उपवर्ग आमतौर पर इम्यूनोप्रिसिप्रिशन से अलग होते हैं क्योंकि यह विधि चयनात्मक झिल्ली प्रोटीन मार्कर के लिए बाध्यकारी के माध्यम से ईवीएस को अलग करती है। वर्णित तरीकों सी elegans EV झिल्ली मार्कर प्रोटीन की पहचान की सुविधा । इसलिए, भविष्य में एनालॉग इम्यूनोप्रिसिप्रिशन विधियों के माध्यम से छोटे ईवी उपवर्गों को और अलग करना संभव हो सकता है। सिद्धांत रूप में, इम्यूनोप्रिसिप्रिशन ईवीएस को अच्छी तरह से खिलाया कीड़े से अलग कर सकता है क्योंकि ई. कोलाई ईवीएस को एंटीबॉडी के साथ बातचीत नहीं करनी चाहिए। बड़े EV उपवर्गों (>200 एनएम) के प्रोटीन और आनुवंशिक कार्गो की पहचान करने में रुचि रखने वाले शोधकर्ता ०.२२ माइक्रोन निस्पंदन कदम को लंघन करके और फिर अतिशयोक्ति के बजाय गोली का विश्लेषण करके ऐसा कर सकते हैं । बड़े ईवीएस के प्रोटीन और आनुवंशिक कार्गो बहुतायत को उजागर करने से शारीरिक प्रक्रियाओं की अधिक व्यापक समझ स्थापित होगी जो सी एलिगेंस स्राव के माध्यम से कार्य करती हैं। पर्यावरण में स्रावित होने के अलावा, सी एलिगेंस ईवीएस ऊतकों के बीच आंतरिक रूप से स्थानांतरित किए जाते हैं। इसलिए, ये विधियां केवल कुल सी एलिगेंस ईवीएस के सबसेट को अलग करती हैं। हालांकि, आंतरिक ईवीएस की कार्गो खोज संभव नहीं है क्योंकि EVs को lysed कीड़े से अलग करने के लिए कोई तरीका नहीं है। इस बाहरी रूप से स्रावित ईवी सबसेट का कार्गो विश्लेषण आंतरिक ईवीएस को लेबल करने में सक्षम संभावित सामान्य ईवी प्रोटीन मार्कर की पहचान करने का साधन प्रदान करता है।
ईवी तैयारी का पैमाना प्रयोग की मांगों पर निर्भर करेगा। कुल 500,000 युवा वयस्क प्रवाह साइटोमेट्री, एलसी-एमएस-एमएस और समानांतर में RNAseq विश्लेषण आयोजित करने के लिए पर्याप्त ईवीएस प्रदान करते हैं। प्रायोगिक जरूरतों के आधार पर इस संख्या को बढ़ाया या नीचे किया जा सकता है। स्केलिंग के लिए सबसे बड़ा व्यावहारिक कारक आवश्यक 10 सेमी उच्च विकास प्लेटों की संख्या है। 20x के 500 माइक्रोन के साथ तैयार उच्च विकास प्लेटें रातोंरात NA22 संस्कृति वयस्कता के पहले दिन तक L1 लार्वा चरण से ~ 50,000 वयस्कों की आबादी का समर्थन करेंगी। इसलिए, 500,000 वयस्कों के साथ एक प्रयोग करने के लिए, 13 उच्च विकास प्लेटों की आवश्यकता होती है: एल1एस की आबादी उत्पन्न करने के लिए एक प्लेट, ब्लीचिंग के लिए वयस्कों को उत्पन्न करने के लिए दो प्लेटें, और प्रायोगिक जानवरों के विकास के लिए 10 प्लेटें। ये मीट्रिक उच्च विकास प्लेटों की सीडिंग और बैक्टीरियल विकास की स्थिति पर आकस्मिक हैं। इसलिए, सभी प्लेटों को मानकीकृत तरीके से बनाने और फिर ज्ञात मात्रा में जानवरों के साथ कैलिब्रेट करने की सिफारिश की जाती है।
कीड़े खेती की प्रक्रिया के दौरान दो चरणों में गिना जाता है: 1) प्लेटों पर कीड़े बोने से पहले और 2) वातानुकूलित मीडिया पैदा करने से पहले । पशु खेती घनत्व व्यवहार, विकास, और तनाव प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है15,,16,,17,,18 और इसलिए, यह भी EV कार्गो को प्रभावित कर सकते हैं । इसलिए, लगातार खेती घनत्व के लिए कृमि आबादी का सही अनुमान लगाना आवश्यक है। नौ बूंदों में कीड़े की संख्या का पता लगाने से जनसंख्या अनुमानों का सांख्यिकीय विश्वास होता है । प्रत्येक बूंद को व्यक्तिगत रूप से इलाज करना, प्रत्येक बूंद के बीच भंवर करना और कीड़ा निलंबन में एक ही दूरी को पिपेट डालने के लिए आवश्यक है। इन सावधानियों को ध्यान में रखते हुए कुल आबादी का ~ 5-10% के एस.ई.एम. मूल्यसुनिश्चित होंगे। यदि एक कीड़ा आबादी के लिए S.E.M. 20% से अधिक है, तो कुछ धराशायी हो गया ।
24 एच बैक्टीरिया मुक्त ऊष्मायन अवधि के बाद, युवा, जंगली प्रकार सी elegans एक जीवाणु लॉन के अलावा तुरंत क्रॉल । यह इंगित करता है कि ऊष्मायन उनके स्वास्थ्य को गंभीर रूप से प्रभावित नहीं करता है। हालांकि, यह कदम जानवरों के शरीर विज्ञान को प्रभावित करता है और इसलिए ईवी कार्गो की संरचना को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, बहुत बीमार जीनोटाइप या पुराने जानवरों के साथ काम करते समय, ऊष्मायन चरण के बाद व्यवहार्यता की जांच करना आवश्यक है। यदि सभी जानवरऊष्णा से जीवित नहीं रहते हैं, तो प्रायोगिक जनसंख्या का आकार बढ़ाएं और ऊष्मायन के समय को कम करें। वातानुकूलित मीडिया की बड़ी मात्रा के साथ काम करते समय, पुनर्जीवित नाइट्रोसेल्यूलोज से बने फिल्टर के साथ उभारा हुआ सेल केंद्रित का उपयोग करना अधिक व्यावहारिक है। ईवीएस इस फिल्टर रसायन विज्ञान को अन्य फिल्टर प्रकार14के रूप में दृढ़ता से बाध्य नहीं करते हैं ।
तैयारी करने के लिए इनक्यूबेटेड जानवरों की संख्या के लिए वातानुकूलित मीडिया से बरामद कुल प्रोटीन का अनुपात एक उपयोगी मीट्रिक है । यदि यह अनुपात अपेक्षा से कहीं अधिक है, तो यह संभव है कि जनसंख्या अनुमान बंद थे या कि पशुओं की मृत्यु हो गई और वातानुकूलित मीडिया में खराब हो गया । यदि यह अनुपात उम्मीद से बहुत कम है, तो एकाग्रता प्रक्रिया के दौरान फिल्टर पर कुछ प्रोटीन खो गया हो सकता है। जबकि FACS तरीके सीधे तैयारी में ईवीएस की मात्रा निर्धारित करेंगे, यह मीट्रिक उपयोगी है क्योंकि यह प्रक्रिया में जल्दी नमूना विसंगतियों को उजागर कर सकता है। ईवी तैयारी की गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए एक और उपयोगी तरीका ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी है, जैसा कि चित्र4Dमें दिखाया गया है। हालांकि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रोटोकॉल औपचारिक रूप से लंबाई के कारण इस तरीकों लेख में शामिल नहीं है, यह मानक तरीकों से आयोजित किया जा सकता है । ईवी तैयारियों की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए एफएसीएस के लिए एक मानार्थ विधि के रूप में कम से कम शुरू में इस प्रकार के विश्लेषण का संचालन करने की सिफारिश की जाती है। सर्वोत्तम परिणामों के लिए ताजा डिस्चार्ज किए गए फॉर्म्वर-कार्बन ग्रिड का उपयोग करें और नमूनों को मूत्र एसीटेट के बजाय 2% फॉस्फोतुंगस्टिक एसिड के साथ दाग दें।
DI-8-ANEPPS चुना गया था क्योंकि यह मात्रात्मक लेबल EV झिल्ली के लिए दिखाया गया है, मानव बायोप्सी नमूनों और liposomes25के साथ अंय सामांय EV रंगों से बेहतर प्रदर्शन । माप जल्दी कर रहे हैं, प्रत्येक नमूने के लिए संग्रह समय के केवल 3 मिन ले । डिटर्जेंट-संवेदनशील ईवीएस के परिमाणीकरण का प्रत्यक्ष कार्यात्मक महत्व है क्योंकि यह ईवीएस और ठोस लिपोप्रोटीन समुचेश के बीच एक मौलिक भौतिक अंतर को भुनाता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि यह विधि कुल प्रोटीन या गैर-ईवी समुचेय की संख्या की मात्रा से प्रभावित नहीं होती है और इसलिए निष्पक्ष तरीके से विभिन्न शुद्धिकरण विधियों के माध्यम से प्राप्त ईवी की मात्रा निर्धारित कर सकती है। FACS-सत्यापित EV मीट्रिक हम यहां वर्णन अध्ययन है कि शुद्ध EVs के शारीरिक प्रभावों को प्रदर्शित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी होगा । यह सामान्य रूप से ईवी क्षेत्र को सार्वभौमिक मीट्रिक के रूप में एक FACS पद्धति स्थापित करने के लिए भी लाभ पहुंचा सकता है ताकि पूर्ण ईवी बहुतायत सीधे अध्ययन ों में तुलना की जा सके। महत्वपूर्ण रंग सी एलिगेंस ईवीएस को भी लेबल कर सकते हैं, लेकिन वे डीआई-8-एनिप्स के साथ लेबल किए गए ईवीएस के रूप में उज्ज्वल नहीं हैं।
यह शुद्धि दृष्टिकोण अक्षुण्ण, जीवित कीड़े के शरीर के बाहर ईवीएस के सक्रिय स्राव पर कैपिटल बनाता है। यह सी एलिगेंस ईवीएस को सेल संस्कृति, विनिर्देशों से तुलनीय शुद्धता और बहुतायत में अलग होने की अनुमति देता है जो एलसी-एमएस-एमएस और आरएनसेक विश्लेषण26के माध्यम से सैकड़ों प्रोटीन और आरएनए कार्गो की पहचान करने के लिए पर्याप्त हैं। इस प्रकार, सी एलिगेंस अनुसंधान के लिए उपलब्ध अभिकर्मकों की बड़ी लाइब्रेरी को ईवी कार्गो संरचना पर आनुवंशिक और शारीरिक क्षोभ के प्रभाव की जांच के लिए लीवरेज किया जा सकता है।

झिल्ली से बंधे बाह्य वेसिकल्स (ईवीएस) का स्राव कोशिकाओं1के बीच विशिष्ट प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, मेटाबोलाइट और लिपिड कार्गो को सक्रिय रूप से परिवहन करके वैश्विक शारीरिक प्रक्रियाओं की सुविधा प्रदान करता है। कोशिकाएं ईवीएस को स्रावित करती हैं जो 2 माइक्रोन या उससे अधिक से लेकर 20 एनएम2तक के आकारों के सातत्य तक फैली हुई हैं। मेटाबोलिक विकारों, कैंसर, हृदय रोग, और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग3,4,4,5सहित रोग प्रक्रियाओं में उनके निहितार्थ के कारण छोटे ईवीएस (<200 एनएम) का तेजी से अध्ययन किया जाता है। इन विकृतियों को छोटे ईवीएस के ईवीएस कार्गो के प्रोटीन और आनुवंशिक संरचना को प्रभावित करने के लिए भी दिखाया गया है। इसलिए, पैथोलॉजी के बायोमार्कर हस्ताक्षर तेजी से ईवी कार्गो खोज विधियों जैसे एलसी-एमएस-एमएस और RNAseq6,,7,,8,,9के माध्यम से खुला किया जा रहा है।
सी elegans विकासवादी संरक्षित EV सिग्नलिंग रास्तों की पहचान करने के लिए एक उपयोगी अकशेरुकी मॉडल रहा है । उदाहरण के लिए, सी एलिगेंस फ्लिपपास को सबसे पहले सी एलिगेंस भ्रूण में ईवी बायोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था, और मानव होमोलॉग को मानव कोशिकाओं10,,11में ईवी रिलीज को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था। सी elegans EVs को छल्ली विकास के लिए आवश्यक हेजहॉग संकेतों को ले जाने के लिए सूचित किया गया था । हेजहॉग और अन्य मॉर्फोन्स की डिलीवरी को ईवीएस की एक प्रमुख विकासात्मक भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया था, और इसे जेब्राफिश, चूहों और मनुष्यों12,,13,,14,,15में संरक्षित किया गया है। सी elegans ईवी बायोमार्कर खोज के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है क्योंकि यह अपने शरीर के बाहर EVs स्राव करता है जो पशु-से-पशु संचार16,,17 (चित्रा 1ए)में कार्य करता है। हालांकि, पिछले अध्ययन के माध्यम से स्थापित पद्धति का उपयोग नहीं किया जा सकता है क्योंकि सूत्रकृमि ' ई कोलाई खाद्य स्रोत भी EVs18स्रावित करता है । इस विधि में, अधिकांश नमूने में ई कोलाई संदूषण शामिल है, जो सी एलिगेंस ईवी कार्गो की खोज के लिए प्रोटेओमिक या आरएनएसईक्यू दृष्टिकोणकी शक्ति को सीमित करता है। यहां वर्णित तरीकों को विशिष्ट सेल संस्कृति प्रयोगों की विशेषता के बहुतायत स्तरों पर अत्यधिक शुद्ध सी एलिगेंस ईवीएस उपज के लिए विकसित किया गया था और इस प्रकार ईवी बायोमार्कर खोज के लिए ओमिक्स दृष्टिकोण की सुविधा प्रदान की गई थी।
कार्गो विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या में ईवी उत्पन्न करने के लिए कीड़े की बड़ी आबादी की आवश्यकता होती है। इसलिए, विकासात्मक रूप से सिंक्रोनाइज्ड सी एलिगेंस की बड़ी आबादी की मात्रात्मक खेती करने के तरीके भी शामिल हैं। आमतौर पर, जब प्रयोगों के लिए बड़ी संख्या में कीड़े की आवश्यकता होती है, तो उन्हें तरल मीडिया में सुसंस्कृत किया जाता है। हालांकि यह कीड़े की बड़ी आबादी पैदा करने के लिए प्रभावी है, जानवरों की शरीर विज्ञान सूत्रकृमि विकास माध्यम (एनजीएम) आगर प्लेटों पर मानक शर्तों के तहत खेती की कीड़े से काफी अलग है । तरल में सुसंस्कृत पशु अधिक धीरे-धीरे बढ़ते हैं, पतले होते हैं, विकासात्मक विषमता दिखाते हैं, और उच्च स्तर के बैच परिवर्तनशीलता के अधीन होते हैं। इसलिए, हम 10 सेमी उच्च विकास प्लेटों का उपयोग करके विकासात्मक रूप से सिंक्रोनाइज्ड सी एलिगेंस की बड़ी आबादी की मात्रात्मक खेती के लिए एक सरल लेकिन प्रभावी साधन प्रस्तुत करते हैं। उच्च विकास प्लेटों की मीडिया संरचना में नियमित एनजीएम प्लेटों की तुलना में अधिक पेप्टोन शामिल है और ई कोलाई स्ट्रेन NA22 के साथ वरीयता प्राप्त है जो OP50 की तुलना में अधिक मजबूती से बढ़ता है।
प्रवाह साइटोमेट्री प्रौद्योगिकी (एफएसीएस) में प्रगति ने अन्य तरीकों में अंतर्निहित सीमाओं के बिना ईवीएस के परिमाणीकरण की अनुमति देते हुए व्यक्तिगत ईवीएस20,,21के प्रत्यक्ष विश्लेषण को सक्षम किया है। पहले के काम से पता चला है कि प्रोटीन ईवी बहुतायत के लिए एक उपयोगी प्रॉक्सी नहीं है क्योंकि विभिन्न शुद्धि पद्धतियों के परिणामस्वरूप काफी अलग EV-से-प्रोटीन अनुपात22। बेहद शुद्ध ईवी अंशों में अपेक्षाकृत कम प्रोटीन होता है, जिससे बीसीए या कूमासी जैल के साथ नमूनों की मात्रा निर्धारित करना मुश्किल हो जाता है। पश्चिमी विश्लेषण व्यक्तिगत प्रोटीन के सापेक्ष मतभेदों की पहचान कर सकते हैं, लेकिन पहचान नहीं कर सकते कि कितने EVs नमूने में हैं । नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण द्वारा ईवी संख्या का मजबूत मात्राकरण इसके संकीर्ण सिग्नल-टू-शोर रेंज, ईवीएस और ठोस समुचेय के बीच अंतर करने में असमर्थता और विभिन्न विनिर्देशों23के साथ उपकरणों के बीच तरीकों की हस्तांतरणीयता की कमी से बाधित होता है। इसलिए, इस लेख में ईवीएस के भेदभाव और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सामान्यीकृत प्रवाह साइटोमेट्रिक प्रक्रिया भी शामिल है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="791">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">0.22 filters units</td>
			<td style="width:107px;">Genesee</td>
			<td style="width:115px;">25-233</td>
			<td style="width:327px;">For clairifying the conditioned media from debris</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">1% solution of Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">HFH10</td>
			<td>Add this to 0.05 % to lyse EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">10 cm high growth plates</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">N/A</td>
			<td>For cultivating large populations of worms</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">2-liter bottom baffled flasks</td>
			<td style="width:107px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">4110-2000PK</td>
			<td>For conducting size exclusion separation of EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">40 &#956;m mesh</td>
			<td style="width:107px;">Amazon</td>
			<td style="width:115px;">CMY-0040-C/5PK-05</td>
			<td>Use this to separate adult worms from larval stages</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">5 &#956;m mesh</td>
			<td style="width:107px;">Amazon</td>
			<td style="width:115px;">CMN-0005-C</td>
			<td>Use this to separate L1s from other worm stages</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">6 cm normal growth medium worm cultivation plate</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">N/A</td>
			<td>For cultivating small populations of worms</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">C7715</td>
			<td>For concentrating the size exclusion elute</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">C78144</td>
			<td>For concentrating the conditioned media</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Apogee A50 flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Apogee</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">ApogeeMix</td>
			<td style="width:107px;">Apogee</td>
			<td style="width:115px;">1493</td>
			<td>Assess light scatter and fluorescence performance of FACS</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">DI-8-ANEPPS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3167</td>
			<td>Add this at 20 uM to label EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Disposable chromatography Column</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:115px;">7321010</td>
			<td>For conducting size exclusion separation of EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Geletin</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">G9391-100G</td>
			<td>To treat pipette tips so that worms do not stick</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">HALT protease inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">87785</td>
			<td>Add to EV sample to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Low-protein binding collection tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>90410</td>
			<td>Use these for EV samples</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>For sucrose floatation of worms</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">S Basal buffer</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">N/A</td>
			<td>Recipe in WormBook</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Sepharose CL-2B resin</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">CL2B300-100ML</td>
			<td>For conducting size exclusion separation of EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Small orbital shaker</td>
			<td style="width:107px;">ABC Scientific</td>
			<td>83211301</td>
			<td>Use this for worm S Basal incubation</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Sucrose</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td>For sucrose floatation of worms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and analysis of caenorhabditis elegans extracellular vesicles

बाहरी वातावरण में छोटे झिल्ली से बंधे वेसिकल्स का स्राव सभी कोशिकाओं की एक मौलिक शारीरिक प्रक्रिया है। ये बाह्य वेसिकल्स (ईवीएस) ऊतकों के बीच प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, मेटाबोलाइट्स और लिपिड स्थानांतरित करके वैश्विक शारीरिक प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए सेल के बाहर कार्य करते हैं। ईवीएस मूल की अपनी कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति को दर्शाते हैं। EVs मानव स्वास्थ्य के लगभग हर पहलू में मौलिक भूमिकाओं के लिए फंसाया जाता है । इस प्रकार, ईवी प्रोटीन और आनुवंशिक कार्गो स्वास्थ्य और रोग के बायोमार्कर के लिए तेजी से विश्लेषण किया जा रहा है । हालांकि, ईवी फील्ड में अभी भी एक ट्रैक्टेबल अकशेरुकी मॉडल सिस्टम का अभाव है जो ईवी कार्गो संरचना के अध्ययन की अनुमति देता है। सी elegans अच्छी तरह से EV अनुसंधान के लिए अनुकूल है क्योंकि यह सक्रिय रूप से अपने बाहरी वातावरण में अपने शरीर के बाहर EVs स्राव, फेसियल अलगाव की अनुमति । यह लेख इन पर्यावरण की दृष्टि से स्रावित सी एलिगेंस ईवीएस को उत्पन्न करने, शुद्ध करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए सभी आवश्यक जानकारी प्रदान करता है जिसमें उम्र-सिंक्रोनाइज्ड कीड़े की बहुत बड़ी आबादी के साथ मात्रात्मक रूप से काम करना, ईवी को शुद्ध करना और एक प्रवाह साइटोमेट्री प्रोटोकॉल शामिल है जो सीधे शुद्ध नमूने में अक्षुण्ण ईवीएस की संख्या को मापता है। इस प्रकार, सी एलिगेंस अनुसंधान के लिए उपलब्ध आनुवंशिक अभिकर्मकों की बड़ी लाइब्रेरी को ईवी कार्गो संरचना पर आनुवंशिक रास्तों और शारीरिक प्रक्रियाओं के प्रभावों की जांच के लिए टैप किया जा सकता है।

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Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

यह लेख कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस एक्सेलर्युलर वेसिकल्स को उत्पन्न करने, शुद्ध करने और मात्रा देने के तरीके प्रस्तुत करता है।

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस एक्सिटेलर वेसिकल्स का शुद्धिकरण और विश्लेषण

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल फील्ड में एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स के प्रोटीन और आरएनए संकेतों का अध्ययन करने के लिए आनुवंशिक रूप से ट्रैकेबल अकशेरुकी मॉडल की कमी है। यह प्रोटोकॉल सी एलिगेंस से प्रचुर मात्रा में, शुद्ध बाहुलर वेसिकल्स प्राप्त करने के तरीकों को स्थापित करता है। यह मजबूत आरएनए-एसईक्यू और प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए पर्याप्त है।जब सिंक्रोनाइज्ड कल्चर सी. एलिगेंस ने अपने सामान्य ग्रोथ मीडियम प्लेट से खाना खत्म कर दिया है, तो एक बाँझ बोतल पर पांच माइक्रोमीटर नायलॉन जाल फिल्टर कैप को सुरक्षित करने और वैक्यूम शुरू करने के लिए रबर बैंड का उपयोग करें। फिल्टर पर L1 कीड़े डालो और कीड़ा समुच्चय पर मध्यम की एक समान मात्रा से गुजारें । भंवर के बाद, कृमि निलंबन के तीन 10 माइक्रोलीटर वॉल्यूम को एक कृमि की खेती की प्लेट ढक्कन पर स्थानांतरित करें और प्रत्येक बूंद में जानवरों की संख्या गिनें।ताजा माध्यम के माइक्रोलीटर प्रति दो जानवरों के लिए कृमि निलंबन समायोजित करें और निलंबन फिर से भंवर। इसके बाद, एक नई प्लेट ढक्कन पर कीड़े की नौ, 10 माइक्रोलीटर बूंदें जोड़ें और मैन्युअल रूप से प्रत्येक बूंद में जानवरों की संख्या गिनती । फिर प्रत्येक कीड़े की आबादी के प्रतिशत के रूप में मतलब के मतलब और मानक त्रुटि की गणना करें और प्रत्येक आबादी में जानवरों की कुल संख्या की गणना करें।स्रावमुर्जा पीढ़ी के लिए कीड़े तैयार करने के लिए, बाँझ M9 माध्यम के 15 मिलीलीटर में तीन पांच मिनट की धोती के साथ कीड़े को धोने के साथ प्रति प्लेट प्रति प्लेट कार्बेनिकिन के ५० माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ कोमल घूमता के साथ कीड़े को उखाड़ फेंकना, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में धोते पूलिंग । अंतिम धोने के बाद, एस-बेसल समाधान के प्रति माइक्रोलीटर एक जानवर को कीड़े को पतला करें, जो कोलेस्ट्रॉल के 2.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर और 50 माइक्रोमोलर कार्बेनिकिन एकाग्रता के साथ पूरक होता है। फिर एक बाँझ दो लीटर नीचे चकित फ्लास्क करने के लिए कीड़ा निलंबन के 400 मिलीलीटर तक जोड़ें।फ्लास्क को 20 डिग्री सेल्सियस पर एक गोलाकार रोटेटर पर रखें और 24 घंटे के लिए प्रति मिनट 100 घूर्णन करें। एक्सट्रासेलुलर वेसिकल हार्वेस्ट के लिए, किसी भी कण मलबे को हटाने के लिए 0.22 माइक्रोमीटर वैक्यूम फिल्टर के माध्यम से 50 मिलीलीटर शंकु नली में कीड़े को स्थानांतरित करें और सुपरनेट को डिकंट करें। गिनती के बाद, एक जीवाणु लॉन पर निलंबित कीड़े की एक बूंद रखें और 15 मिनट के बाद जानवरों को चलती, लकवाग्रस्त या मृत के रूप में स्कोर करें।इसके बाद, फ़िल्टर किए गए सुपरनेट को एक पुनर्जीवित नाइट्रोसेल्यूलोज 10 किलोडलटन आणविक वजन कटऑफ फिल्टर के साथ 700 माइक्रोलीटर पर ध्यान केंद्रित करें और कमी के लिए ताजा एस-बेसल समाधान के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें। फ़िल्टर और भंवर जिसके परिणामस्वरूप समाधान और कमी और छानने का काम दोहराने के रूप में सिर्फ प्रदर्शन दो बार। अंतिम निस्पंदन के बाद, हैंडलिंग के दौरान जमा होने वाले किसी भी कण और मलबे को हटाने के लिए सुपरनेट को अपकेंद्री करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रोटीज़ अवरोधक कॉकटेल प्लस EDTA जोड़ें।आकार बहिष्कार कॉलम तैयार करने के लिए, निलंबित agarose राल के 15 मिलीलीटर एक खाली गुरुत्वाकर्षण प्रवाह कॉलम कारतूस में decant 15 मिलीलीटर । जब कॉलम सूखा है, एस बेसल समाधान जोड़ें जब तक राल बिस्तर 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में पैक किया जाता है । राल बफर को बाँझ फ़िल्टर एस-बेसल समाधान के 40 मिलीलीटर के साथ बदलें, राल को परेशान न करने का ध्यान रखें, और गुरुत्वाकर्षण को कॉलम के माध्यम से बफर को निकालने की अनुमति दें।एक बार राल के ऊपर अब जलमग्न नहीं है, प्रवाह को रोकने के लिए कारतूस के नीचे टोपी और कॉलम के नीचे एक संग्रह ट्यूब जगह है । स्रावम अंश शुरू करने के लिए, टोपी को हटा दें और तुरंत कॉलम बिस्तर के शीर्ष पर केंद्रित स्राव समाधान ड्रॉप-वार जोड़ें, इसके बाद एस-बेसल समाधान ड्रॉप-वार के एक मिलीलीटर के अलावा। कॉलम के नीचे एक ताजा संग्रह ट्यूब रखें और धीरे-धीरे ऊपरी स्तंभ जलाशय को एस-बेसल समाधान के पांच मिलीलीटर के साथ भरें।एलुएट के पहले दो मिलीलीटर इकट्ठा करने के बाद, अगले चार मिलीलीटर को इकट्ठा करने के लिए जल्दी से ट्यूब बदलें। 300 माइक्रोलीटर के लिए कॉलम एल्यूएट युक्त एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल को केंद्रित करने के लिए एक पुनर्जनित नाइट्रोसेल्यूलोज 10 किलोडलटन आणविक वजन कटऑफ स्पिन फिल्टर का उपयोग करें और फ़िल्टर को कम बाध्यकारी माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिर प्रति वॉश भंवर के 20 सेकंड में एस-बेसल समाधान के 100 माइक्रोलीटर के साथ दो बार फिल्टर झिल्ली धोएं और 500 माइक्रोलीटर की अंतिम नमूना मात्रा के लिए मूल रिटेनेट के साथ वॉश को मिलाएं।प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा मात्राकरण के लिए बाह्राश वेसिकल तैयार करने के लिए, एस-बेसल समाधान के 840 माइक्रोलीटर और शुद्ध एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स के 60 माइक्रोलीटर को माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में जोड़ें। नमूना के 300 माइक्रोलीटर को दो अतिरिक्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में जोड़ें, साथ ही प्रति ट्यूब एक उपयुक्त शक्तिशालीियोमेट्रिक जांच के सात माइक्रोलीटर के साथ। आखिरी ट्यूब में 1% ट्राइटन एक्स-100 के सात माइक्रोलीटर जोड़ें और सभी ट्यूबों को भंवर से मिलाएं।तीसरे नमूने की ट्यूब के केंद्र में एक सोनिकेटर टिप रखें और 20% बिजली और 30% शुल्क चक्र पर 10 बार नमूना पल्स करें। इसके बाद, दो नियंत्रण माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में एस-बेसल समाधान के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें और डाई केवल ट्यूब में जांच के सात माइक्रोलीटर जोड़ें। दूसरी ट्यूब बफर को ही लेबल करें।फिर मानक प्रोटोकॉल के अनुसार प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा उनके विश्लेषण से पहले प्रकाश से संरक्षित कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए ट्यूबों के सभी इनक्यूबेट । डेटा का विश्लेषण करने के लिए, उचित प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण सॉफ्टवेयर में फ़ाइलों को खोलें। एक आयताकार गेट सेट करें जो छोटे कोण प्रकाश स्कैटर स्तर से एक बार 10 से दो से एक गुना 10 से चार तक फैले हुए भूखंड के शीर्ष पर शुरू होता है और गेट को नीचे लाना जब तक कि इसमें कुल घटनाओं का लगभग 2.5% न हो।जांच के बाद गेट का नाम दें और कॉपी करें और गेट को अन्य दो सैंपल पर चिपकाएं और डेटा प्लॉट को कंट्रोल करें । फिर विश्लेषण को स्प्रेडशीट में निर्यात करें। यहां, 10 जैविक प्रतिकृति से प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं।प्रतिकृति के बीच परिवर्तनशीलता महत्वपूर्ण नहीं है और जनसंख्या के आकार के मतलब की विशिष्ट मानक त्रुटि 10% से थोड़ा अधिक है प्लेटों के बीच जानवरों के हस्तांतरण के परिणामस्वरूप जानवरों का लगभग 10% नुकसान होता है, जबकि लगभग 20% जानवर सुक्रोज प्लवनशीलता चरण में खो जाते हैं। औसतन, 1, 000 जंगली प्रकार के युवा वयस्क जानवर अपने पर्यावरण में 10 किलोडटन से बड़े प्रोटीन के एक माइक्रोग्राम का स्राव करेंगे । जब इस अंश को आकार के बहिष्कार क्रोमेटोग्राफी से और अलग किया जाता है, तो कुल प्रोटीन एल्यूमीशन प्रोफाइल दो से छह मिलीलीटर और आठ मिलीलीटर के बाद एक बड़ी चोटी के बीच एक छोटी प्रोटीन चोटी को दर्शाता है।एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स कॉलम एलुएट के पहले पांच मिलीलीटर के भीतर निहित होते हैं। सी एलिगेंस और मानव एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स के बीच प्रवाह साइटोमेट्री विशेषताओं की सीधी तुलना में, छोटे कोण प्रकाश बिखरने से हल किए गए सी एलिगेंस एक्सट्रासेलुलर वेसिकल नमूना घटनाओं का एक हिस्टोग्राम, यह दर्शाता है कि सभी तैयारी लगभग एक गुना 10 से तीसरे के मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता पर चरम पर होती हैं। शक्तिशाली जांच DI-8-ANEPPS, मजबूती से सी. एलिगेंस एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल्स लेबल और डीआई-8-ANEPPS अभिव्यक्ति द्वारा हल शुद्ध अतिरिक्त वेसिकल्स की बहुतायत सी एलिगेंस और सेल संस्कृति व्युत्पन्न तैयारी के बीच काफी अलग नहीं है।इस प्रक्रिया द्वारा तैयार किए गए नमूने आरएनए-एसईक्यू, प्रवाह साइटोमेट्री, नैनो-पार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण और प्रोटेओमिक विश्लेषण सहित सभी विशिष्ट डाउनस्ट्रीम एक्सट्रासेलुलर वेसिकल विश्लेषण विधियों के लिए उत्तरदायी हैं। C.elegans बाहेल वेसिकल्स को शुद्ध करने के तरीकों की स्थापना शोधकर्ताओं को आनुवंशिक मार्गों और शारीरिक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस सरल अकशेरुकी मॉडल का उपयोग करने की अनुमति देता है जो बाहुलर वेसिकल कार्गो संरचना को प्रभावित करता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

अलगाव और इन विट्रो में सक्रियकरण Caenorhabditis एलिगेंस शुक्राणु

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

पैशाचिक कोशिकेतर द्रव से अलगाव<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

बुनियादी<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em&gt; तरीके तुल्यकालन और निरीक्षण:

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

में प्रोस्टाग्लैंडीन निष्कर्षण और विश्लेषण<em&gt; Caenorhabditis एलिगेंस</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

फ्लो का प्रयोग कोशिकी vesicles के विश्लेषण के लिए तकनीक

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

कोशिका-वातानुकूलित मीडिया से Extracellular बुलबुले के प्रवाह Cytometric विश्लेषण

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स के क्वांटिफिकेशन और आकार निर्धारण के लिए नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

कैनोरहाब्डाइटिस एलिगेंस में कुल मात्रा का ठहराव स्वचालित करना

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

एस्चेरिचिया कोलाई और अन्य बैक्टीरिया से बाह्य पुटिकाओं का स्केलेबल अलगाव और शुद्धिकरण

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

सायनोबैक्टीरिया एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स का अलगाव और लक्षण वर्णन

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...