Name: purification and analysis of caenorhabditis elegans extracellular vesicles
Uploaded: 2020-03-31T13:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles at JoVE.com

Мы с благодарностью признаем Ника Терзопулоса за червячие пластины и реагенты; Центр генетики Каненорхабдита (CGC) в Управлении научно-исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440) для линии нематод N2; Люсия Войтек, PhD, за помощь в анализе отслеживания наночастиц; Джессика Янг, доктор философии, и Мари Клэр, MD, PhD, для hiPSC полученных нейронных условных клеточных носителей; Wai Pang за помощь в визуализации TEM. Эта работа была поддержана ГРАНТом NIH P30AG013280 для Гранта МК и NIH AG054098 JCR.

<ol>
	<li>Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Unique+Intercellular+Delivery+Vehicles.">Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles.</a> Trends in Cell Biology. 27, 172-188 (2017).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li><li>Lakhter, A. J., Sims, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minireview:+Emerging+Roles+for+Extracellular+Vesicles+in+Diabetes+and+Related+Metabolic+Disorders.">Minireview: Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Diabetes and Related Metabolic Disorders.</a> Molecular Endocrinology. 29, 1535-1548 (2015).</li><li>Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+extracellular+membrane+vesicles+in+the+pathogenesis+of+various+diseases,+including+cancer,+renal+diseases,+atherosclerosis,+and+arthritis.">Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis.</a> Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 90, 1549-1557 (2010).</li><li>Lai, C. P. -. K., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes/microvesicles+in+the+nervous+system+and+use+in+emerging+therapies.">Role of exosomes/microvesicles in the nervous system and use in emerging therapies.</a> Frontiers in Physiology. 3, 228 (2012).</li><li>Duijvesz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+exosomes+leads+to+the+identification+of+novel+biomarkers+for+prostate+cancer.">Proteomic profiling of exosomes leads to the identification of novel biomarkers for prostate cancer.</a> PLoS One. 8, 82589 (2013).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal+Fetuin-A+identified+by+proteomics:+a+novel+urinary+biomarker+for+detecting+acute+kidney+injury.">Exosomal Fetuin-A identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury.</a> Kidney International. 70, 1847-1857 (2006).</li><li>Cheng, L., Sharples, R. A., Scicluna, B. J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+provide+a+protective+and+enriched+source+of+miRNA+for+biomarker+profiling+compared+to+intracellular+and+cell-free+blood.">Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Michael, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+human+saliva+as+a+source+of+microRNA+biomarkers.">Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers.</a> Oral Diseases. 16, 34-38 (2010).</li><li>Wehman, A. M., Poggioli, C., Schweinsberg, P., Grant, B. D., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P4-ATPase+TAT-5+inhibits+the+budding+of+extracellular+vesicles+in+C.+elegans+embryos.">The P4-ATPase TAT-5 inhibits the budding of extracellular vesicles in C. elegans embryos.</a> Current Biology. 21, 1951-1959 (2011).</li><li>Naik, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+P4-ATPase+ATP9A+is+a+novel+determinant+of+exosome+release.">The P4-ATPase ATP9A is a novel determinant of exosome release.</a> PLoS One. 14, 0213069 (2019).</li><li>Li&#233;geois, S., Benedetto, A., Garnier, J. -. M., Schwab, Y., Labouesse, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+V0-ATPase+mediates+apical+secretion+of+exosomes+containing+Hedgehog-related+proteins+in+Caenorhabditis+elegans.">The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 173, 949-961 (2006).</li><li>Simon, E., Aguirre-Tamaral, A., Aguilar, G., Guerrero, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspectives+on+Intra-+and+Intercellular+Trafficking+of+Hedgehog+for+Tissue+Patterning.">Perspectives on Intra- and Intercellular Trafficking of Hedgehog for Tissue Patterning.</a> Journal of Developmental Biology. 4, (2016).</li><li>Qi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Derived+from+Human+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Promote+Tumor+Growth+Through+Hedgehog+Signaling+Pathway.">Exosomes Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Promote Tumor Growth Through Hedgehog Signaling Pathway.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 42, 2242-2254 (2017).</li><li>Sigg, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+Proteomics+Uncovers+Ancient+Associations+of+Cilia+with+Signaling+Pathways.">Evolutionary Proteomics Uncovers Ancient Associations of Cilia with Signaling Pathways.</a> Developmental Cell. 43, 744-762 (2017).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+ciliated+sensory+neurons+release+extracellular+vesicles+that+function+in+animal+communication.">C. elegans ciliated sensory neurons release extracellular vesicles that function in animal communication.</a> Current Biology. 24, 519-525 (2014).</li><li>Beer, K. B., Wehman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+functions+of+extracellular+vesicle+release+in+vivo-What+we+can+learn+from+flies+and+worms.">Mechanisms and functions of extracellular vesicle release in vivo-What we can learn from flies and worms.</a> Cell Adhesion and Migration. 11, 135-150 (2017).</li><li>Deatherage, B. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicle+release+in+bacteria,+eukaryotes,+and+archaea:+a+conserved+yet+underappreciated+aspect+of+microbial+life.">Membrane vesicle release in bacteria, eukaryotes, and archaea: a conserved yet underappreciated aspect of microbial life.</a> Infection and Immunity. 80, 1948-1957 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> C. elegans. 2, 51-67 (1999).</li><li>Kibria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+automated+surface+protein+profiling+of+single+circulating+exosomes+in+human+blood.">A rapid, automated surface protein profiling of single circulating exosomes in human blood.</a> Scientific Reports. 6, 36502 (2016).</li><li>Rose, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+quantification+of+peripheral+blood+cell+&#946;-adrenergic+receptor+density+and+urinary+endothelial+cell-derived+microparticles+in+pulmonary+arterial+hypertension.">Flow cytometric quantification of peripheral blood cell &#946;-adrenergic receptor density and urinary endothelial cell-derived microparticles in pulmonary arterial hypertension.</a> PLoS One. 11, 0156940 (2016).</li><li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma.">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).</li><li>Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+sizing+and+enumeration+by+nanoparticle+tracking+analysis.">Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Fernandez, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescence-based+isolation+of+live+C.+elegans+larvae.">High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae.</a> Nature Protocols. 7, 1502-1510 (2012).</li><li>de Rond, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Generic+Fluorescent+Markers+for+Detection+of+Extracellular+Vesicles+by+Flow+Cytometry.">Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry.</a> Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).</li><li>Russell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles+from+Caenorhabditis+elegans+for+multi-omic+analysis+[Internet].">Isolation and characterization of extracellular vesicles from Caenorhabditis elegans for multi-omic analysis [Internet].</a> bioRxiv. , (2018).</li></ol>

Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.

Фундаментальная задача месторождения EV заключается в разделении широкого спектра подтипов EV2. Методы, описанные здесь, используют фильтрацию, дифференциальную центрифугацию и хроматографию, объясняемую размерами, для создания чистой популяции небольших ЭВ, потому что ранее было показано, что они выделяются во внешнюю среду и функционируют в физиологически соответствующих коммуникационных путях16. EVs очищены через размер исключения хроматографии все еще может быть смесь экзосом и небольших микровезиков, потому что эти EV подклассы аналогичного размера. Подклассы Vertebrate EV обычно разделены иммунопрецицией, потому что этот метод изолирует ЭВ через связывание с селективными маркерами мембранного белка. Описанные методы облегчают идентификацию белков мембранных маркеров C. elegans EV. Таким образом, в будущем можно будет еще больше отделить небольшие подклассы EV с помощью аналогичных методов иммунопрецитации. В теории, иммунопрецитиза может изолировать EVs от сытых червей, потому что E. coli EVs не должны взаимодействовать с антителами. Исследователи, заинтересованные в выявлении белковых и генетических грузов более крупных подклассов EV (Nogt;200 nm), могут сделать это, пропустив ступень фильтрации 0,22 мкм, а затем проанализировав гранулы, а не супернатант. Раскрытие белковых и генетических грузовых обилий крупных ЭВ позволит получить более полное понимание физиологических процессов, которые функционируют через сеадизом C. elegans. В дополнение к секретированию в окружающую среду, C. elegans EVs передаются внутренне между тканями. Таким образом, эти методы только изолировать подмножество общего C. elegans EVs. Тем не менее, обнаружение грузов внутренних EVs не представляется возможным, потому что нет метода для разделения EVs от лисизированных червей. Грузовой анализ этого внешне высекреченного подмноза EV обеспечивает средства для выявления потенциальных общих маркеров белка EV, способных маркировать внутренние EVs.
Масштаб ы подготовки EV будет зависеть от требований эксперимента. В общей сложности 500 000 молодых людей обеспечивают достаточное количество ЭВ для параллельного анализа цитометрии потока, LC-MS-MS и RNAseq. Это число может быть уменьшено вверх или вниз в зависимости от экспериментальных потребностей. Самым большим практическим фактором для масштабирования является количество 10 см высоких пластин роста требуется. Высокорастущие пластины, приготовленные с 500 qL из 20x концентрированной ночной культуры NA22 будет поддерживать население 50000 взрослых от L1 личинки этапе до первого дня взрослой жизни. Поэтому для проведения эксперимента с 500 000 взрослых необходимы 13 высоковозрастных пластин: одна пластина для генерации популяции L1s, две пластины для генерации взрослых для отбеливания, и 10 пластин для роста экспериментальных животных. Эти показатели зависят от условий посева и роста бактерий высокорастущих пластин. Поэтому рекомендуется сделать все пластины стандартизированным способом, а затем откалибровать с известным количеством животных.
Черви учитываются на двух этапах в процессе культивирования: 1) до посева червей на тарелках и 2) перед генерацией условных носителей. Плотность культивирования животных, как было показано, влияет на поведение, развитие и стресс ответы15,16,17,18 и, следовательно, может также влиять на ГРУЗы EV. Поэтому для последовательной плотности культивирования необходимо точно оценить популяции червей. Количества червей в девяти каплях дает статистическую достоверность демографических оценок. Важно лечить каждую каплю индивидуально, вихрь между каждой каплей и вставки пипетки на том же расстоянии в подвеску червя. Принятие этих мер предосторожности обеспечит значение S.E.M. в размере 5–10% от общей численности населения. Если S.E.M. для популяции червей выше 20%, то что-то пошло не так.
После 24 ч без бактерий инкубационный период, молодые, дикие типа C. elegans ползать сразу после добавления к бактериальной лужайке. Это свидетельствует о том, что инкубация не оказывает серьезного влияния на их здоровье. Однако этот шаг влияет на физиологию животных и, следовательно, может влиять на состав грузов EV. Поэтому при работе с очень больными генотипами или пожилыми животными необходимо проверить жизнеспособность после инкубационного шага. Если все животные не выживают в инкубации, то увеличьте экспериментальный размер популяции и уменьшите время инкубации. При работе с большими объемами кондиционированных носителей, это более практично использовать перемешивают ячейки концентратор с фильтром из регенерированной нитроцеллюлозы. EVs не связываются с этим фильтром химии так сильно, как другие типы фильтров14.
Соотношение общего белка, извлеченного из условных носителей, к количеству инкубированных животных, чтобы сделать препарат, является полезной метрикой. Если это соотношение намного выше, чем ожидалось, то вполне возможно, что оценки популяции были выключены или что животные умерли и ухудшились в условных носителях. Если это соотношение намного ниже, чем ожидалось, то некоторые белки, возможно, были потеряны на фильтры во время процесса концентрации. Хотя методы FACS будут непосредственно количественно EVs в подготовке, эта метрика полезна, потому что она может выделить образцы аномалий в начале процесса. Еще одним полезным методом проверки качества препарата EV является электронная микроскопия передачи, как показано на рисунке 4D. Хотя протокол для передачи электронной микроскопии официально не включен в эту статью метода из-за длины, он может быть проведен стандартными методами. Рекомендуется проводить этот тип анализа, по крайней мере на начальном этапе, в качестве бесплатного метода для FACS для оценки качества препаратов EV. Для достижения наилучших результатов используйте свежеразряженный формвар-углеродные сетки и запятнайте образцы 2% фосхотунгстовой кислотой вместо ацетата уранила.
DI-8-ANEPPS был выбран потому, что было показано, количественно этикетки EV мембраны, превосходя другие общие красители EV с образцами биопсии человека и липосомы25. Измерения быстрые, принимая только 3 минуты времени сбора для каждого образца. Количественная оценка чувствительных к моющим средствам Овов имеет прямое функциональное значение, поскольку она основывается на фундаментальном физическом различии между ЭВ и твердыми агрегатами липопротеинов. Важно отметить, что этот метод не зависит от количества общего белка или количества не-EV агрегатов и, следовательно, может количественно EVs, полученных с помощью различных методов очистки в беспристрастным образом. ПРОВЕРЕНная FACS метрика EV, которую мы описываем здесь, будет особенно полезна для исследований, демонстрирующие физиологическое воздействие очищенных ЭВ. Это может также принести пользу области EV в целом, чтобы установить методологию FACS в качестве универсальной метрики, с тем чтобы абсолютное изобилие EV может быть непосредственно по сравнению между исследованиями. Vital красители также могут маркировать C. elegans EVs, но они не так ярки, как EVs помечены Di-8-ANEPPS.
Этот подход к очищению капитализируется на активной секреции ЭВ за пределами тел нетронутых, живых червей. Это позволяет C. elegans EVs быть изолированы на сопоставимой чистоты и изобилия, как от клеточной культуры, спецификации, которые являются достаточными для выявления сотен белков и РНК грузов через LC-MS-MS и RNAseq анализа26. Таким образом, большая библиотека реагентов, доступных для исследования C. elegans, может быть использована для исследования влияния генетического и физиологического возмущения на состав груза EV.

Секреция мембранных внеклеточных пузырьков (ЭВ) облегчает глобальные физиологические процессы, активно транспортируя специфический белок, нуклеиновой кислоты, метаболит и липидные грузы между клетками1. Клетки выделяют EVs, которые охватывают континуум размеров в диапазоне от 2 мкм или больше до 20 нм2. Небольшие ЭВ (ЗЛТ;200 нм) все чаще изучаются из-за их причастности к патологическим процессам, включая нарушения обмена веществ, рак, сердечно-сосудистые заболевания и нейродегенеративные заболевания53,,4. Эти патологии также были показаны, чтобы влиять на белок и генетический состав EVs грузов малых EVs. Таким образом, биомаркеры подписи патологии все чаще обнаруживаются с помощью методов обнаружения груза EV, таких как LC-MS-MS и RNAseq6,,77,8,9.
C. elegans был полезной моделью беспозвоночных для выявления эволюционно сохраненных путей сигнализации EV. Например, C. elegans flippase было впервые показано, чтобы вызвать EV биогенеза в C. elegans эмбрионов, и человека гомолог было показано, влиять на выброс EV в клетках человека10,11. C. elegans EVs, как сообщается, несут сигналы Ежика, необходимые для развития кутикулы. Доставка Ежик и другие морфогены было показано, играют важную роль в развитии EVs, и он сохраняется в зебры, мышей и людей12,13,14,15. C. elegans хорошо подходит для открытия биомаркера EV, потому что он выделяет ЭВ вне его тела, которые функционируют в связи между животными16,,17 (Рисунок 1А). Тем не менее, методология, созданная в рамках предыдущего исследования не могут быть использованы, потому что нематод E. coli источник пищи также выделяет EVs18. В этом методе большая часть выборки состоит из загрязнения кишечной палочкой, что ограничивает мощность протеомных или РНК-асекных подходов к обнаружению грузов C. elegans EV. Методы, описанные здесь, были разработаны, чтобы дать очень чистые C. elegans EVs на уровнях изобилия, характерных для типичных экспериментов клеточной культуры и тем самым облегчить подходы омики для открытия биомаркера EV.
Большие популяции червей необходимы для создания достаточного количества ЭВ для анализа грузов. Поэтому в него включены также методы проведения количественного выращивания больших популяций синхронизированных с развитием C. elegans. Как правило, когда большое количество червей необходимо для экспериментов, они культивируются в жидком носителе. Хотя это эффективно для генерации больших популяций червей, физиология животных значительно отличается от червей, культивируемых в стандартных условиях на нематод ныхлабельных пластинах роста (NGM). Звери, культивируемые в жидкости, растут медленнее, тоньше, проявляют неоднородность развития и подвергаются высокой степени изменчивости партии. Поэтому мы представляем простое, но эффективное средство количественного выращивания больших популяций, синхронизированных с развитием C. elegans с использованием 10 см высокорастущих пластин. Медиа-состав высокорастущих пластин включает в себя больше пептона, чем обычные пластины NGM и посеяны с штаммом кишечной палочки NA22, который растет более надежно, чем OP50.
Достижения в технологии цитометрии потока (FACS) позволили прямой анализ отдельных EVs20,21, что позволяет количественной оценки EVs без присущих ограничений в других методах. Предыдущая работа показала, что белок не является полезным прокси для изобилия EV, потому что различные методы очистки приводят к значительно различным соотношениям EV-к-белка22. Чрезвычайно чистые фракции EV содержат относительно мало белка, что затрудняет количественную оценку образцов с гелями BCA или Coomassie. Западный анализ может определить относительные различия отдельных белков, но не может определить, сколько ЭВ в выборке. Надежная количества EV с помощью анализа отслеживания наночастиц затрудняется его узким диапазоном сигнала к шуму, неспособностью дифференцировать между ЭВ и твердыми агрегатами, а также отсутствием переносимости методов между приборами с различными спецификациями23. Таким образом, эта статья также содержит обобщенный циклометрический поток процедуры для дискриминации и количественной оценки EVs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:791px;" width="791">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">0.22 filters units</td>
			<td style="width:107px;">Genesee</td>
			<td style="width:115px;">25-233</td>
			<td style="width:327px;">For clairifying the conditioned media from debris</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">1% solution of Triton X-100</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">HFH10</td>
			<td>Add this to 0.05 % to lyse EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">10 cm high growth plates</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">N/A</td>
			<td>For cultivating large populations of worms</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">2-liter bottom baffled flasks</td>
			<td style="width:107px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">4110-2000PK</td>
			<td>For conducting size exclusion separation of EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">40 &#956;m mesh</td>
			<td style="width:107px;">Amazon</td>
			<td style="width:115px;">CMY-0040-C/5PK-05</td>
			<td>Use this to separate adult worms from larval stages</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">5 &#956;m mesh</td>
			<td style="width:107px;">Amazon</td>
			<td style="width:115px;">CMN-0005-C</td>
			<td>Use this to separate L1s from other worm stages</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">6 cm normal growth medium worm cultivation plate</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">N/A</td>
			<td>For cultivating small populations of worms</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">C7715</td>
			<td>For concentrating the size exclusion elute</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">C78144</td>
			<td>For concentrating the conditioned media</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Apogee A50 flow cytometer</td>
			<td style="width:107px;">Apogee</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">ApogeeMix</td>
			<td style="width:107px;">Apogee</td>
			<td style="width:115px;">1493</td>
			<td>Assess light scatter and fluorescence performance of FACS</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">DI-8-ANEPPS</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3167</td>
			<td>Add this at 20 uM to label EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Disposable chromatography Column</td>
			<td style="width:107px;">BioRad</td>
			<td style="width:115px;">7321010</td>
			<td>For conducting size exclusion separation of EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Geletin</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">G9391-100G</td>
			<td>To treat pipette tips so that worms do not stick</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">HALT protease inhibitor</td>
			<td style="width:107px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:115px;">87785</td>
			<td>Add to EV sample to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;">Low-protein binding collection tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>90410</td>
			<td>Use these for EV samples</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">NaCl</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td>S7653-1KG</td>
			<td>For sucrose floatation of worms</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">S Basal buffer</td>
			<td style="width:107px;">N/A</td>
			<td style="width:115px;">N/A</td>
			<td>Recipe in WormBook</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Sepharose CL-2B resin</td>
			<td style="width:107px;">MilliporeSigma</td>
			<td style="width:115px;">CL2B300-100ML</td>
			<td>For conducting size exclusion separation of EVs</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Small orbital shaker</td>
			<td style="width:107px;">ABC Scientific</td>
			<td>83211301</td>
			<td>Use this for worm S Basal incubation</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:31px;width:243px;">Sucrose</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td>For sucrose floatation of worms</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

purification and analysis of caenorhabditis elegans extracellular vesicles

Секреция небольших мембранных пузырьков во внешнюю среду является фундаментальным физиологическим процессом всех клеток. Эти внеклеточные пузырьки (EVs) функционируют вне клетки для регулирования глобальных физиологических процессов путем передачи белков, нуклеиновых кислот, метаболитов и липидов между тканями. Экв отражает физиологическое состояние их клеток происхождения. EVs причастны к тому, что они играют основополагающую роль практически во всех аспектах здоровья человека. Таким образом, EV белка и генетических грузов все чаще анализируются для биомаркеров здоровья и болезней. Тем не менее, поле EV по-прежнему не имеет уступчивой модели системы беспозвоночных, которая позволяет изучать состав груза EV. C. elegans хорошо подходит для исследования EV, потому что он активно выделяет EVs за пределами своего тела в его внешней среде, что позволяет легкой изоляции. Эта статья предоставляет всю необходимую информацию для генерации, очистки и количественной оценки этих экологически выделяется C. elegans EVs в том числе, как работать количественно с очень большими популяциями возрастных синхронизированных червей, очистка EVs, и цикл цитометрии протокол, который непосредственно измеряет количество нетронутых EVs в очищенной образце. Таким образом, большая библиотека генетических реагентов, доступных для исследования C. elegans, может быть использована для исследования влияния генетических путей и физиологических процессов на состав груза EV.

Watch this Scientific Journal Video about Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles at JoVE.com

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

В этой статье представлены методы генерации, очистки и количественной оценки Caenorhabditis elegans внеклеточных пузырьков.

Очищение и анализ Caenorhabditis elegans Внеклеточные Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Внеклеточное поле пузырьков не имеет генетически уровертной беспозвоночных модели для изучения белковых и РНК-сигналов внеклеточных пузырьков. Этот протокол устанавливает методы для получения обильных, чистых внеклеточных пузырьков от C.elegans. Этого достаточно для надежного РНК-СЭЗ и протеомного анализа.Когда синхронизированная культура C.elegans исчерпали пищу от их нормального роста средней пластины, использовать резинки для обеспечения пятиметровой нейлоновой сетки фильтр крышка на стерильную бутылку и начать вакуум. Налейте червей L1 на фильтр и передать равный объем среды над червя агрегатов. После вихря перенесите три 10 микролитровых тома подвески червя на крышку пластины выращивания червей и подсчитайте количество животных в каждой капле.Отрегулируйте подвеску червя до двух животных на микролитер свежей среды и снова вихрем подвески. Затем добавьте девять, 10 капель микролитров червей на новую крышку пластины и вручную подсчитайте количество животных в каждой капле. Затем вычислите среднее и стандартное погрешность среднего в процентах от каждой популяции червей и вычислите общее количество животных в каждой популяции.Чтобы подготовить червей для генерации секретом, мыть червей с тремя пять минут моет в 15 миллилитров стерильных M9 среды с 50 микрограммов на миллилитр карбенициллина на тарелку на стирку с нежным закрученного выбить червей, объединение моет в 50 миллилитров конической трубки. После последней стирки разбавьте червей до одного животного на микролитр раствора S-Basel, дополненного 2,5 микрограммами на миллилитр холестерина и 50 микромолярной концентрацией карбенициллина. Затем добавьте до 400 миллилитров подвески червя в стерильную двухлитровую нижнюю сбитую с толку колбу.Поместите колбу на круговой ротатор при 20 градусах Цельсия и 100 вращениях в минуту в течение 24 часов. Для экстраклеточного сбора пузырьков, передача червей в 50 миллилитров конической трубки для центрифугации и декантировать супернатант через 0,22 микрометровый вакуумный фильтр для удаления любых твердых частиц мусора. После подсчета, поместите каплю подвесных червей на бактериальный газон и оценка животных, как движущиеся, парализованные, или мертвые через 15 минут.Затем сконцентрировать фильтрованный супернатант до 700 микролитров с регенерируемой нитроцеллюлозой 10 килодалтонный молекулярный фильтр отсечения веса и добавить 150 микролитров свежего раствора S-Basel для сокращения. Фильтр и вихрь в результате решения и повторить сокращение и фильтрацию еще в два раза, как только что продемонстрировали. После последней фильтрации, центрифуга супернатант для удаления любых частиц и мусора, которые, возможно, накопились во время обработки и добавить ингибитор протеазы коктейль плюс EDTA в соответствии с инструкциями производителя.Чтобы подготовить столбец исключения размера, декант 15 миллилитров подвесной смолы агарозы в пустой картридж колонки гравитационного потока. Когда столбец осушется, добавьте раствор S-Basel до тех пор, пока смоляная кровать не будет упакована при окончательном объеме в 10 миллилитров. Замените буфер смолы 40 миллилитров стерильного фильтрованного раствора S-Basel, заботясь о том, чтобы не беспокоить смолу, и дайте гравитации слить буфер через колонну.После того, как верхняя часть смолы больше не погружается, крышка нижней части картриджа, чтобы остановить поток и место сбора трубки под колонкой. Чтобы инициировать фракциацию секретома, снимите крышку и сразу же добавьте концентрированный секретом раствор дроп-мудрый в верхней части колонны кровать, а затем добавление одного миллилитра S-Basel решение падение мудрым. Поместите под колонку свежую коллекторную трубку и медленно заполните верхний столб резервуар пятью миллилитров раствора S-Basel.После сбора первых двух миллилитров элуата, быстро изменить трубки, чтобы собрать следующие четыре миллилитров. Используйте регенерированную нитроцеллюлозу 10 килодальтонового молекулярного фильтра для отсечения спинового фильтра, чтобы сконцентрировать внеклеточное везикулу, содержащую колонку, до 300 микролитров и перенести ретентат фильтра в низкообязательное микроцентрифугное трубку. Затем промыть фильтровальную мембрану два раза с помощью 100 микролитров раствора S-Basel при 20 секундах вихря на стирку и объединить промывки с оригинальным ретентатом для окончательного объема образца в 500 микролитров.Для подготовки внеклеточных пузырьков для количественной оценки с помощью цитометрического анализа потока добавьте 840 микролитров раствора S-Basel и 60 микролитров очищенных внеклеточных пузырьков в микроцентрифугную трубку. Добавьте 300 микролитров образца в две дополнительные микроцентрифуговые трубки вместе с семью микролитров соответствующего потентиометрического зонда на трубку. Добавьте семь микролитров 1%Triton X-100 в последнюю трубку и смешайте все трубки вихрем.Поместите наконечник sonicator в центре трубки третьего образца и пульс образца 10 раз на 20% мощности и 30% цикла службы. Далее добавьте 300 микролитров раствора S-Basel в две контрольные микроцентрифуговые трубки и добавьте семь микролитров зонда в единственную трубку красителя. Этикетка второй трубки буфера только.Затем инкубировать все трубки в течение одного часа при комнатной температуре защищены от света до их анализа поток цитометрии в соответствии со стандартными протоколами. Для анализа данных откройте файлы в соответствующем программном обеспечении цитометрического анализа потока. Установите прямоугольные ворота, начиная с верхней части участка, охватывающего от небольшого угла света рассеяния уровне в один раз от 10 до двух до одного раза 10 до четырех и чего ворота вниз, пока он не содержит около 2,5% от общего числа событий.Назовите ворота после зонда и скопировать и вставить ворота на два других образца и контролировать участки данных. Затем экспорт анализа в электронную таблицу. Здесь показаны репрезентативные результаты 10 биологических репликаций.Вариативность между репликациями не является значительным и типичная стандартная погрешность среднего размера популяции составляет чуть более 10%Передача животных между пластинами приводит к примерно 10%потере животных, в то время как около 20% животных теряются в этапе флотации сахарозы. В среднем, 1000 молодых взрослых животных дикого типа будут выделяет один микрограмм белков размером более 10 килодалтонов в окружающую среду. Когда эта фракция дополнительно отделяется от размера исключение хроматографии, общий профиль элюции белка демонстрирует небольшой пик белка между двумя-шестью миллилитров и большой пик после восьми миллилитров.Внеклеточные пузырьки содержатся в первых пяти миллилитров колонки eluate. В прямом сравнении характеристик цитометрии потока между C.elegans и человеческими внеклеточными пузырьками, гистограмма внеклеточных событий образца пузырьков C.elegans, отсортированная по небольшому рассеянию углового света, показывает, что все препараты пик при среднем интенсивности флуоресценции примерно один раз от 10 до трети. Потенциметрический зонд DI-8-ANEPPS, надежно маркирует внеклеточные пузырьки C.elegans и обилие очищенных внеклеточных пузырьков, отсортированных по выражению DI-8-ANEPPS, не сильно отличается между C.elegans и клеточной культурой производных препаратов.Образцы, подготовленные этой процедурой, подлефтяются для всех типичных методов внеклеточного анализа пузырьков ниже по течению, включая РНК-СЭЗ, цитометрию потока, анализ слежения за наночастицами и протеомный анализ. Создание методов очистки внеклеточных пузырьков C.elegans позволяет исследователям использовать эту простую беспозвоночные модели для изучения генетических путей и физиологических процессов, которые влияют на внеклеточный состав груза везикулы.

Research

JoVE Journal

Biology

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Выделение и В пробирке Активация Caenorhabditis Элеганс Сперма

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric выделение внеклеточной жидкости из<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Основной<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; Методы синхронизации и наблюдения

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Добыча простагландинов и анализа в<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Гранулярных анализ внеклеточного Vesicles из клеток кондиционером СМИ потока

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Анализ отслеживания наночастиц для количественной оценки и определения размера внеклеточных везикул

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Автоматизация количественной оценки агрегатов в Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Масштабируемое выделение и очистка внеклеточных везикул от кишечной палочки и других бактерий

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Выделение и характеристика цианобактериальных внеклеточных везикул

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential ...