Name: a delayed inoculation model of chronic pseudomonas aeruginosa wound infection
Uploaded: 2020-02-20T12:30:00
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Le vecteur de construction luminescente pUT-Tn5-EM7-lux-Km1 était un cadeau gracieux de J. Hardy. Des schémas ont été créés avec BioRender.com. Nous remercions le laboratoire de G. Gurtner pour leurs conseils sur le modèle d’infection des plaies. Nous remercions également T. Doyle du Stanford Center for Innovation in In Vivo Imaging pour son expertise technique. Ce travail a été soutenu par des subventions R21AI133370, R21AI133240, R01AI12492093, et des subventions de Stanford SPARK, le Falk Medical Research Trust et la Cystic Fibrosis Foundation (CFF) à P.L.B. C.R.D a été soutenu par T32AI007502. Une bourse d’études supérieures Gabilan Stanford pour les sciences et l’ingénierie et une bourse d’études supérieures interdisciplinaires Lubert Stryer Bio-X Stanford ont soutenu J.M.S.

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Stanford.
1. Préparation et croissance des bactéries
<ol><li>Effectuer tous les travaux avec P. aeruginosa et les animaux avec des précautions BSL-2 selon le comité institutionnel de biosécurité du chercheur et les lignes directrices du comité d’utilisation des animaux. Faites toutes les étapes décrites ici impliquant <e...

<ol>
	<li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+skin+wounds:+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy.">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li><li>Serra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+wound+infections:+the+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus.">Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).</li><li>Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nosocomial+infections+due+to+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa:+epidemiology+and+treatment+options.">Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options.</a> Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).</li><li>Secor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filamentous+Bacteriophage+Produced+by+Pseudomonas+aeruginosa+Alters+the+Inflammatory+Response+and+Promotes+Noninvasive+Infection+In+Vivo.">Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo.</a> Infection and Immunity. 85 (1), (2017).</li><li>Rice, S. 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L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+neutrophil+chemotaxis+and+infiltration+contributes+to+delayed+resolution+of+cutaneous+wound+infection+with+advanced+age.">Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age.</a> Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).</li><li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice.">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li><li>Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide-induced+neutropenia:+effect+on+postischemic+skin-flap+survival.">Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).</li><li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+wound+infection+in+immunocompetent+mice.">The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice.</a> Advances in Wound Care. , (2019).</li><li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+trigger+antiviral+immunity+and+prevent+clearance+of+bacterial+infection.">Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li></ol>

Nous avons développé un nouveau modèle retardé d’infection de blessure de P. aeruginosa d’inoculation. La stratégie de retarder l’inoculation avec des bactéries jusqu’à 24 h après la blessure excisional permet l’évaluation des infections de blessure sur une période d’une semaine. En utilisant une souche luminescente de P. aeruginosa, il est possible de suivre la progression de l’infection tout au long du cours de l’infection. Le cours plus long de l’infection par rapport à d...

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est une bactérie en forme de tige Gram-négative avec une pertinence croissante pour la santé humaine et la maladie. Il est responsable de la morbidité et de la mortalité étendues dans les arrangements nosocomiaux, particulièrement impliquant des infections de blessure dans les patients immunocompromis1,2. L’émergence de souches multirésistantes de cet agent pathogène a donné une impulsion supplémentaire pour l’investigation sur les facteurs contribuant à la virulence de P. aeruginosa, les mécanismes de la résistance aux antibiotiques De P. aeruginosa, et de nouvelles méthodes pour la prévention et le traitement de cette infection mortelle3. En tant que tel, le besoin de modèles animaux de l’infection chronique des plaies comme outils pour étudier ces questions de recherche n’a jamais été aussi grand.
Malheureusement, de nombreux modèles animaux de l’infection à P. aeruginosa ont tendance à simuler une infection aigue avec une résolution rapide de l’infection ou un déclin rapide dû à la septicémie4,5, qui ne simule pas adéquatement la nature souvent chronique de ces infections. Pour remédier à cet inconvénient, certains modèles utilisent l’implantation de corps étrangers tels que les perles d’agar, les implants en silicone, ou les gels d’alginate6,7,8. D’autres modèles utilisent des souris qui sont immunocompromised en raison de l’âge avancé, l’obésité, ou le diabète, ou par des moyens pharmacologiques tels que la neutropénie induite par cyclophophosphamide9,10,11,12. Cependant, l’utilisation de matériaux étrangers ou d’hôtes immunodéprimés modifie probablement le processus inflammatoire local, ce qui rend difficile d’acquérir une compréhension de la physiopathologie impliquée dans les infections chroniques des plaies chez les hôtes avec un système immunitaire autrement normal.
Nous avons développé un modèle chronique de P. aeruginosa infection de blessure chez les souris qui implique l’inoculation retardée avec des bactéries après blessure excisional. L’inoculation retardée permet des expériences évaluant la charge bactérienne s’étendant jusqu’à au moins 7 jours. Ce modèle ouvre de nouvelles possibilités d’étudier à la fois la pathogénie et les nouveaux traitements des infections chroniques de P. aeruginosa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Sodium Chloride injection</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>2484457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G x 1 sterile needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G x 1 1/5 sterile needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swab</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aura Imaging Software</td>
			<td>Spectral Instruments Imaging</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Purdue Frederick Company</td>
			<td>19-065534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine SR LAB</td>
			<td>Zoopharm</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J male mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable biopsy punch, 6mm</td>
			<td>Integra</td>
			<td>33-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors - Tungsten Carbide</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14568-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bead Dry Sterilizer</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>61-0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granulated Agar</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP9744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Milliard</td>
			<td>804879481218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with 28 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lago X Imaging System</td>
			<td>Spectral Instruments Imaging</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP1426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur-Lok 1 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Arco Animal Trimmer</td>
			<td>Wahl Professional</td>
			<td>919152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil</td>
			<td>Church and Dwight</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Available at any pharmacy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octagon Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11041-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Press and Seal Cling Wrap</td>
			<td>Glad</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW</td>
			<td>BD</td>
			<td>305934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus Scout Pro</td>
			<td>SP202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplical Nutritional Supplement</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegaderm, 6 cm x 7 cm</td>
			<td>3M</td>
			<td>1624W</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a delayed inoculation model of chronic pseudomonas aeruginosa wound infection

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) est un agent pathogène nosocomial majeur de plus en plus pertinent pour la santé humaine et la maladie, en particulier dans le cadre d’infections chroniques des plaies chez les patients diabétiques et hospitalisés. Il est urgent de mettre au point des modèles d’infection chronique pour aider à l’étude de la pathogénie des plaies et au développement de nouvelles thérapies contre cet agent pathogène. Ici, nous décrivons un protocole qui emploie l’inoculation retardée 24 heures après la blessure excisional pleine épaisseur. L’infection de la matrice provisoire de blessure présente à ce moment-là prédise le dégagement ou la diffusion rapide de l’infection et établit plutôt l’infection chronique durant 7-10 jours sans avoir besoin d’implantation de matériaux étrangers ou de suppression immunitaire. Ce protocole imite un cours temporel typique de l’infection postopératoire chez l’homme. L’utilisation d’une souche luminescente de P. aeruginosa (PAO1:lux) permet l’évaluation quotidienne quantitative de la charge bactérienne pour des infections de blessure de P. aeruginosa. Ce nouveau modèle peut être un outil utile dans l’étude de la pathogénie bactérienne et le développement de nouvelles thérapies pour les infections chroniques de plaie de P. aeruginosa.

À l’aide d’une souche luminescente de PAO1 avec un plasmide codant le système de journaliste luxABCDE (PAO1:lux), nous avons effectué des blessures excisionales sur des souris, inoculé ces blessures avec p. aeruginosa planctonique 24 h plus tard, et mesuré la charge bactérienne au fil du temps(Figure 1 et Figure 2). Une image représentative obtenue à l’aide d’un système optique d’imagerie démontre que...

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A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

Nous décrivons un protocole retardé d’inoculation pour produire des infections chroniques de blessure dans les souris immunocompétentes.

Un modèle d’inoculation retardée de pseudomonas chronique infection de blessure d’aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

Ce protocole est significatif parce qu’il décrit un modèle pour l’infection chronique de blessure d’aeruginosa de Pseudomonas sans avoir besoin de l’implantation étrangère de matériel ou de la suppression immunisée. Inoculation retardée avec Pseudomonas aeruginosa 24 heures après l’épaisseur complète excisional blessure prosterne le dégagement rapide et la diffusion de la bactérie, établissant une infection qui dure sept à dix jours. Ce modèle unique sera un outil utile pour les études de la pathogénie bactérienne, les interactions avec les pathogènes hôtes, et le développement de nouvelles thérapies pour les infections chroniques des plaies pseudomonas aeruginosa.M’aider dans une démonstration de l’intervention sera Dan Liu, un étudiant en médecine du Laboratoire Bollyky. Avant de commencer la procédure, pesez une souris anesthésiée de huit à 12 semaines pour obtenir un poids de base et placer la souris dans la position couchée. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de la pédale, injectez subcutanément à la souris 250 microlitres de chlorure stérile préchauffé de 0,9 % de sodium sur chaque flanc.Utilisez un rasoir électrique pour enlever les cheveux de la zone dorsale de la souris et appliquer une fine couche de crème depilatory sur la peau exposée. Après 20 à 60 secondes, retirer les cheveux et l’excès de lotion avec de la gaze humidifié dans de l’eau chaude. Pour la chirurgie excisionnelle de blessure de pleine épaisseur, utilisez d’abord une aiguille de calibre 25 pour injecter sous-cutanéement 0,6 à un milligramme par kilogramme de buprénorphine à libération soutenue à la zone mi-dorsale de la souris et essuyer le site chirurgical d’une manière circulaire avec trois bêtadine stériles alternatifs et des écouvillons d’alcool.Placez un drap d’enveloppement en plastique sur le site chirurgical et étirez la peau tendue caudally. Lorsque la peau a séché, utilisez un poinçon stérile de six millimètres de diamètre biopsie de la peau pour faire une incision initiale à travers l’épiderme dorsale gauche, suivie d’une deuxième incision sur l’épiderme dorsale droite. Utilisez des forceps pour tenter la peau à partir du centre de la zone de plaies tracées à gauche et utilisez des ciseaux pour exciser les couches épidermiques et cutanées.Après avoir répété l’incision sur la zone de blessure décrite à droite pour créer des blessures excisionnelles symétriques, laver les deux blessures avec 50 microlitres de solution saline stérile. Lorsque le site chirurgical et la peau environnante ont séché, couvrir les plaies et le dorsum avec un pansement transparent film et placer la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce que la récumbence complète. 24 heures après la chirurgie, peser à nouveau la souris réanthésiée et injecter l’animal sous-cutanée avec 250 microlitres de chlorure stérile préchauffé de 0,9 % de sodium dans les deux flancs.Ensuite, chargez 100 microlitres de la suspension de souche luminescente P.aeruginosa dans une seringue de bouchon de sécurité tuberculine de 500 microlitres équipée d’une aiguille de calibre 27 et injectez 40 microlitres de suspension bactérienne à travers le film transparent qui s’habille dans chaque plaie. Assurez-vous que la suspension bactérienne est bien mélangée et que la vinaigrette transparente est intacte. Assurez-vous de perforer la vinaigrette transparente une seule fois avec la lunette d’aiguille vers le haut.Puis retourner la souris dans sa cage sur une page de chauffage avec surveillance et de fournir une pâte de supplément nutritionnel riche en calories pris en sandwich entre les granulés alimentaires sur le sol de la cage. Plaquez le reste de l’inoculum sur une plaque d’agar LB et comptez les colonies pour confirmer le nombre de bactéries qui ont été administrées. Pour l’imagerie in vivo des plaies infectées, suivez les protocoles de confinement de niveau de biosécurité deux pour le transport des souris vers et depuis l’instrument d’imagerie et placez la souris anesthésiée dans la position couchée dans la chambre d’imagerie.Dans le logiciel d’imagerie, définissez le temps d’exposition, le binning, le f-stop et le champ de vision au besoin pour l’expérience. Ensuite, créez une région d’intérêt sur le site de la plaie et mesurez le flux moyen détecté en photons par seconde. Pour mesurer l’arrière-plan, créez une région d’intérêt sur une zone aléatoire sur la plate-forme d’imagerie et soustrayez le nombre de photons par seconde.À la fin de l’expérience, dans une armoire de biosécurité, utilisez des ciseaux stériles et des forceps pour exciser les lits enroulés et placer chaque lit dans un millilitre de PBS stérile dans un tube de polypropylène de 1,5 millilitre. Hacher le tissu enroulé avec des ciseaux et incuber les morceaux de tissu sur un shaker à quatre degrés Celsius en 300 rotations par minute pendant deux heures. À la fin de l’incubation, vortex chaque tube pendant 10 secondes avant de diluer en série les effluents bactériens dans PBS et de placage des effluents bactériens dilués sur l’agar LB pour quantifier la charge bactérienne.Cette image représentative obtenue à l’aide d’un système optique d’imagerie démontre que ce modèle entraîne une luminescence détectable. Dans cette expérience, l’infection a culminé au jour trois post-inoculation et a persisté sept jours après l’inoculation basée à la fois sur la bioluminescence et le nombre de colonies. La culture des bactéries isolées de la plaie démontre en outre que la colonie quantifiée formant des unités par plaie est corrélée avec la luminescence détectée.Bien qu’il y ait une perte de poids rapide initiale immédiatement après l’injection, les injections salines et la nutrition supplémentaire peuvent restaurer les souris à leur poids initial. La dose calculée d’inoculation dont 50 % des plaies seront gravement infectées a été déterminée à environ 7,7 fois 10 à la deuxième colonie formant des unités par millilitre. Des doses plus élevées qu’une fois de 10 à la quatrième colonie formant des unités par millilitre entraînent un taux d’infection de 100 %.Divers traitements topiques et systémiques peuvent être appliqués après les procédures de blessure et d’inoculation pour étudier de nouvelles thérapies potentielles pour Pseudomonas aeruginosa. Tous les travaux avec Pseudomonas aeruginosa et les souris infectées devraient être menés avec des précautions de sécurité BSL-2 conformément aux directives du comité institutionnel de biosécurité et d’utilisation des animaux du chercheur.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

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